ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Staphylococcus aureus GÂY ĐỘC ĐƢỜNG RUỘT NHÓM B TRONG THỊT LỢN BÁN TẠI THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên1 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Vấn đề an toàn thực phẩm trở thành vấn đề quan trọng sức khỏe cộng đồng hầu phát triển nước phát triển Trong loại thực phẩm sử dụng hàng ngày thịt lợn loại thực phẩm thông dụng thường xuyên sử dụng để chế biến ăn thực đơn hàng ngày gia đình Tuy nhiên thời gian gần có nhiều bệnh dịch liên quan đến thịt lợn mà lợi ích trước mắt người sử dụng bỏ qua tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm - đe dọa sức khỏe người Các vụ ngộ độc có nhiều nguyên nhân do: hóa chất, thân thực phẩm chứa sẵn số chất độc, thực phẩm chứa vi sinh vật gây bệnh,…Trong đó, vụ ngộ độc thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây phát triển nhanh chóng với hậu nghiêm trọng Ngộ độc thực phẩm bệnh cấp tính xảy ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn, độc tố vi khuẩn có chứa chất có tính chất độc hại người Trong số vi sinh vật sinh độc tố gây bệnh có tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thức ăn tụ cầu vàng ăn, uống phải độc tố ruột tụ cầu vàng vốn cư trú đường ruột chiếm ưu số lượng Điều đáng ý số độc tố chúng bền với nhiệt khó bị phân hủy nhiệt độ cao, số độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B (SEB) SEB tác nhân gây ngộ độc thực phẩm thường gặp S aureus Hơn chúng lại có khả kháng methiciline, penicillin, gặp điều kiện thuận lợi lây lan gây bệnh nguy hiểm Hiện nay, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu cho nhiễm độc độc tố nhóm này, phương pháp phòng ngừa đặc hiệu không có, việc phòng bệnh điều trị bệnh ngộ độc tụ cầu gặp nhiều khó khăn không phát kịp thời tác nhân gây bệnh Vì vậy, việc xác định có mặt SEB mẫu bệnh phẩm thực phẩm đóng vai trò quan trọng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên2 http://www.lrc-tnu.edu.vn Mặt khác, việc giết mổ bán thịt lợn chủ yếu tư nhân thực hiện, phương tiện vận chuyển, dụng cụ bán thịt chưa đạt tiêu chuẩn vệ sinh thú y Việc kiểm tra vệ sinh thú y cán kiểm dịch gặp nhiều khó khăn dừng lại mức độ kiểm tra cảm quan thịt bán chợ Xuất phát từ lí trên, tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm số đặc tính vi khuẩn Staphylococcus aureus gây độc tố đường ruột nhóm B thịt lợn Thái Nguyên.” 2.Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tỉ lệ nhiễm đặc tính độc tố nhóm B vi khuẩn Staphylococcus aureus thịt lợn, từ làm sở để nhà dịch tễ học có biện pháp nhằm khắc phục tình trạng ngộ độc thực phẩm Nội dung nghiên cứu - Khảo sát tình hình giết mổ xác định tỉ lệ nhiễm Staphylococcus aureus - Xác định đặc tính sinh hoá chủng Staphylococcus aureus phân lập - Xác định độc lực chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập chuột bạch khoẻ - Phân lập xác định trình tự gen độc tố đường ruột Enterotoxin nhóm B chủng Staphylococcus aureus - Xác định tính mẫn cảm chủng Staphylococcus aureus phân lập số loại kháng sinh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên3 http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình nhiễm trùng, nhiễm độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm bệnh cấp tính xảy ăn phải thức ăn bị nhiễm vi khuẩn độc tố vi khuẩn thức ăn có chứa chất độc hại người ăn Bệnh có tính chất đột ngột, nhiễm độc cho nhiều người thời điểm họ tiêu thụ loại