ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -* - NGUYỄN MẠNH TUẤN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG SINH AXÍT LACTIC CAO TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN TẠI KHU VỰC THÀNH PHỐ THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Thái Nguyên - 2012 MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, với xu hướng đa dạng sản xuất hàng hoá ngành chăn nuôi phạm vi nước nói chung có bước phát triển mạnh Cho đến nay, sản phẩm ngành chăn nuôi đáp ứng nguồn thực phẩm cho nhu cầu tiêu dùng nước mà xuất thu ngoại tệ cho kinh tế quốc dân [56] Tuy nhiên, với phát triển chăn nuôi dịch bệnh vật nuôi phát sinh phát triển, đặc biệt bệnh đường ruột làm tăng tỷ lệ chết, giảm suất nguồn nhiễm tiềm tàng cho sản phẩm, gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng Với phát khoa học hoạt chất có khả kháng khuẩn Alex Fleming (1929) [57] việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi mở kỷ nguyên điều trị bệnh truyền nhiễm nhanh chóng áp dụng giới Ngoài ra, kháng sinh bổ sung vào thức ăn chăn nuôi từ năm 1950 kỷ 20 [56] Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc kháng sinh điều trị bệnh cho vật nuôi nảy sinh tính kháng thuốc vi sinh vật gây bệnh tồn dư lượng thuốc kháng sinh thực phẩm, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người Chính vậy, nên nhu cầu tìm giải pháp nhằm hạn chế tồn dư kháng sinh sản phẩm động vật để bảo vệ vật nuôi vấn đề ngày trở nên cấp bách [37] Trong tự nhiên trình cạnh tranh sinh học xảy thường xuyên loài sinh vật với dẫn tới sinh vật yếu bị giảm số lượng bị tiêu diệt khu vực cư trú [20], [45] Probiotic chế phẩm sinh học chứa vi khuẩn sống, có tác động làm cân hệ vi sinh vật đường ruột, từ ảnh hưởng tốt cho động vật Cách thức hoạt động probiotic cạnh tranh, qua tạo nên hàng rào vật lý bảo vệ công vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, chúng sinh hoạt chất kháng khuẩn men kích thích hệ thống miễn dịch vật nuôi [29] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Lactobacillus nhóm vi khuẩn sử dụng rộng rãi chế tạo probiotics Các chủng Lactobacillus tìm thấy phân lập nhiều đường tiêu hóa động vật, phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường sản phẩm lên men, Các sản phẩm có chứa hàm lượng axít lactic cao tiềm để sản xuất probiotics [42] Các sản phẩm probiotic dùng chăn nuôi nước ta hạn chế, ngành chăn nuôi sử dụng phần lớn sản phẩm probiotic nhập Tuy nhiên, tác dụng tích cực cho vật nuôi chưa khẳng định rõ ràng Các nhà khoa học cho vi sinh vật không phù hợp với hệ vi sinh vật đường ruột vật chủ địa Mặt khác, nghiên cứu chế tạo probiotics dùng chăn nuôi nước ta hạn chế Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành thực đề tài “Phân lập, tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic cao từ sản phẩm lên men khu vực thành phố Thái Nguyên” với mục tiêu tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic cao, chống chịu tốt điều kiện in vitro làm sở cho việc chế tạo probiotic dùng chăn nuôi Nội dung nghiên cứu: - Phân lập chủng Lactobacillus - Định lượng axít lactic sinh chủng Lactobacillus phân lập - Đánh giá số đặc tính probiotic chủng Lactobacillus phân lập điều kiện in vitro - Phân loại số chủng Lactobacillus phân lập Ý nghĩa khoa học đề tài: Kết nghiên cứu đề tài sở cho việc lựa chọn số chủng vi khuẩn lactic phân lập có hoạt tính sinh học cao để tạo chế phẩm sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 1.1.