ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC    TỐNG THỊ MƠ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SỸ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên, Năm 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC    TỐNG THỊ MƠ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – VI SINH Mã số: 60 42 80 LUẬN VĂN THẠC SỸ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.MAI THỊ HẰNG Thái Nguyên, Năm 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Qua thời gian làm việc học tập Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh hoàn thành công trình: “Nghiên cứu quy trình công nghệ sản suất chế phẩmMultienzym từ nấm mốc đánh giá độ an toàn chúng dùng cho chăn nuôi” Để hoàn thành công trình này, nhận nhiều giúp đỡ, bảo đóng góp ý kiến quý báu từ thầy cô, gia đình bạn đồng nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc Tiến sĩ Mai Thị Hằng, người dạy dỗ trình học tập, người dìu dắt bước đường khoa học sát cánh trình nghiên cứu! Tôi xin chân thành cảm ơn anh chi em môn Vệ sinh Thú y, Viện Thú y trung ương giúp đỡ trình làm thí nghiệm Viện! Tôi chân thành cảm ơn tất anh, chị em phòng Công nghệ Sinh học – Vi sinh giúp đỡ suốt thời gian qua! Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 09 năm 2010 Tống Thị Mơ i Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU i Lý chọn đề tài 2.Mục tiêu nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Nội dung đề tài: CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vai trò enzyme chăn nuôi 1.1 Các enzyme tiêu hóa chủ yếu sử dụng chăn nuôi 1.1.1 a-Amylase 1.1.1.1 Đặc tính enzym α-amylase 1.1.1.2 Cơ chế tác dộng enzym α-amylase 1.1.2 Cellulase 1.1.2.1 Hệ enzyme phân giải cellulose 10 1.1.2.2 Endoglucanase (EC.3.2.1.4,b-Dglucan-glucanolhydrolase hay carboxymethylcellulase viết tắt CMCase) 10 1.1.2.3 Exoglucanase (EC.3.2.1.91 1,4 b - glucan – celobiohydrolase 11 1.1.2.4 b-1,4 glucosidase (EC.3.2.1.21 b-1,4 glucosidase hay cellobiase): 11 1.1.2.5 Exoglucohydrolase (EC.3.2.1.74): 1,4 b -D glucan – glucohydrolase) 12 1.1.3 Xylanase 12 1.1.3.1 Cấu trúc hoá học xylan 12 1.1.3.2 Hệ thống enzyme phân giải xylan hình thành tổ hợp xylanase vi sinh vật 14 1.1.4 Phytase 16 1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng enzyme chăn nuôi 17 Các phương pháp lên men enzyme vi sinh vật 21 2.1 phương pháp lên men chìm 21 ii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2 Phương pháp lên men rắn 22 Ảnh hưởng số yếu tố lên trình sinh tổng hợp enzyme 23 3.1 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng 23 3.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 25 Tính an toàn chế phẩm enzyme từ Aspegillus 26 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1.Vật liệu 29 2.1.1.Chủng vi sinh vật 29 2.1.2 Môi trường sử dụng nghiên cứu 29 2.1.3 Hoá chất 29 2.1.4 Thiết bị 30 2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1 Phương pháp vi sinh 30 2.2.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn tinh bột đến khả sinh amylase chất bã sắn chủng A oryzae NM1 31 2.2.1.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến khả sinh amylase 31 2.2.1.3 Ảnh hưởng nồng độ KNO3 KH2PO4 lên khả sinh amylase 32 2.2.1.4 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh amylase 32 2.2.1.5 Ảnh hưởng pH đến hoạt động amylase 32 2.2.1.