ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÙI HỒNG XUYẾN TẠO VẬT LIỆU PHỤC VỤ CHỌN DÒNG CHỊU HẠN Ở GIỐNG ĐẬU XANH VN93 – VÀ VC1973A BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 8/2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành cơng trình nghiên cứu Tôi xin cảm ơn TS Nguyễn Thị Tâm, TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh anh chị Nguyễn Thị Thủy (Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Tế bào), CN Hồng Văn Mạnh (Viện khoa học Sự sống – ĐH Thái Nguyên) giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – Kỹ thuật Nông nghiệp thầy cô giáo, cán khoa Tôi xin cảm ơn Bộ môn hệ thống canh tác – Viện Ngô Trung ương cung cấp giống đậu xanh làm vật liệu nghiên cứu luận văn Tôi xin cảm ơn động viên, khích lệ gia đình, bạn bè suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Tác giả Bùi Hống Xuyến Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4D Axit 2,4 – Dichlorphenoxyacetic ADN Axit deoxyribonucleic AVRDC Trung tõm Nghiờn cứu Phỏt triển rau chõu Á Cs Cộng Hecta NAA Axit naphthyl acetic (Naphthyl acetic acid) NSG Ngày sau gieo Kb Kilobase MS Murashige and Skoog (Môi trường theo Murashige Skoog) PCR Polymerase Chain Reaction RADP Random Amplified polymorphic ADN ( Đa hỡnh cỏc phõn đoạn ADN nhân ngẫu nhiên) TAE Tris acetate EDTA SDS Sodium Dodecyl Sulphat Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Đặc điểm nông học suất hai giống đậu xanh nghiên cứu 17 Bảng 2.2 Trình tự nucleotit 10 mồi RADP sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Độ nước mô sẹo phôi đậu xanh sau sử lý thổi khô (% khối lượng tươi) 26 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót (%) mô sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô tuần nuôi phục hồi 28 Bảng 3.3 Khả tái sinh từ mơ sẹo phơi đậu xanh sống sót sau xử lý thổi khô 30 Bảng 3.4 Mức biến động di truyền quần thể R 0, R1 giống đậu xanh VC1973A 33 Bảng 3.5 Thời gian sinh trưởng phát dục (ngày) 34 Bảng 3.6 Các dòng chọn lọc từ R1 37 Bảng 3.7 Độ tinh hàm lượng ADN mẫu đậu xanh 40 Bảng 3.8 Tổng số phân đoạn ADN nhân mẫu đậu xanh phân tích với 10 mồi ngẫu nhiên 42 Bảng Phân tích đa hình phân đoạn ADN nhân với 10 mồi ngẫu nhiên 43 Bảng 3.10 Hệ số sai khác di truyền dòng chọn lọc giống gốc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Độ nước mô sẹo phôi đậu xanh sau xử lý thổi khô 27 Hình 3.2 Tỷ lệ sống sót (%) mơ sẹo phôi đậu xanh sau thổi khô nuôi phục hồi môi trường tái sinh 28 Hình 3.3 Khả tái sinh mơ sẹo phơi đậu xanh sống sót sau xử lý thổi khô Hình 3.4 Ảnh mơ sẹo xử lý thổi khơ (Giống VC1973A) 30 35 Hình Một số hình ảnh tái sinh sau xử lý thổi khô (Giống VC1973A) 35 Hình 3.6 Một số hình ảnh quần thể R0, R1 đồng ruộng 38 Hình 3.7 Một số hình ảnh dịng tái sinh Quần thể VC1973A đối chứng 38 Hình 3.8 Kết điện di ADN tổng số tách từ mẫu đậu xanh 40 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M1 44 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M2 45 Hình 3.11 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M3 45 Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M5 46 Hình 3.13 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M6 46 Hình 3.14 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M7 47 Hình 3.15 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR- RADP