Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN ĐỨC TRANH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN NGUYÊN PHÁT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TRẦN ĐỨC TRANH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH THÁI ĐƠN CỦA GEN ALDH2 TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƢ GAN NGUYÊN PHÁT Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Trần Huy Thịnh PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết khóa luận thực Trung tâm nghiên cứu Gen Protein,Trường Đại học Y Hà Nội chưa đăng tải tạp chí hay công trình khoa học khác Các trích dẫn tài liệu công nhận Hà Nội, ngày 29 tháng 12năm 2016 Học viên Trần Đức Tranh i Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TSHoàng Thị Mỹ Nhung TS Trần Huy Thịnh - người thầy tận tình bảo, hướng dẫn bổ sung kiến thức cần thiết cho suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến GS.TS Tạ Thành Văn - Giám đốc trung tâm Gen Protein, Trưởng môn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội PGS.TS Trần Vân Khánh - Phó giám đốc trung tâm Gen Protein trường Đại học Y Hà Nội, toàn thể thầy cô, anh, chị bạn học viên tạo điều kiện hướng dẫn, giúp đỡ trình học tập kỹ thuật, hoàn thiện quy trình kỹ thuật phân tích kết Trung tâm Xin cám ơn thầy cô môn Sinh học Tế bào, thầy cô khoa Sinh học trường Đại học Khoa học Tự nhiên, tạo điều kiện củng cố thêm nhiều kiến thức cho trình thực hoàn thành luận văn Đồng thời xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè ủng hộ động viên suốt quãng thời gian vừa qua Hà Nội, ngày29 tháng 12 năm 2016 Học viên cao học khóa Trần Đức Tranh ii Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược ung thư gan nguyên phát 1.1.1 Tỷ lệ mắc UTGNP giới Việt Nam 1.1.2 Các yếu tố nguy 1.1.3 Lâm sàng cận lâm sàng UTGNP 1.1.4 Điều trị tiên lượng UTGNP 1.2 Hệ thống enzym ADH ALDH chuyển hóa rượu gan 1.2.1 Hệ thống enzym ADH ALDH 1.2.2 Chuyển hóa rượu gan 11 1.2.3 Chuyển hóa rượu ung thư gan 12 1.3 Sơ lược gen ALDH2 16 1.3.1 Vị trí liên quan 16 1.3.2 Chức gen ALDH2 16 1.3.3 Tính đa hình gen ALDH 17 1.3.4 Gen ALDH2 bệnh ung thư 19 1.4 Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2 20 1.4.1 Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP) 20 1.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn 22 2.1 Đối tượng nghiên cứu 27 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 28 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 28 2.3.2 Cỡ mẫu 28 2.3.3 Cách thức tiến hành 29 iii Footer Page of 126 Header Page of 126 2.3.4 Trang thiết bị hóa chất 31 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 34 2.5 Đạo đức nghiên cứu đề tài 34 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 35 3.1.1 Đặc điểm tuổi 35 3.1.2 Đặc điểm giới 36 3.2 Tỷ lệ kiểu gen alen ALDH2 nhóm nghiên cứu 38 3.2.1 Kết tách chiết DNA 38 3.2.2 Kết khuếch đại vùng gen ALDH2 chứa SNP codon 487 40 3.2.3 Kết kiểu gen alen ALDH2 41 3.3 Mối liên quan gen ALDH2 với số yếu tố nguy khác 47 3.3.1 Gen ALDH2 độ tuổi phát bệnh UTGNP kiểu gen .47 3.3.2 Mối liên quan gen ALDH2 với giới tính nhóm ung thư gan nguyên phát 48 3.3.3 Mối liên quan gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu 49 3.3.4 Mối liên quan gen ALDH2 vớí nhiễm virut HBV 50 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC iv Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mô hình enzym ADH Hình 1.2 Chuyển hóa rượu gan vai trò hình thành ung thư gan 15 Hình 1.3 Vị trí gen ALDH2 16 Hình 1.4 Sơ đồ trình chuyển