thức ăn Ngộ độc thực phẩm có triệu chứng bệnh cấp tính nôn mửa, tiêu chảy v.v kèm theo triệu chứng khác tùy theo loại tác nhân gây ngộ độc [34] Thực phẩm ô nhiễm vi sinh vật độc tố vi sinh vật nguyên nhân gây bệnh phổ biến toàn cầu, xảy nước có khoa học y học phát triển nước lạc hậu phát triển [31] Hiện nay, loài người phải đối mặt với nguy nhiễm 200 bệnh truyền nhiễm thông qua thực phẩm Các triệu chứng lâm sàng đa dạng, từ mức viêm dày, ruột nhẹ nhiễm trùng, nhiễm độc nặng với nguy tử vong cao, dẫn tới biến chứng phức tạp, ảnh hưởng tới đời sống bệnh nhân Hậu thiệt hại kinh tế bệnh lây truyền qua thực phẩm lớn có xu hướng ngày tăng Ví dụ, năm Hoa Kỳ có khoảng 76 triệu ca mắc bệnh loại thực phẩm ô nhiễm, 325 nghìn ca nhập viện nghìn ca tử vong [23] Các chi phí điều trị cho bệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm Các loại mầm bệnh gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm: Người tiêu dùng mắc bệnh sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm mầm bệnh vi sinh vật, độc tố vi sinh vật số kim loại độc Trong số 200 bệnh có nguồn gốc từ thực phẩm có khoảng 40 mầm bệnh vi sinh vật xác định vai trò gây bệnh [15] Các mầm bệnh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng virus, loại vi khuẩn gây tới 90% số ca bệnh tử vong người Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên4 http://www.lrc-tnu.edu.vn Thế giới kỷ nguyên toàn cầu hóa, việc sản xuất phân phối sản phẩm thực phẩm không bị bó hẹp không gian địa lý dẫn đến khả lan tràn khắp giới bệnh thực phẩm ô nhiễm Đồng thời, trình công nghiệp hóa, thực phẩm sản xuất hàng loạt làm khả nhiều người tiêu dùng mắc bệnh tăng cao Số ca mắc bệnh thực phẩm ô nhiễm tăng đáng kể vòng 10 năm trở lại [23] Mặc dù y học phát triển, song tác nhân gây bệnh trực tiếp từ thực phẩm chưa phát đầy đủ Tại Hoa Kỳ, có 14/76 triệu ca mắc, 60/325 nghìn ca nhập viện 1,8/5 nghìn ca tử vong nhiễm trùng độc thực phẩm chẩn đoán xác nguyên nhân [23] Trong số nguyên nhân xác định, có số mầm bệnh có khả gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm cấp tính nguy hiểm với tỉ lệ tử vong cao như: Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Vibrio cholera, Salmonella, Campylobacterer, Yersinia enterocolitica.v.v [15] Listeria monocytogenes thường gặp sữa sản phẩm từ sữa, thịt, cá rau Vi khuẩn gây viêm màng não, nhiễm khuẩn đường tiết niệu tử vong, đặc biệt nguy hiểm với người suy giảm miễn dịch có khả lây nhiễm cao như: ung thư, AIDS, nghiện rượu, đái tháo đường Escherichia coli có mặt tất loại thực phẩm chết biến không vệ sinh, có nhiều chủng với khả gây bệnh khác chủng gây ỉa chảy (EPEC); chủng sinh độc tố ruột (ETEC) gây ỉa chảy trẻ em khách du lịch.v.v…[28] Ở nước châu Á, tụ cầu vàng (S aureus) nguyên nhân hàng đầu gây ngộ độc [3] 1.1.2 Tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm Staphylococcus aureus độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B Tụ cầu S aureus loài vi khuẩn gây bệnh ghi nhận sớm vào đầu năm 1880 Sự liên quan tụ cầu tới nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn biết đến từ năm 1914, tới năm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên5 http://www.lrc-tnu.edu.vn 1930, Dack cs xác định nhiễm trùng, nhiễm độc tụ cầu gây độc tố ruột có dịch nuôi cấy tụ cầu vàng [5] Từ năm 1969 1990, Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực phẩm S aureus ghi nhận tiêu thụ sản phẩm từ thịt (đặc biệt ruốc); 22% trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ sản phẩm liên quan sữa, 7% từ cá, sò, ốc v.v… 3,5% từ trứng [30] Tại Pháp, số thực phẩm nhiễm S aureus ghi nhận hai năm (1999-2000) có sản phẩm từ sữa (đặc biệt pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích (15%), cá hải sản (11%), trứng sản phẩm từ trứng (11%) sản phẩm khác từ gia cầm (9,5%) [19] Tại Hoa Kỳ, số trường hợp ngộ độc thực phẩm S aureus báo cáo năm 1975 1982 36% tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1% đến 1,4%, lại từ sản phẩm liên quan tới sữa hải sản [33] Ở châu Á vụ nhiễm S aureus chủ yếu nước Nhật Bản, Trung Quốc khu vực Đông Nam Á Ở Trung Quốc năm 2008 xảy vụ ngộ độc S aureus trẻ em uống sữa bị nhiễm S aureus Còn Nhật có vụ ngộ độc S aureus lớn vào tháng năm 1955 làm ngộ độc 1936 em học sinh trường tiểu học Tokyo tháng năm 2006 làm 14780 người bị ngộ độc vùng Kansai Nguyên nhân vụ ngộ độc họ uống sữa có nhiễm S aureus tập đoàn Snow Trong khu vực Đông Nam Á, hai quốc gia có tỷ lệ ngộ độc S aureus cao Indonesia Philippines Việt Nam nước có tỷ lệ nhiễm S aureus cao khu vực châu Á Như vậy, nước khác loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu khác Tại Việt Nam, thực phẩm nhiễm khuẩn độc tố chúng đa dạng, thường gặp thực phẩm đường phố ăn (46,6%), xúc xích Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên6 http://www.lrc-tnu.edu.vn (96,6%), bánh gato (85%), Patê (83,3%) v.v Đáng ý vi khuẩn S aureus thường tìm thấy thực phẩm bị nhiễm khuẩn [7] Tình trạng ngộ độc thực phẩm không diễn thành phố lớn mà tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh thực phẩm diễn phổ biến nhiều địa phương khác nước [30] Tuy nhiên, Việt Nam thực tế chưa có thống kê cụ thể số ca mắc hay tử vong ngộ độc thực phẩm liên quan đến SEB Có nhiều nguyên nhân gây khó khăn cho trình thống kê tình hình dịch bệnh ngộ độc thực phẩm SEB: - Bệnh nhẹ nên người bệnh không chủ động tìm kiếm điều trị sở chuyên khoa - Chẩn đoán khoa cấp cứu bệnh viện thường có nhiều bệnh có biểu gần giống bệnh SEB gây ra, nên chưa kết luận bệnh - Việc tiến hành nghiên cứu phục vụ cho chẩn đoán nhanh ngộ độc thực phẩm độc tố ruột SEB tụ cầu vàng Việt Nam mẻ, chủ yếu dựa vào phương pháp truyền thống nên tốn nhiều công sức thời gian kéo dài Do đó, bệnh nhân nhiễm độc tụ cầu nội độc tố SEB gặp nguy hiểm gấp bội SEB siêu kháng nguyên có độc tính mạnh, tác động nhanh , dẫn tới tử vong người Dựa theo bảng 1.1 đây, nhận thấy tình trạng xuất vi sinh vật S aureus loại thực phẩm diễn phổ biến nước Vi khuẩn gây ngộ độc cấp tính cho nhiều người thời điểm họ tiêu thụ loại thực phẩm Ngộ độc thực phẩm S aureus xảy với đối tượng Tuy nhiên, người già, trẻ em người có hệ miễn dịch dễ mắc biểu triệu chứng nhiễm độc nặng nề [4] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên7 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.1 Sơ tình hình nhiễm độc tụ cầu vàng toàn quốc từ 2007 – 2012 Địa điểm STT Thời gian Số ngƣời mắc bệnh Đặc điểm bệnh nhân Mầm non bán công Vĩnh Thọ - Phú Thọ 9/2007 100 Học sinh Mầm non Vườn Hồng, P9 – Tân Bình; Tiểu học Âu Cơ, Q11 – TP HCM 12/2007 65 Trẻ em (từ 2-5 tuổi) Minh Long – Quảng Ngãi 2/2008 53 Người dân Hà Nội 5/2008 122 Khách dự đám cưới Cty TNHH Alliace One, KCN Giao Long, Bến Tre 6/2008 100 Công nhân Sơn La 9/2008 581 Người dân Tiểu học Tam Bình, Q.Thủ Đức – TP HCM 11/2008 51 Học sinh phụ huynh Cty Phú Nguyên, KCN An Đồng, Hải Dương 8/2009 