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động amylase 33 2.2.1.7 Ảnh hưởng lượng giống (bào tử/g) ban đầu đến khả sinh amylase 33 2.3 Xác định ảnh hưởng H2O2 đến hoạt động amylase 33 2.4 Phương pháp nghiên cứu enzyme 34 2.4.1 Xác định hoạt tinh số loại enzyme thuỷ phân ngoại bào 34 Đánh giá độ an toàn chế phẩm enzyme động vật 40 iii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.1 Đánh giá độ độc cấp tính 40 3.2 Đánh giá độc tính cấp sử dụng enzyme liều cao 7-14 ngày 43 3.3 Đánh giá độc tính chậm sử dụng enzyme liều cao 90 ngày 44 3.4 Tính toán xử lý số liệu 44 3.5 Các phương pháp khác 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Ảnh hưởng yếu tố dinh dưỡng đến sinh tổng hợp amylase 46 3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn tinh bột đến khả sinh amylase chất bã sắn chủng A oryzae NM1 46 3.1.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến khả sinh amylase 48 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh amylase 49 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh amylase 51 3.1.5 Ảnh hưởng pH ban đầu đến khả sinh amylase 52 3.1.6 Ảnh hưởng nồng độ KNO3 KH2PO4 đến khả sinh amylase 53 3.1.7 Ảnh hưởng số lượng bào tử ban đầu đến khả sinh amylase 54 3.2 Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm amylase thô 56 3.3 Phối trộn enzyme thô từ chủng A niger ĐB106 enzyme thô từ chủng A oryzae NM1 60 3.4 Đánh giá độ an toàn chế phẩm enzyme multienzyme động vật 62 3.4.1.Đánh giá cấp độ độc cấp tính 62 a Dị ứng da 62 b Dị ứng mắt 63 c Dị ứng đường thở 63 3.4.2 Đánh giá độc tính cấp chậm 14 ngày 64 3.4.3 Đánh giá độc tính 90 ngày 64 iv Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.4 Kết kiểm tra mẫu máu: Kiểm tra Khoa huyết học Bệnh viện Bạch Mai Hà Nội (Bảng 3.4.4) 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 I KẾT LUẬN 68 II KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 v Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC Carboxyl methyl cellulose CNSH Công nghệ sinh học Cs Cộng DNS Dinitro Salysilic IU International units KLPT Khối lượng phân tử OD Optical Density OSX Oat Spelt Xylan CTM Công thức máu RNM Rừng ngập mặn VSV Vi sinh vật RBC Hồng cầu WBC Bạch cầu PLT Tiểu cầu TN Thí nghiệm MT Môi trường MTCS Môi trường sở DANH MỤC HÌNH Hình Tên hình Trang vi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình Cấu trúc hoá học cellulose Hình Cấu trúc xylan với chuỗi bên 14 Hình Sơ đồ tác động loại enzyme thủy phân xylan trình bày tóm tắt 15 Hình Muối phytate liên kết với ion kim loại protein 16 Hình 2.4 35 Đồ thị tinh bột chuẩn Hình 2.5 Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng D-glucose DNS 37 Hình 2.6 Đồ thị chuẩn D-xylose (Theo phương pháp DNS) 39 Hình 3.1.2 Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến khả sinh amylase 49 Hình 3.1.3 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh amylase 50 Hình 3.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh amylase 52 Hình 3.1.5 Ảnh hưởng pH dịch khoáng ban đầu đến khả sinh amylase 53 Hình 3.2 59 Quy trình sản xuất chế phẩm amylase thô từ A oryzae NM1 vii Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ...    TỐNG THỊ MƠ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MULTIENZYMES TỪ NẤM MỐC VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ AN TOÀN CỦA CHÚNG DÙNG CHO CHĂN NUÔI Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC – VI SINH... gian làm việc học tập Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh hoàn thành công trình: Nghiên cứu quy trình công nghệ sản suất chế phẩmMultienzym từ nấm mốc đánh giá độ an toàn chúng. .. trộn enzyme thô từ chủng A niger ĐB106 enzyme thô từ chủng A oryzae NM1 60 3.4 Đánh giá độ an toàn chế phẩm enzyme multienzyme động vật 62 3.4.1 .Đánh giá cấp độ độc cấp tính