hóa ethanol gan 18 Hình 1.5 Minh họa tượng đa hình đơn gen (SNP) 22 Hình 1.6 Nguyên lý kỹ thuật PCR 23 Hình 3.1 Điện di DNA tổng số gel agarose 0,8% 39 Hình 3.2 Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP gen ALDH2 nhóm bệnh agarose 1,5% .40 Hình 3.3 Hình ảnh minh hoạ điện di sản phẩm PCR khuếch đại vùng SNP gen ALDH2 nhóm chứng agarose 1,5% 41 Hình 3.4 Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 enzym MboII mẫu đối chứng 42 Hình 3.5 Hình ảnh cắt đoạn gen SNP codon 487 gen ALDH2 enzym MboII mẫu bệnh nhân UTGNP 43 v Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các isoenzym ADH người Bảng 1.2 Vị trí cắt số enzym giới hạn 24 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi nhóm nghiên cứu 35 Bảng 3.2 Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu 36 Bảng 3.3 So sánh giới bệnh nhân UTGNP với nghiên cứu giới Việt Nam 37 Bảng 3.4 Đặc điểm mắc viêm gan B uống rượu nhóm UTGNP 37 Bảng 3.5 Một số kết đo nồng độ độ tinh DNA 39 Bảng 3.6 Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 alen nhóm 44 Bảng 3.7 Tỷ lệ kiểu gen, alen ALDH2 nhóm nguy mắc UTGNP 45 Bảng 3.8 Tỷ lệ kiểu gen ALDH2 kết hợp nhóm nguy mắc UTGNP 46 Bảng 3.9 Trung vịtuổi phát bệnh kiểu gen ALDH2 47 Bảng 3.10 Gen ALDH2 giới nhóm bệnh 48 Bảng 3.11 Gen ALDH2 với tình trạng sử dụng rượu 49 Bảng 3.12 Gen ALDH2 với tình trạng nhiễm virus viêm gan B 50 vi Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADH : Alcohol Dehydrogenase ADH1A, ADH1B, ADH1C: Alcohol Dehydrogenase 1A,1B, 1C ALDH : Aldehyde Dehydrogenase AA : acetaldehyde bp : base pair (cặp ba-zơ) CI : Confidence Interval (Độ tin cậy) Nu : Nucleotide (hoặc Deoxyribonucleotide) A : Deoxyadenosine triphosphate T : Thymidine triphosphate G : Deoxyguanosine triphosphate C : Deoxycytidine triphosphate OD : Optical Density (Độ hấp thụ quang) OR : Odds ratio (Tỷ suất chênh = tỷ số nguy mắc bệnh không mắc bệnh) PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuyếch đại gene) RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism (Hiệntượng đa hình chiều dài đoạn DNA cắt enzyme giới hạn) ROS : Radioactive Oxygen Species (gốc tự doôxy hóa) SNP : Single Nucleotide Polymorphism (Hiện tượng đa hình đơn Nucleotide) UTBMTBG : Ung thư biểu mô tế bào gan UTGNP : Ung thư gan nguyên phát vii Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Bảng viết tắt acid amin: Ala Alanine Gly Glycine Pro Proline Arg Arginine His Histidine Ser Serine Asn Asparagine Ile Isoleucine Thr Threonine Asp Aspartic acid Leu Leucine Trp Tryptophan Cys Cysteine Lys Lysine Tyr Tyrosine Gln Glutamine Met Methionine Val Valine Glu Glutamic acid Phe Phenylalanine viii Footer Page 10 of 126 Header Page 29 of 126 Sự đa hình thái gen mã hóa cho enzym ALDH2 làmcho enzym có hoạt tính thay đổi Alen ALDH2*1 mã hoá enzyme có khả oxy hóa acetaldehyd alen ALDH2*2 mã hoá enzyme gần hoạt tính Trong quần thể hay nhiều quần thể khác nhau, tốc độ chuyển hóa rượu cá thể khác tùy thuộc cá thể mang kiểu gen alen ALDH2 [9] Vì vậy, bên cạnh rượu có ảnh hưởng gián tiếp đến tổn thương tế bào mô quan thể yếu tố di truyền yếu tố nguy quan trọng việc hình thành phát triển ung thư 1.3.4 Gen ALDH2 bệnh ung thư Nhiều nghiên cứu chứng minh tác động đa hình thái genALDH2 lượng rượu tiêu thụ bệnh nhân có nguy gây số loại ung thư - Gen ALDH2 ung thư đại trực tràng(UTĐTT) Hua Zhao cộng (2014) công bố nghiên cứu phân tích tổng hợp nhiều nghiên cứu khác để tìm mối liên quan đa hình thái Glu487Lys gen ALDH2 với nguy UTĐTT [72] Kết phân