mẫu đậu xanh với Mồi M8 48 Hình 3.16 Sơ đồ hình thể mối quan hệ di truyền dòng chọn lọc giống gốc 49 Hình 3.17 Các dòng đậu xanh ưu việt R1 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Mở đầu 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm sinh học đậu xanh, tình hình sản xuất đậu xanh giới Việt Nam 1.1.1 Đặc điểm sinh học đậu xanh 1.1.2 Tình hình sản xuất đậu xanh giới Việt Nam 1.2 Hạn chế chịu hạn thực vật 1.2.1 Tính chịu hạn tác động hạn đến thực vật 1.2.1.1 Tính chịu hạn thực vật 1.2.1.2 Nguyên nhân gây hạn tác động hạn đến thực vật 1.2.2 Cơ sở sinh lý, hoá sinh sinh học phân tử tính chịu hạn 12 1.2.2.1 Cơ sở sinh lý tính chịu hạn 12 1.2.2.2 Cơ sở sinh hố tính chịu hạn 13 1.2.2.3 Cơ chế phân tử tính chịu hạn 16 1.3 Một số thành tựu nuôi cấy mô tế bào thực vật vào việc đánh giá khả chịu hạn chọn dòng biến dị xoma 18 1.4 Sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) nghiên cứu đa dạng di truyền mức phân tử 19 1.4.1 RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) 19 1.4.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền RAPD 20 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Vật liệu nghiên cứu 23 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 Hóa chất, thiết bị địa điểm nghiên cứu 23 2.2.1 Hóa chất 23 2.2.2 Thiết bị 23 2.2.3 Địa điểm nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 24 2.3.1.1 Tạo mô sẹo từ hạt đậu xanh 24 2.3.1.2 Phƣơng pháp đánh giá khả chịu nƣớc mô sẹo 26 2.3.1.2.1 Phƣơng pháp xử lý mô sẹo thổi khô 26 2.3.1.2.2 Chọn lọc mơ sẹo sống sót sau xử lý thổi khô tái sinh 26 2.3.1.2.3 Tạo hồn chỉnh từ mơ sẹo chọn lọc 27 2.3.1.2.4 Phƣơng pháp 27 2.3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu đồng ruộng 28 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý kết tính tốn số liệu 28 2.3.4 Phuơng pháp sinh học phân tử 28 2.3.4.1 Phƣơng pháp tách chiết ADN tổng số từ đậu xanh 29 2.3.4.2 Phân tích đa hình ADN kĩ thuật RADP 29 2.3.4.3 Phân tích số liệu RADP 30 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 THĂM DÕ KHẢ NĂNG TẠO MÔ SẸO VÀ TÁI SINH CÂY 31 3.2 ĐỘ MẤT NƢỚC VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MẤT NƢỚC CỦA MÔ SẸO PHÔI CÁC GIỐNG ĐẬU XANH 31 3.2.1 Mức độ nƣớc mô sẹo sau xử lý thổi khô 32 3.2.2 Khả chịu nƣớc mô sẹo 33 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2.3 Khả tái sinh từ mơ sẹo sống sót sau xử lý thổi khô 34 3.2.4 Nhận xét khả chịu nƣớc xử lý thổi khô giống đậu xanh nghiên cứu 38 3.3 PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ BIẾN ĐỘNG DI TRUYỀN MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM NÔNG HỌC QUẦN THỂ R0, R1 38 3.4 ĐÁNH GIÁ SỰ THAY ĐỔI ADN GENOME CỦA MỘT SỐ DÕNG ĐẬU XANH CĨ NGUỒN GƠC TỪ MƠ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC 44 3.4.1 Kết tách chiết ADN tổng số 44 3.4.2 Phân tích đa hình ADN kỹ thuật RAPD 46 3.4.2.1 Số phân đoạn, tần số xuất đa hình phân đoạn ADN đƣợc nhân 46 3.4.2.2 So sánh khác dòng chọn lọc so với giống gốc mức độ phân tử 53 3.4.3 Nhận xét kết phân tích đa hình ADN hệ gen dòng đậu xanh nghiên cứu 55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57 CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Cây đậu xanh (Mungbean, Green bean) có tên khoa học Vigna radiata (L.) Wilczek đóng vai trị quan trọng thứ ba sau đậu tương lạc (2 loại công nghiệp ngắn ngày) Theo Trung tâm Nghiên cứu Phát triển rau châu Á (AVRDC), phần ăn hạt đậu xanh chứa khoảng 25,98% protein, 1,3% lipit, 4,79% chất xơ, 64,12% hydratcacbon (trong có 51,8% tinh bột), loại vitamin A, B1, B2, C số nguyên tố khống K, Na, Mg, P, Fe, Ca….[9] Vì hạt đậu xanh sử dụng làm bột dinh dưỡng cho người thức ăn bổ sung cho gia súc Ngoài ra, hạt đậu xanh dùng rộng rãi nhân dân để làm thực phẩm loại bánh (bánh tét, bánh đậu xanh, bánh chưng ), chè, xôi, cháo Đặc biệt hạt đậu xanh dùng để ủ giá sử dụng nhiều nhân dân Không coi nguồn thức ăn mà hạt đậu xanh xem thứ dược liệu có tác dụng giải độc, nhiệt, bớt sưng phù, điều hòa ngũ tạng Giá đỗ thường dùng cho người bị viêm quản tiếng, vận động thể thao bị mỏi cơ, người béo phì, đái tháo đường, bệnh tim mạch, cao huyết áp, nhồi máu tim, cholesterol máu cao, muộn, dễ xảy thai … chữa bệnh cho người Ngoài ra, sản phẩm phụ dùng làm thức ăn cho gia súc Trồng đậu xanh cịn có tác dụng chống xói mịn cải tạo đất Chất lượng protein hạt đậu xanh đánh giá dựa tiêu quan trọng thành phần axit amin protein, họ đậu khác, protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ loại axit amin không thay Nghiên cứu hàm lượng loại axit amin không thay loại axit amin giới hạn protein đạt tiêu chuẩn dinh dưỡng FAO/WHO hướng chiến lược chọn tạo giống đậu xanh chất lượng cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Cây đậu xanh thuộc nhóm trồng chịu hạn trung bình, chịu úng loại trồng có chín khơng tập trung gây khó khăn cho q trình thu hoạch Cùng với nguyên nhân khác nên đậu xanh trồng chưa nhiều nước ta, chủ yếu xen canh, luân canh tăng vụ Chỉ thời gian gần đậu xanh quan tâm phát triển Tuy nhiên, đậu xanh quan tâm trồng chủ yếu tỉnh miền núi, trung du phía Bắc Tây Ngun, nơi có khí hậu khắc nghiệt mà đặc biệt thời gian khô hạn kéo dài nên suất chưa cao Chương trình chọn tạo giống đậu xanh nước ta hướng tới mục tiêu tạo giống đậu xanh khơng có tiềm năng suất cao, ổn định, sinh trưởng mạnh, thời gian sinh trưởng ngắn mà cịn phải chín tập trung, chất lượng hạt cao, có khả chịu hạn, chịu úng, chịu sâu chống bệnh tốt Cho tới nay, việc ứng dụng công nghệ tế bào để nâng cao khả chống chịu trồng tiến hành đạt nhiều thành tựu đáng kể lúa, ngơ, đậu tương nhiên cơng trình tương tự đậu xanh cịn cơng bố Xuất phát từ lý trên, lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: "Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn giống đậu xanh VN93 VC1973A kĩ thuật nuôi cấy in vitro" MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Tạọ dòng đậu xanh tái sinh từ mô sẹo chịu nước xác định thay đổi hệ gen dịng chọn lọc giống gốc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... tương tự đậu xanh cịn cơng bố Xuất phát từ lý trên, lựa chọn đề tài cho luận văn thạc sĩ là: "Tạo vật liệu phục vụ chọn dòng chịu hạn giống đậu xanh VN93 VC1973A kĩ thuật nuôi cấy in vitro" MỤC... thực vật 1. 2.2 Cơ sở sinh lý, hoá sinh sinh học phân tử tính chịu hạn 12 1. 2.2 .1 Cơ sở sinh lý tính chịu hạn 12 1. 2.2.2 Cơ sở sinh hố tính chịu hạn 13 1. 2.2.3 Cơ chế... 1. 2 Hạn chế chịu hạn thực vật 1. 2 .1 Tính chịu hạn tác động hạn đến thực vật 1. 2 .1. 1 Tính chịu hạn thực vật 1. 2 .1. 2 Nguyên nhân gây hạn tác động hạn đến thực vật