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn lactic xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc Eubacteriales Nhóm không đồng mặt hình thái, song mặt sinh lý chúng tương đối đồng Tất có đặc điểm chung vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di động Chúng thu nhận lượng nhờ chuyển hóa hydrat cacbon sinh axít lactic Khác với số vi khuẩn khác vi khuẩn đường ruột sinh axít lactic, tất vi khuẩn lactic vi khuẩn lên men bắt buộc, không chứa cytocrom enzyme catalaza, sinh trưởng tùy tiện Hình dạng tế bào vi khuẩn lactic hình cầu hay hình que Kích thước chúng thay đổi tùy loài khác Tất khác hình thái tế bào phụ thuộc vào môi trường, thời gian có mặt oxy điều kiện nuôi cấy khác [12] 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 1.1.2.1 Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Cacbon thành tố hợp chất hữu xây dựng lên thể loài sinh vật Vì chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbon thành chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trình dinh dưỡng tế bào vi sinh vật Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều loại hydratcacbon, từ hexose glucose, fructose, manose, galactose; loại đường đôi saccarose, lactose, maltose polysaccarit tinh bột, dextrin Nguồn lượng quan trọng cho vi khuẩn lactic monosaccarit disaccarit Các nguồn cacbon dùng để cung cấp lượng, xây dựng cấu trúc tế bào sinh axít hữu axít citric, malic, pyruvic, fumaric, axetic Một số loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ sản phẩm thực phẩm sử dụng axít gluconic galacturonic tạo thành CO 2, axít axetic Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn axít lactic Lactobacterium lycopersici, Streptobacterium hassice fermentatae Trong trình lên men chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic sử dụng axít amin axít glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp lượng Khi tạo trình decacboxyl tạo CO Các loại vi khuẩn khác đòi hỏi nguồn cacbon khác Sự phát triển vi khuẩn lactic với loại đường khác tạo tế bào có đặc điểm hình thái sinh lý khác có khả chống chịu khác trước áp lực trình xử lý sau Khả sống sót L bulgaricus sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường bổ sung trình nuôi cấy thu hồi chế phẩm, lên men từ manose tỉ lệ tế bào chết nhiều hẳn so với lên men từ fructose lactose Tuy nhiên, việc lựa chọn loại đường cần quan tâm đến vấn đề kinh tế nhằm giảm thiểu chi phí đầu vào [12] 1.1.2.2 Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Nitơ nguyên tố cần thiết cho sống tất sinh vật Những vật chất tế bào protein, axít nucleic… chứa nitơ, nitơ đóng vai trò quan trọng trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn Vi khuẩn lactic đòi hỏi nhiểu axít amin khác chúng cần môi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo phát triển Axít amin đồng hóa dạng peptit nhờ vào tác dụng enzyme protease ngoại bào hay nội bào Mỗi loài vi khuẩn khác lại có nhu cầu nguồn nitơ khác Phần lớn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp chất hữu phức tạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn môi trường Chỉ có số loài vi khuẩn lactic có khả sinh tổng hợp hợp chất hữu có từ nguồn nitơ vô L helveticus chúng bị kích thích có mặt muối amoni môi trường Để sinh trưởng phát triển bình thường, nitơ dạng hỗn hợp axít amin, vi khuẩn lactic cần hợp chất hữu chứa nitơ sản phẩm thủy phân protein từ pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt, trypton… Đây nguồn nitơ thường xuyên sử dụng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên qui mô công nghiệp ta cần nghiên cứu nguồn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mà nâng cao hiệu sản xuất Trong nấm men thủy phân sử dụng nhiều [12] 1.1.2.3 Nhu cầu dinh dưỡng vitamin Các vi khuẩn lactic, đặc biệt giống Lactobacillus, cần vitamin cho sinh trưởng Axít nicotinic axít pantotenic cần cho sinh trưởng tất loài vi khuẩn lactic Tuy nhiên vitamin bị ảnh hưởng nhiều yếu tố nhiệt độ nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu oxy hóa khử môi trường [12], [32] 1.1.2.4 Các chất hữu khác cần thiết cho sinh trưởng vi khuẩn lactic Axít axetic axít xitric ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng vi khuẩn lactic sử dụng rộng rãi làm thành phần môi trường để nuôi cấy, phân lập bảo quản chủng vi khuẩn lactic Axetat có tác động quan trọng đến sinh trưởng tế bào Axetat dung làm chất đệm cho môi trường nuôi cấy nhiều loài vi khuẩn lactic Một loại axít hữu quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng hầu hết loài vi khuẩn lactic axít oleic, dẫn xuất axít