tích 11 nghiên cứu bệnh-chứng 2909 bệnh nhân 4093 người thuộc nhóm chứng cho thấy người có chứa alen ALDH2*2có nguy UTĐTT thấp - Gen ALDH2 ung thư thực quản Tác giả Ming Wu cộng (2013) so sánh yếu tố nguy ung thư thực quản liên quan đến mức độ tiêu thụ rượu người mang kiểu gen ALDH2*1/*1 với người mang kiểu gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 đồng hợp tử ALDH2*2/*2 Kết nghiên cứu 858 bệnh nhân ung thư thực quản nhóm chứng 1081 người Trung Quốc cho thấy người uống rượu trung bình nhiều mang gen dị hợp tử ALDH2*1/*2 có nguy mắc ung thư thực quản cao (OR=2,34, 95% CI: 1,52-3,61) so với nhóm người không uống rượu có gen đồng hợp tử ALDH2*1/*1[67] 19 Footer Page 29 of 126 Header Page 30 of 126 1.4 Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2 1.4.1 Hiện tượng đa hình đơn nucleotide (SNP) Hiện tượng SNP hay tượng đa hình đơn Nucleotide khác trình tự DNA Nucleotide đơn A, C, T hay G chuỗi ADNtương ứng (Hình 1.5) cá thể loài hay cặp NST cá thể.Bộ gen người có 23 cặp NST, có 22 cặp NST thường cặp NST giới tính chứa khoảng 3,2 tỷ bp Kết dự án giải trình tự gen người cho thấy trình tự nucleotid giống đến 99,9% cá thể khác 0,1% lại biểu đa hình đơn Chính khác quy định đặc điểm riêng cá thể, liên quan tính cách, nguy mắc bệnh đáp ứng với điều trị SNP tượng phổ biến theo ngân hàng liệu NCBI tính đến tháng 26/6/2012 có 53 triệu SNPs người, xảy tần số cao từ 1/1000 bp đến 1/100-300 bp SNP coi hậu đột biến điểm thay cặp Nucleotide SNP xảy vùng mã hóa vùng không mã hóa gen Các SNP vùng mã hoá gen làm thay đổi không làm thay đổi trình tự acid amin cấu trúc phân tử protein mà tạo Hầu hết SNP xảy vùng không mã hóa không làm thay đổi cấu trúc gen, nhiên SNP nằm vùng điều hoà gen, làm thay đổi mức độ chép gen hay ảnh hưởng đến trình hoàn thiện RNA thông tin Dựa vào trình tự acid amin của phân tử protein gen tổng hợp chia làm loại - Biến đổi im lặng biến đổi không làm thay đổi sản phẩm gen, ví dụ ba mã hóa GAC GAG mã hóa cho acid amin leucine, không thay đổi cấu trúc phân tử protein - Biến đổi sai nghĩa biến đổi làm thay đổi trình tự chuỗi polynucleotide ARN, làm thay đổi trình tự chuỗi acid amin phân tử 20 Footer Page 30 of 126 Header Page 31 of 126 protein Thông thường biến đổi dạng làm thay acid amin acid amin khác Những đột biến dẫn tới thay đổi chức gen Các dạng biến đổi xảy ba mã hoá vị trí cắt, ghép nối extron intron Ngoài ra, SNP vùng mã hóa, làm thayđổi cấu trúc phân tử protein nhiều mức độ khác Ví dụ SNP làm cho mã GAU thành GAG thay đổi acid amin từ aspartic thành glutamic, hai acid amin có tính chất hóa học giống Nếu SNP làm thay đổi phần protein quan trọng với chức nó, kết hoàn toàn vô hại Trong điều kiện bình thường thay đổi SNP tiềm ẩn, tiếp xúc với tác nhân có hại môi trường chất gây ung thư, hóa chất…thì chúng hoạt hóa biểu bệnh Như khác biệt trình tự DNA người ảnh hưởng đến phát triển bệnh tật, đáp ứng với tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, vacxin tác nhân khác Do đó, ứng dụng lớn SNP nghiên cứu y sinh học so sánh vùng gen nhóm đối tượng khác (nhóm người không bị bệnh nhóm người bị bệnh) để từ tìm mối liên quan SNP với bệnh, từ tìm yếu tố nguy hình thành tiến triển bệnh SNP mối liên quan đến ung thư Hiện nhà khoa học cố gắng xác định SNP khác gen người, thiết lập hồ sơ SNP cho cá thể xếp chúng theo nhóm (SNP profiles) SNP profiles giúp xác định gen ung thư, xác định yếu tố nguy có liên quan đến ung thư quần thể lớn 21 Footer Page 31 of 126 Header Page 32 of 126 Hình 1.5 Minh họa tƣợng đa hình đơn nucleotide(SNP) Nguồn SNP - Google Search.htm 1.4.2 Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định đa hình đơn nucleotide: 1.4.2.1 Kỹ thuật PCR Nguyên tắc phản ứng PCR dựa vào hoạt tính DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch DNA từ mạch DNA khuôn, với nguyên liệu bốn loại nucleotide tự Phản ứng đòi hỏi có mặt mồi xuôi mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu trình tự DNA khuôn Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm ba bước sau: - Bước 1: giai đoạn biến tính (denaturation) Trong dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử DNA biến tính nhiệt độ cao Tm (nhiệt độ nóng chảy) phân tử, thường 94 oC - 95oC vòng 30 giây - phút - Bước 2: giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ hạ thấp cho phép mồi bắt cặp với khuôn, dao động khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 giây - phút - Bước 3: giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ tăng lên 72oC DNA polymerase polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác trình tổng hợp tốt Thời gian phụ thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuyếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút 22 Footer Page 32 of 126 Header Page 33 of 126 Sau chu kỳ chuỗi đôi DNA tạo thành tiếp tục dùng để làm khuôn mẫu để tổng hợp đoạn DNA chu kỳ Sản phẩm cuối phản ứng PCR đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài xác định khoảng cách hai đoạn gen mồi, hai đầu tận sản phẩm xác định đầu tận 5’ hai đoạn gen mồi[8] Bƣớc 1: biến tính Bƣớc 2: bắt cặp Bƣớc 3: tổng hợp Gen cầnkhuếch đại DNA 2chu kỳ Phản ứng khuếch đại chukỳ chukỳ 35 chu kỳ mẫu 36 sao 16 32 Hình 1.6 Nguyên lý kỹ thuật PCR 23 Footer Page 33 of 126 = 68 tỷ Header Page 34 of 126 1.4.2.2 Kỹ thuật PCR-RFLP - Nguyên lý: PCR-RFLP kỹ thuật dựa sở khuyếch đại có chọn lọc đoạn DNA kỹ thuật PCR Sau tiến hành phân cắt đoạn DNA enzym cắt thích hợp Các băng DNA sau chạy điện di nhuộm ethidium bromide cho ta biết tính đa hình thái đoạn DNA cần phân tích [11] - Enzym cắt giới hạn: Enzym cắt giới hạn hay gọi enzym hạn chế, enzym cắt enzym nhóm quan trọng enzym endonuclease, enzym cắt DNA vị trí xác định dựa nhận biết đoạn trình tự đặc hiệu với enzym thành đoạn DNA có kích thước khác Enzym cắt giới hạn dùng để xác định alen liên quan đến SNP thay đổi nucleotid SNP làm thay đổi đoạn trình tự đặc hiệu nhận biết enzym cắt giới hạn đoạn DNA Bảng 1.2 Vị trí cắt số enzym giới hạn Tên enzym Nguồn vi khuẩn Trình tự nhận biết EcoRI Eschericia coli RY13 5'-G↓AATTC-3' EcoRII Eschericia coli R245 5'-↓CCTGG-3' BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 5'-G↓GATCC-3' SmaI Serratia marcesclens Sb 5'-CCC↓GGG-3' ApaI Acetobacter pasteurianus 5'-GGGCC↓C-3' SspI * Sphaerotilus natans 5'-AAT↓ATT-3' Các enzym giới hạn có đặc điểm sau: - Đều chiết tách từ vi khuẩn, tên enzym giới hạn mang tên viết tắt vi khuẩn 24 Footer Page 34 of 126 Header Page 35 of 126 - Cắt phân tử DNA xoắn kép trình tự base đặc hiệu (hay gọi vị trí giới hạn) cho loại enzym - Vị trí cắt thường có 4-8 Nu, đặc trưng quan trọng trình tự giới hạn đoạn DNA gồm 4-8 cặp Nu có trình tự giống đọc theo chiều 3-5 5-3 Vì vậy, vị trí cắt enzym giống mạch - Sau bị cắt, DNA có đầu kết dính sợi đơn Cùng bị cắt với loại enzym giới hạn, phân tử DNA có đầu kết dính với Nu bổ sung cho Ưu điểm kỹ thuật PCR-RFLP:rẻ tiền, không đòi hỏi máy móc đại Kỹ thuật đơn giản, dễ dàng áp dụng vào nhiều nghiên cứu, phân tích chủ yếu đa hình đơn nucleotide Nhược điểm: Một vài enzym cắt giới hạn có giá đắt, khó khăn việc thiết kế mồi đặc hiệu, enzym cắt thích hợp để thu sản phẩm có kích thước khác giúp cho việc nhận định phân tích kết Quy trình làm thủ công nên nhiều thời gian Hạn chế thấy rõ khó xác định kiểu gen có nhiều SNPs khác đoạn gen đòi hỏi nhiều cặp mồi enzym cắt khác Hơn nữa, kiểu gen alen bị nhận định sai enzym cắt sản phẩm gen khuyếch đại không hoàn toàn [11] 1.4.2.3 Kỹ thuật giải trình tự gen Hiện nay, người ta sử dụng máy giải trình tự gen tự động hoàn toàn thiết kế nguyên tắc Sanger Với máy hệ sau này, người ta dùng màu huỳnh quang khác để đánh dấu loại ddNTP Nhờ phản ứng giải trình tự thực ống nghiệm cần điện di hàng mà hàng khác trước đây, hệ thống điện di thường điện di mao quản Mỗi có vạch điện di qua, phân tử ddNTP cuối đầu 3’ đoạn DNA phát màu huỳnh quang tương ứng, máy ghi nhận màu sắc chuyển máy tính phân tích Dựa vào màu huỳnh quang mà máy nhận diện nucleotid nào, từ biết trình tự DNA đích 25 Footer Page 35 of 126 Header Page 36 of 126 Phương pháp giải trình tự gen cho phép phát tất đột biến, đặc biệt đột biến điểm, kỹ thuật áp dụng cho việc phát số SNP vị trí cắt enzym giới hạn gen, đồng thời sử dụng phương pháp đối chứng để kiểm tra độ xác, độ đặc hiệu phương pháp PCR-RFLP [47], [31], [50] 26 Footer Page 36 of 126 Header Page 37 of 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Hứa thị Ngọc Hà., Lê Minh Huy., Nguyễn Sào Trung (2010), "Đặc điểm giải phẫu bệnh carcinôm tế bào gan", Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh,14(4), pp 160-165 Lê Minh Huy., Hứa thị Ngọc Hà., Nguyễn Sào Trung (2010), "Đặc điểm giải phẫu bệnh carcinôm tế bào gan", Y học TP Hồ Chí Minh,14(4), pp 160 – 165 Trần Văn Huy (2003), Nghiên cứu dấu ấn virus viêm gan B, C đặc điểm cận lâm sàng ung thư biểu mô tế bào gan, Luận án Tiến sĩ, Đại học Huế, Huế Đào Văn Long (2012), "Ung thư biểu mô tế bào gan", Bài giảng nội khoa tập II, Nhà xuất Y học, Hà Nội Hà Văn Mạo., Hoàng Kỷ., Phạm Hoàng Phiệt (2006), Ung thư gan nguyên phát, Nhà xuất y học, Hà Nội Nguyễn Cường Thịnh., Lê Văn Thành (2009), "Phẫu thuật cắt gan điều trị ung thư tế bào gan", Tạp chí Y học TP.HCM,13(6), pp 547-555 Nguyễn Sào Trung., Nguyễn Quang Tuấn., Nguyễn Văn Thắng (2004), "Ung thư gan nguyên phát: Đặcđiểm giải phẫu bệnh-lâm sàng", Tạp chí Y học TP.HCM, (8), pp Tạ Thành Văn (2010), PCR số kỹ thuật y sinh học phân tử, Nhà xuất y học, Hà Nội Tiếng anh Vijay A.R (2013), Genetics of Alcohol Metabolism, Springer New York 10 Eddie K Abdalla., Emile Brihi., Hady Ghanem (2015), "Liver", UICC Manual of Clinical Oncology, Wiley Blackwell, UK, pp 241-262 Footer Page 37 of 126 Header Page 38 of 126 11 Henrik B.R (2012), "Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-AmplifiedFragments (PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis - Valuable Tool for Genotyping and Genetic Fingerprinting", Gel Electrophoresis Principles and Basics,18, pp 315-320 12 Bradford B.U (2005), "Cytochrome P450 CYP2E1, but not nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase, is required for ethanol-induced oxidative DNA damage in rodent liver", Hepatology,41(2), pp 336–344 13 Jordi Bruix., Morris Sherman (2011), "AASLD PRACTICE GUIDELINE: Management of Hepatocellular Carcinoma: An Update", Hepatology,53(3), pp 1020-1022 14 Wang C., Zhao T., Shen L (2015), "Clinical significance of ALDH2 rs671 polymorphism in esophageal cancer: evidence from 31 case-control studies", Onco Targets Ther,8, pp 649-659 15 Chen C.C, Lu R.B, Chen Y.C, et al.(1999), "Interaction between the functional polymorphisms of the alcohol-metabolism genes in protection against alcoholism", American Journal of Human Genetics,65(3), pp 795– 807 16 Steinmetz C.G., Xie P., Weiner H., et al.(1997), "Structure of mitochondrial aldehyde dehydrogenase: the genetic component of ethanol aversion", Structure,5, pp 701-711 17 Ehlers C.L, Spence J.P, Wall T.L, et al.(2004), "Association of ALDH1 promoter polymorphisms with alcohol-related phenotypes in southwest California Indians", Alcoholism: Clinical and Experimental Research,28(10), pp 1481–1486 18 De Zio D., Cecconi F., Filomeni G (2015), "Oxidative stress and autophagy: the clash between damage and metabolic needs", Cell Death and Differentiation,22, pp 377–388 19 Gong D., Ding G., Gu H (2012), "A variant allele of ADH1B and ALDH2, is associated with the risk of esophageal cancer", Exp Ther Med,4(1), pp 135-140 Footer Page 38 of 126 Header Page 39 of 126 20 Wu D., Cederbaum A.I (2003), "Alcohol, oxidative stress, and free radical damage", Alcohol Res Health,27(4), pp 277-284 21 Tuma D.J., Casey C.A (2003), "Dangerous byproducts of alcohol breakdown: Focus on adducts", Alcohol Research & Health,27(4), pp 285–290 22 Agarwal D.P., Goedde H.W (1987), "Human aldehyde dehydrogenase isozymes and alcohol sensitivity", Isozymes Curr Top Biol Med Res,16, pp 21-48 23 Crabb D.W, Edenberg H.J, Bosron W.F, et al (1989), "Genotypes for aldehyde dehydroge nase deficiency and alcohol sensitivity: The inactive ALDH2(2) allele is dominant", Journal of Clinical Investigation,83(1), pp 314-316 24 Luke O Dannenberg (2006), Transcriptional regulation of the human class I alcohol dehydrogenase genes, ProQuest Information and Learning Company, Nooth Zeeb 25 H J Edenberg., W F Bosron (2010), "Acohol dehydrogenases", Comprehensive Toxicology, Elsevier Ltd, UK, pp 111-126 26 ESMO (2012), "Hepatocellular Carcinoma: ESMO-ESDO Clinical Practice Guidelines", Ann Oncol,23(Suppl 7), pp 41-48 27 de Paula Careta F., Paneto G.G (2012), "Recent patents on high-throughput single nucleotide polymorphism (SNP) genotyping methods", Recent Pat DNA Gene Seq,6(2), pp 122-126 28 Stickel F (2002), "Cocarcinogenic effects of alcohol in hepatocarcinogenesis", Gut,51(1), pp 132–139 29 Turati F., Galeone C., Rota M., et al.(2014), "Alcohol and liver cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective studies", Ann Oncol,25(8), pp 1526-1535 30 Lauwers G.Y, Terris B, Balis U.J, et al (2002), "Prognostic histologic indicators of curativelyresected hepatocellular carcinoma", American Journal of surgical Pathology,26(1), pp 25-34 Footer Page 39 of 126 Header Page 40 of 126 31 Miodrag Guvi (2013), "The history of DNA sequencing", J Med Biochem,32(4), pp 301- 312 32 Oota H, Pakstis A.J, Bonne-Tamir B, et al.(2004), "The evolution and population genetics of the ALDH2 locus: Random genetic drift, selection, and low levels of recombination", Annals of Human Genetics,68(2), pp 93-109 33 Yuzugullu H, Gursoy-Yuzugullu O, Yilmaz M, et al (2011), "Aflatoxin genotoxicity is associated with a defective DNA damage response bypassing p53 activation", Liver Int,31(4), pp 561-571 34 Seitz H.K., Stickel F (2010), "Alcetaldehyde as an underestimated risk factor for cancer development: role of genetics in ethanol metabolism", Genes Nutr,5(2), pp 121-128 35 Seitz H.K., Becker P (2007), "Alcohol Metabolism and Cancer Risk", Alcohol Research & Health,30(1), pp 38-47 36 Luo H.R, Israel Y, Tu G.C, et al.