160 Công nhân 4/2012 300 Khách dự đám cưới Bản Hùn xã Chiềng Cọ Sơn La Việc tìm phương pháp phát sớm S aureus độc tố SEB gây nhiễm trùng, nhiễm độc trực tiếp thực phẩm mang ý nghĩa quan trọng cấp thiết, nhằm loại bỏ có biện pháp xử lý sớm thực phẩm Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên8 http://www.lrc-tnu.edu.vn nhiễm độc nhiễm trùng Nhưng trước hết cần phải tìm hiểu đặc tính sinh hoá nghiên cứu mức độ phân tử làm tảng Chính vậy, việc tiến hành đề tài nhu cầu thực tiễn cấp bách 1.2 Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus 1.2.1 Lịch sử phát Staphylococcus aureus Robert Koch phát năm 1878 sau thực phân lập từ mủ ung nhọt Năm 1880 Louis Paster tiến hành phân lập nghiên cứu Staphylococcus aureus Ngày 09/04/1880 bác sĩ người Scotland Alexander Ogston trình bày hội nghị lần thứ hội phẫu thuật Đức báo cáo khoa học, ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) trình bày tương đối đầy đủ vai trò vi khuẩn bệnh lý sinh mủ lâm sàng Đến năm 1881 Ogston thành công việc gây bệnh thực nghiệm, tiền đề cho nghiên cứu S aureus sau Đến năm 1884 Rosenbach thực loạt nghiên cứu tỉ mỉ vi khuẩn Và ông đặt tên cho vi khuẩn Staphylococcus aureus Năm 1926 Julius von Daranyi người phát mối tương quan diện hoạt động men coagulase huyết tương vi khuẩn với khả gây bệnh Tuy nhiên đến năm 1948 phát chấp nhận rộng rãi 1.2.2 Đặc điểm phân loại Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, Bacillales, họ Staphylococcaceae, giống Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus Tên khoa học: Staphylococcus aureus [12] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên9 http://www.lrc-tnu.edu.vn Trên phương diện gây bệnh, tụ cầu khuẩn chia thành hai nhóm chính: tụ cầu có coagulase tụ cầu coagulase S aureus gây bệnh ngộ độc thực phẩm tụ cầu có coagulase Nhờ enzyme mà môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc màu vàng nên gọi tụ cầu vàng Phân loại tụ cầu dựa kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại kháng nguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vào kháng nguyên, việc định loại vi khuẩn khó khăn Phân loại tụ cầu dựa phage (phage type): tụ cầu phân vào nhóm I, II, III, IV Đây phương pháp sử dụng nhiều phân loại S aureus [5] 1.2.3 Đặc điểm vi khuẩn học 1.2.3.1 Hình dạng kích thƣớc Tụ cầu (“Staphylococcus” bắt nguồn từ tiếng Hy lạp, với “staphyle” có nghĩa chùm nho) Tế bào tụ cầu khuẩn S aureus hình tròn, đường kính 0,51m, không di động, không sinh nha bào, vỏ capsule (giáp mô), lông, bắt màu Gram dương Trong bệnh phẩm tụ cầu thường tụ tập thành đám nhỏ chùm nho Trong môi trường canh khuẩn xếp thành đám lớn (Hình 1.1) Hình 1.1 Hình ảnh vi khuẩn S aureus kính hiển vi điện tử Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... Nghiên cứu tỷ lệ nhiễm số đặc tính vi khuẩn Staphylococcus aureus gây độc tố đường ruột nhóm B thịt lợn Thái Nguyên. ” 2.Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tỉ lệ nhiễm đặc tính độc tố nhóm B vi khuẩn. .. thức ăn b nhiễm vi khuẩn, độc tố vi khuẩn có chứa chất có tính chất độc hại người Trong số vi sinh vật sinh độc tố gây b nh có tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) nguyên nhân gây ngộ độc thực... mầm b nh vi sinh vật xác định vai trò gây b nh [15] Các mầm b nh vi sinh vật bao gồm vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng virus, loại vi khuẩn gây tới 90% số ca b nh tử vong người Số hóa Trung tâm Học