oleic dụng Tween 80 thành phần môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn lactic Một vài loài vi khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus) cần axít béo không no cho phát triển [12], [50] 1.1.2.5 Nhu cầu muối khoáng Để đảm bảo cho sinh trưởng vi khuẩn lactic cần hợp chất vô đa lượng vi lượng đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan magiê Đặc biệt mangan có tác dụng ngăn cản trình tự phân hủy tế bào cần thiết cho trình sống bình thường vi khuẩn Đối với Lactobacillus mangan, magiê sắt có tác động tích cực lên sinh trưởng vi khuẩn lactic [12], [45] 1.1.3 Đặc điểm phân loại vi khuẩn lactic Theo khóa phân loại vi khuẩn Bergey’s [21] Lactobacillus phân loại sau: Ngành: Lớp: Firmicutes Bacilli Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bộ: Họ: Giống: Eubacteriales Lactobacillaceae Lactobacillus Lactobacillus thuộc nhóm vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic gồm số giống ngành Firmicutes, chúng có chung đặc tính vi khuẩn Gram dương lên men carbohydrate thành lượng axít lactic Giống Lactobacillus đa dạng Sự đa dạng chúng đánh giá hàm lượng G+C ADN loài, thường chiếm 32-53 mol% Điểm đặc trưng phổ biến nhằm phân biệt chúng với phần lớn giống khác dạng hình que khả tạo axít lactic sản phẩm cuối chủ yếu Bên cạnh đó, Lactobacillus vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử di động Người ta thấy tế bào Lactobacillus điển hình có dạng hình que, với kích thước biến đổi khoảng (0,5-1,2)×(1-10) m, trông chúng gần giống hình cầu (coccoid) điều kiện thường hình thành dạng chuỗi tồn đơn độc Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus môi trường agar có kích thước 2-5mm, dạng lồi, mờ đục không nhuộm màu Những tế bào đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp, có khả lên men phân hủy saccharose Ít nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon lactose [25] Về nhu cầu ôxy, chúng vi khuẩn kỵ khí tùy tiện, phát triển tốt điều kiện ôxy Nhìn chung, loài giống phát triển tốt điều kiện có 5% CO2 [22] Về nhu cầu dinh dưỡng, Lactobacillus cần chế độ dinh dưỡng đặc biệt Chúng phát triển tốt môi trường nhiều phức chất Nhiệt độ phát triển tối ưu chúng 30-400C, sinh trưởng phạm vi từ 5-530C Chúng có khả chịu đựng môi trường có tính axít, pH tối ưu cho phát triển 5,5-5,8 nhìn chung sinh trưởng pH [12] 1.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến trình trao đổi chất vi khuẩn lactic 1.1.4.1 Ảnh hưởng oxy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vi khuẩn lactic nhóm vi khuẩn hô hấp tùy tiện, hệ enzyme hô hấp xitocrom hệ catalaza Tuy vậy, chúng có khả oxy hóa nhiều hệ FAD (Flavin Adenin Dinuclecotit) Các nghiên cứu cho thấy, số chất môi trường sử dụng có mặt oxy Chẳng hạn Pediococcus sp L plantarum đồng hóa glyxerin điều kiện hiếu khí Một số loài Leuconostoc cần có mặt oxy giai đoạn đầu để đồng hóa hexoase L brevis L buchneri phát triển tốt 30 oC điều kiện yếm khí, 37 oC chủng phát triển điều kiện hiếu khí kị khí tùy tiện Hiện tượng tương tự gặp số chủng thuộc loài S pyogenes Các nghiên cứu cho thấy, hệ enzyme peroxylase có vi khẩn lactic thực chức thay cho hệ enzyme dehydrogenase, oxy sử dụng chất nhận hydro Quá trình oxy hóa vi khuẩn lactic thường kèm tlợn việc tạo thành H 2O2 Đồng thời số vi khuẩn lactic (S brevis, L mesenteroides) khử H 2O2 thành nước với tham gia số chất oxy hóa Như vậy, vi khuẩn lactic có hệ peroxydase sử dụng NADH làm chất nhận điện tử phân giải H 2O2 Phương trình phản ứng sau: NADH2 + H+ + H2O2 → NAD+ + 2H2O Trong điều kiện hiếu khí, lượng sinh lớn nhiều so với điều kiện yếm khí (hơn 20 lần phân hủy mol glucose) Quan hệ với oxy loài vi khuẩn khác có khác Trong điều kiện kị khí nghiêm ngặt, trực khuẩn lên men dị hình chậm sinh trưởng Các vi khuẩn lactic lên men dị hình lên men arabinoase đạt tối ưu điều kiện kị khí, loài khác không sử dụng pentose lại sinh trưởng điều kiện Trong trình lên men lactic, lượng oxy vượt giới hạn làm bất hoạt lactate dehydrogenazase, trình tạo thành axít lactic không xảy Trong trình lên men bảo quản loại thực phẩm tươi sống (tôm, cá, thịt,…), vi khuẩn yếm khí lên men lactic đồng hình thường sử dụng, Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn bảo quản bao gói chân không Hình thức bảo quản này, mặt tránh oxy hóa sản phẩm, mặt khác tránh sinh trưởng vi sinh vật hiếu khí gây hỏng sản phẩm Trường hợp vi khuẩn lactic ức chế tốt với vi khuẩn hiếu khí nhờ sản phẩm trao đổi chất [12], [18] 1.1.