(2005), "Genetic polymorphism of aldehyde dehydrogenase (ALDH2) in a Chinese population: gender, age, culture, and genotypes of ALDH2.", Biochem Genet,43(5-6), pp 223-227 37 Gray I.C., Campbell D.A., Spurr N.K (2000), "Single nucleotide polymorphisms as tools in human genetics", Hum Mol Genet,9(16), pp 2403- 2408 38 McKillop I.H., Schrum L.W (2009), "Role of Alcohol inLiver Carcinogenesis", Semin Liver Dis,29(2), pp 222-232 39 IARC (2012), Globocan 2012: Liver cancer Estimated Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012 40 Theravathu J.A, Jaruga P, Nath R.G, et al.(2005), "Polyamines stimulate the formation of mutagenic1,N2propanodeoxyguanosinase adducts from acetaldehyde", Nucleic Acids Res,33(11), pp 3513–3520 41 Howard J.E (2007), "The Genetics of Alcohol Metabolism, Role of Alcohol Dehydrogenase and Aldehyde Dehydrogenase Variants,"Alcohol Reseach Health,30(1), pp 5-12 Footer Page 40 of 126 Header Page 41 of 126 42 Spence J.P, Liang T, Eriksson C.J, et al.(2003), "Evaluation of aldehyde dehydrogenase promoter polymorphisms identified in human populations", Alcoholism: Clinical and Experimental Research,27(9), pp 1389–1394 43 Zhang J.Y, Dai M, Wang X, et al (1998), "A case-control study of hepatitis B and C virus infection as risk for hepatocellular carcinoma in Henan, China", Internationl Journal of Epidemiology,27, pp 574-578 44 Tanaka K, Sakai H, Hashizume M, et al (2000), "Serum testosterone:estradiol ratio and the development of hepatocellular carcinoma among male cirrhotic patients", Cancer Res,60(18), pp 5106-5110 45 Bordone L (2005), "Calorie restriction, SIRT1 and metabolism: Understanding longevity", Nature,6(4), pp 298–305 46 Harty L.C, Caporaso N.E, Hayes R.B, et al (1997), "Alcohol dehydrogenase genotype and risk of oral cavity and pharyngeal cancers", J Natl Cancer Inst,89(22), pp 1698–1705 47 França L.T., Carrilho E., Kist T.B (2002), "A review of DNA sequencing techniques", Quarterly Reviews of Biophysics,35(2), pp 169-200 48 Kubo M (2015), "Clinical Practice Guidelines for Hepatocellular Carcinoma Differ between Japan, United States, and Europe", Liver Cancer,4(2), pp 8595 49 Liu M., Jiang L., Guan X.Y (2014), "The genetic and epigenetic alterations in human hepatocellular carcinoma: a recent update", Protein Cell,5, pp 673-691 50 Anjana Munshi (2012), DNA Sequencing - Methods and Applications, InTech, Croatia 51 Hansell N.K, Pang D, Heath A.C, et al (2005), "Erythrocyte aldehyde dehydrogenase activity: lack of association with alcohol use and dependence or alcohol reactions in Australian twins", Alcohol Alcohol,40(5), pp 343-348 52 NCCN (2013), NCCN practical guidelines in Oncology: Hepatobiliary Cancers Footer Page 41 of 126 Header Page 42 of 126 53 Jepsen P, Ott P, Andersen P.K, et al (2012), "Risk for hepatocellular carcinoma in patients with alcoholic cirrhosis: a Danish nationwide cohort study", Ann Intern Med,156(12), pp 841-847 54 Brooks P.J., Theruvathu J.A (2006), "Acetaldehyde-DNA adducts: implications for the molecular mechanism of alcohol related carcinogenesis", Alcohol,35(3), pp 187-193 55 Xiao Q., Weiner H., Crabb D.W (1996), "The mutation in the mitochondrial aldehyde dehydroge nase (ALDH2) gene responsible for alcohol-induced flushing increases turnover of the enzyme tetramers in a dominant fashion", Journal of Clinical Investigation,89(9), pp 2027-2032 56 Zhai Q., Shi X., Wu D (2006), "Alcohol-induced oxidative stress and cell responses", J Gastroenterol Hepatol,21(Suppl 3), pp S26-9 57 Barry R.E , Williams A.J., Mcgivan J.D (1987), "The detection of acetaldehyde/liver plasma membrane protein adduct formed in vivo by alcohol feeding", Liver Cancer,7(6), pp 364–368 58 Kim S., Misra A (2007), "SNP genotyping: technologies and biomedical applications", Annu Rev Biomed Eng,9, pp 289-320 59 Mukherjee S (2014), "Alcohol metabolism and generation of free radicals: A deep insight.", OA Alcohol 2(1), pp 1-5 60 Villar S, Ortiz-Cuaran S, Abedi-Ardekani B, et al (2012), "Aflatoxininduced TP53 R249S mutation in hepatocellular carcinoma in Thailand: association with tumors developing in the absence of liver cirrhosis", PLoS One,7(6), pp e37707 61 Helmut K Seitz., Felix Stickel (2010), "Alcetaldehyde as an underestimated risk factor for cancer development: role of genetics in ethanol metabolism", Genes Nutr,5(2), pp 121-128 62 American Cancer Society (2016), Facts and Figures, Atlanta 63 Hurley T.D., Edenberg H.J (2012), "Genes encoding enzymes involved in ethanol metabolism", Alcohol Res Health,34(3), pp 339-344 Footer Page 42 of 126 Header Page 43 of 126 64 Hurley T.D., Edenberg H.J., Li T.K (2003), "The pharmacogenomics of alcoholism", Pharmacogenomics: The Search for Individualized Therapies, Wiley-VCH, Weinheim, Germany 65 Cillo U., Bassanello M., Vitale A., et al.(2004), "The critical issue of hepatocellular carcinoma prognostic classification: which is the best tool available", J Hepatol,40(1), pp 124-131 66 Vasiliou V., Nebert DW (2005), "Analysis and update of the human aldehyde dehydrogenase (ALDH) gene family", Hum Genomics,2(2), pp 138-143 67 Ming W., Shen-Chih C., Ellen K (2013), "Single Nucleotide Polymorphisms of ADH1B, ADH1C and ALDH2 Genes and Esophageal Cancer: A Population-Based Case- Control Study in China", Int J Cancer,132(8), pp 1868-1877 68 Huang X.E, Yu S.Z, Koide T, et al.(2002), "Hepatitis B and C viruses infection, lifestyle and genetic polymorphisms as risk factors for hepatocellular carcinoma in Haimen, China", Jpn J Cancer Res,93, pp 12871292 69 Zhao Y., Wang C (2015), "Glu504Lys Single Nucleotide Polymorphism of Aldehyde Dehydrogenase Gene and the Risk of Human Diseases", Biomed Res Int,2015 70 Zhao Z, Li R, Sun M, et al.(2016), "ALDH2 gene polymorphism in different types of cancers and its clinical significance", Life Sci,147, pp 59-66 71 Samir Zakha (2006), "Overview: How is alcohol metabolized by thebody?", Alcohol Research & Health, (29), pp 72 Hua Zhao, Kui-Jie Liu, Zhen-Dong Lei, et al.(2014), "Meta-analysis of the aldehyde dehydrogenases-2 (ALDH2) Glu487Lys polymorphism and colorectal cancer risk", PLoS One,9(2), pp e88656 73 Paiboon M., Somsong N., Nishiyori A (2002), "Aldehyde Dehydrogenase-2 Genotype Detection in Fingernails among Non-alcoholic Northeastern Thai Population and Derived Gene Frequency" ScienceAsia28: 99-103 Footer Page 43 of 126 ... nay, nghiên cứu mối liên quan đa hình thái gen mã hóa cho enzym ALDH2 với UTGNP chưa nghiên cứu tìm hiểu cách đồng Chính vậy, đề tài Nghiên cứu tính đa hình đơn gen ALDH2 bệnh nhân ung thư gan nguyên. .. 1.3.2 Chức gen ALDH2 16 1.3.3 Tính đa hình gen ALDH 17 1.3.4 Gen ALDH2 bệnh ung thư 19 1.4 Kỹ thuật xác định đa hình đơn gen ALDH2 20 1.4.1 Hiện tượng đa hình đơn nucleotide... bào mã hoá gen ALDH1A1, ALDH2, enzyme tìm thấy ty thể, mã hoá gen ALDH2 Gen ALDH2 loại gen đa hình nghiên cứu nhiều biết rõ Các nghiên cứu giới chứng minh tượng đa hình đơn nucleotide gen mã hóa