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Bảng 1.1 Nhiệt độ thích hợp cho giống vi khẩn lactic [12] Nhóm vi khuẩn lactic Nhiệt độ sinh trƣởng (0C) Bình thƣờng Tối ƣu Giống Enterococcus, Pediococcus, Bifidobacterium Leuconostoc, Vogococcus, Ưa ấm - 45 20 - 40 Lactococcus Ưa nhiệt 20 - 60 40 - 45 Str Streptococcus Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic Ưa lạnh - 27 10 - 15 Khoảng nhiệt độ sinh trưởng vi khuẩn rộng, số loài sinh trưởng 55oC số khác sinh trưởng 50C Tuy nhiên đa số vi khuẩn lactic sinh trưởng khoảng nhiệt độ từ 15 – 400C (Bảng 1.1) 1.1.4.3 Ảnh hưởng pH Hoạt động vi khuẩn lactic, đặc biệt hệ enzyme chúng, chịu tác động mạnh thay đổi pH môi trường Mỗi enzyme có vùng pH tối ưu mà hoạt tính sinh học cao Bảng 1.2 Khoảng pH thích hợp chi vi khuẩn lactic [12] pH tối thích pH sau lên men Lactobacillus 5,6 - 6,2 3,2 - 3,5 Lactococcus 5,6 - 6,5 4,0 - 4,5 Leuconostoc 5,6 - 6,5 5,0 Enterococcus 7,0 4,0 - 4,6 Pediococcus 5,6 - 6,5 3,2 - 3,5 Chi Tuy nhiên, pH nội bào vi khuẩn lactic lại không tương ứng với pH tối ưu enzyme nội bào Giá trị pH tối ưu cho sinh trưởng Lactobacillus, Pediococcus Leuconostoc 5,6 - 6,2; 5,6 - 6,5 5,6 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn - 6,5 Giá trị pH thấp mà giống vi khuẩn lactic chịu khác Chẳng hạn Lactobacillus chịu pH = 3,2 - 3,5, Pediococcus chịu pH = 3,2 - 3,5 đó, Leuconostoc chịu pH = 5,0 (Bảng 1.2) Trong trình lên men lactic, axít lactic sinh có tác dụng ức chế hoạt động vi sinh vật khác Sau đó, lượng axít tích lũy đủ lớn vi khuẩn lactic bị ức chế, axít hóa tế bào chất gây tích lũy nội bào axít lactic [12] 1.1.4.4 Ảnh hưởng nồng độ NaCl Nồng độ NaCl ảnh hưởng đến màng tế bào chất vi khuẩn Với nồng độ NaCl lớn 5%, sinh trưởng phần lớn chủng vi khuẩn lactic bị ức chế Nồng độ muối cao làm chênh lệch áp suất thẩm thấu nội bào ngoại bào vi khuẩn lactic tăng, đồng thời ức chế hoạt tính enzyme tế bào Các vi khuẩn Gram âm dễ mẫn cảm với NaCl vi khuẩn Gram dương, nguyên nhân enzyme vi khẩn bị ức chế ion Cl- Một số chủng P pentosaceus sinh trưởng nồng độ NaCl 9-10% [12], [45] 1.1.4.5 Ảnh hưởng nồng độ glucose Đường nguồn cacbon chủ yếu cho vi khuẩn lactic sinh tổng hợp axít lactic Nồng độ đường môi trường cao lượng axít sinh nhiều Tuy nhiên, nồng độ đường cao làm cho áp suất thẩm thấu môi trường cao gây tượng co nguyên sinh ảnh hưởng đến sinh trưởng tế bào vi khuẩn lactic giảm axít lactic tạo [12], [18] 1.1.5 Lên men lactic Lactobacillus Lên men lactic trình chuyển hóa đường thành axít lactic nhờ vi sinh vật, điển hình vi khuẩn lactic Lactobacillus có khả lên men nhiều loại đường đơn đường đôi khả lên men loại glucid phức tạp tinh bột Sự phát triển chúng cần có có mặt peptone, axít amin hay muối amôn Vi khuẩn Lactobacillus có yêu cầu đặc biệt chất dinh dưỡng giàu vitamin, axít amin khoáng chất Quá trình lên men xảy tốt môi trường axít pH từ 5,5÷6, pH 5,5 trình lên men bị dừng lại Nhiệt độ thích 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... tài Phân lập, tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic cao từ sản phẩm lên men khu vực thành phố Thái Nguyên với mục tiêu tuyển chọn số chủng Lactobacillus có khả sinh axít lactic. .. probiotics Các chủng Lactobacillus tìm thấy phân lập nhiều đường tiêu hóa động vật, phế phụ công nghiệp sản xuất bia, rượu, đường sản phẩm lên men, Các sản phẩm có chứa hàm lượng axít lactic cao tiềm... nghiên cứu đề tài sở cho việc lựa chọn số chủng vi khu n lactic phân lập có hoạt tính sinh học cao để tạo chế phẩm sinh học Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn