ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ ANH NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ ANH NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC Mã số: 62.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN THỊ TÂM THÁI NGUYÊN - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa công bố Thái Nguyên, tháng năm 2015 Tác giả Trần Thị Anh Xác nhận khoa chuyên môn Người hướng dẫn khoa học PGS.TS Nguyễn Thị Tâm i LỜI CẢM ƠN Trong trình thực luận văn, nhận quan tâm giúp đỡ nhiều cá nhân quan đơn vị Nay luận văn hoàn thành, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành, sâu sắc tới: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm, GS.TS Chu Hoàng Mậu tận tình hướng dẫn, bảo tạo điều kiện giúp đỡ trình nghiên cứu hoàn thành luận văn Trong trình nghiên cứu, nhận giúp đỡ kĩ thuật viên Trần Thị Hồng (Phòng Công nghệ tế bào, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền Sinh học đại, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi để thực trình nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban chủ nhiệm khoa, thầy cô giáo, cán khoa, thầy cô giáo thuộc khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học sư phạm - Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giảng dạy, tạo điều kiện giúp đỡ trình học tập thực luận văn Cuối xin chân thành cảm ơn người thân gia đình bạn bè giúp đỡ động viên suốt thời gian học tập Thái Nguyên, tháng năm 2015 Tác giả Trần Thị Anh ii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung dừa cạn 1.1.1 Nguồn gốc, phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái dừa cạn 1.1.3 Phân bố sinh thái 1.1.4 Kỹ thuật trồng dừa cạn 1.1.5 Ứng dụng dừa cạn y học 1.2 Nhân giống in vitro công nghệ tế bào thực vật 1.2.1 Ưu phương thức nhân giống in vitro 1.2.2 Quy trình nhân giống in vitro 13 1.3 Chất điều hòa sinh trưởng sử dụng nuôi cấy mô thực vật 14 1.3.1 Auxin 14 1.3.2 Cytokinin 16 1.4 Một số nghiên cứu nuôi cấy dừa cạn kĩ thuật nuôi cấy in vitro 17 1.4.1 Tình hình nuôi cấy in vitro dừa cạn giới 17 iii 1.4.2 Tình hình nuôi cấy in vitro dừa cạn Việt Nam 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Vật liệu, hoá chất 22 2.1.1 Vật liệu thực vật 22 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 22 2.1.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Pha môi trường 22 2.2.2 Khử trùng hạt 23 2.2.3 Nghiên cứu môi trường phát sinh chồi sinh trưởng 23 2.2.4 Phương pháp gây tổn thương tạo chồi 24 2.2.5 Nghiên cứu môi trường tạo rễ 24 2.2.6 Nghiên cứu giá thể đưa tự nhiên 25 2.2.7 Xử lí tính toán số liệu 26 2.3 Điều kiện thí nghiệm 26 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết khử trùng hạt 27 3.2 Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách mầm 29 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30 3.2.2 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 32 3.2.3 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 34 3.3 Ảnh hưởng kết hợp BAP NAA, BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên, nách mầm dừa cạn 36 3.3.1 Ảnh hưởng kết hợp BAP NAA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 37 3.3.2 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi tái sinh từ đoạn thân mang mắt chồi bên 39 3.3.3 Ảnh hưởng kết hợp BAP IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi dừa từ nách mầm 41 3.4 Kết tạo đa chồi phương pháp gây tổn thương 44 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA đến khả rễ chồi dừa cạn ống nghiệm 46 3.5.1 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi dừa cạn môi trường MS 46 3.5.2 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn môi trường MS 47 3.5.3 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn môi trường ½ MS 50 3.6 Kết ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng vườn ươm 51 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC DANH MỤC NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine CS : Cộng CT : Công thức ĐC : Đối chứng DNA : Deoxyribonucleic acid HPLC : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid KIN : Kinetin MS : Murashige Skoog, 1962 NAA : Naphthalene acetic acid WHO : Tổ chức y tế giới iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết khử trùng hạt (sau 10 ngày) 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 30 Bảng 3.3 Ảnh hưởng kinetin đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 33 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 35 Bảng 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 38 Bảng 3.6 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 40 Bảng 3.7 Ảnh hưởng kết hợp BAP 0,5mg/l IBA đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 42 Bảng 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương 44 Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ 47 Bảng 3.10 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ 48 Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ dừa cạn (sau tuần) 50 Bảng 3.12 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng dừa cạn (sau 45 ngày) 51 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây dừa cạn Hình 1.2 Hoa ba giống Catharanthus roseus Hình 3.1 Ảnh hưởng thời gian khử trùng đến nảy mầm hạt dừa cạn 28 Hình 3.2 Ảnh hưởng BAP 1,0mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 31 Hình 3.3 Ảnh hưởng kinetin 1,0mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 34 Hình 3.4 Ảnh hưởng BAP 0,5 mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 36 Hình 3.5 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l NAA 0,4mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên (sau tuần) 39 Hình 3.6 Ảnh hưởng kết hợp BAP 1,0mg/l IBA 0,6mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 40 Hình 3.7 Ảnh hưởng kết hợp BAP 0,5mg/l IBA 0,4mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 43 Hình 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương 45 Hình 3.9 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l (sau tuần) 47 Hình 3.10 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l môi trường MS (sau tuần) 49 Hình 3.11 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l môi trường ½ MS (sau tuần) 51 Hình 3.12 Ảnh hưởng giá thể đất hỗn hợp đất thịt + phù sa +cát đến sinh trưởng dừa cạn 52 vi 0,5mg/l + IBA 0,4mg/l + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính 1g/l + nước dừa 100ml/l Chúng lựa chọn công thức tạo để tạo chồi phục vụ trình chuyển gen từ nách mầm A tuần B tuần C 10 tuần Hình 3.7 Ảnh hưởng kết hợp BAP 0,5mg/l IBA 0,4mg/l đến phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 43 3.4 Kết tạo đa chồi phương pháp gây tổn thương Dùng thân dừa cạn bánh tẻ, nuôi cấy in vitro - 10 tuần tuổi, cắt thành đoạn có kích thước 1,0 - 1,5cm mang mắt chồi bên Gây tổn thương ví trí mắt chồi bên cách: (1) dùng dao chẻ dọc qua mắt chồi bên (không làm đứt hoàn toàn mô); (2) dùng đầu mũi châm vào mắt tạo chồi bên Sau đó, ngâm mô gây tổn thương dung dịch MS bổ sung kích thích sinh trưởng nồng độ tối ưu BAP 1,0mg/l, IBA 0,6mg/l 20 phút Sau ngâm 20 phút, nuôi mô lên môi trường đặc BAP 1,0mg/l + IBA 0,6mg/l + MS + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + nước dừa 100 ml/l, để mẫu tối ngày Sau ngày, cấy mẫu lên môi trường tạo chồi tối ưu tìm Kết tạo chồi mô gây tổn thương thể cụ thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương Phương pháp gây tổn thương Tỉ lệ mô sống % Số chồi/mẫu Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi Chất lượng chồi Sau tuần (0) 92,3 ± 0,32 9,13 ± 0,26 1,72 ± 0,21 3,83 ± 0,15 CT (1) 47,3 ± 0,28 9,21 ± 0,37 1,57 ± 0,04 4,22 ± 0,13 CT (2) 56,6 ± 0,33 9,34 ± 0,49 1,54 ± 0,11 4,13 ± 0,11 CT Sau 10 tuần (0) 92,3 ± 0,32 10,2 ± 0,36 3,15 ± 0,16 6,78 ± 0,19 CT (1) 47,3 ± 0,28 11,21 ± 0,37 2,97 ± 0,04 6,32 ± 0,13 CT (2) 56,6 ± 0,33 11,34 ± 0,49 2,89 ± 0,11 6,13 ± 0,11 CT Ghi chú: (0): không gây tổn thương; (1) Chẻ dọc thân qua mắt chồi bên; (2) dùng đầu mũi dao chích vào mắt tạo chồi bên; CT: Chồi tốt Qua bảng 3.8 cho thấy, số chồi/mẫu mô sau gây tổn thương tăng lên Sau gây tổn thương tỉ lệ mô sống giảm so với đối chứng Mẫu không gây tổn thương có số mô sống tạo chồi 92,3% Gây tổn thương cách chẻ 44 dọc đoạn thân qua mắt chồi bên tỉ lệ mô sống tạo chồi đạt 47,3% Nếu gây tổn thương cách châm mũi dao vào mắt tạo chồi bên tỉ lệ mô sống đạt 56,6% Tỉ lệ mô sống tạo tạo cách khác số chồi/mẫu tương đương Nuôi cấy tuần đầu môi trường than hoạt tính Tiếp theo, chuyển cụm chồi sang môi trường có than hoạt tính, quan sát thấy chồi sinh trưởng tốt Kích thước chồi sau 10 tuần nuôi cấy in vitro đạt trung bình xấp xỉ 2,9cm Qua quan sát thực nghiệm nhận thấy, sai khác số lượng kích thước chồi cách gây tổn thương, chồi xanh phát triển tốt Qua thí nghiệm gây tổn thương trên, chọn để phục vụ chuyển gen sử dụng cách Cách gây tổn thương chẻ dọc qua đoạn thân tỉ lệ mô sống thấp hiệu xâm nhập vi khuẩn tốt Gây tổn thương cách châm mũi dao vào mắt chồi bên vết thương mô không sâu chẻ dọc đoạn thân kích thước thân dừa cạn nhỏ vết thương mũi dao kích thích khuẩn xâm nhập tốt A tuần B tuần Hình 3.8 Kết tạo đa chồi sau gây tổn thương 45 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ NAA, IBA đến khả rễ chồi dừa cạn ống nghiệm Kích thích tạo rễ khâu cuối của trình nuôi cấy in vitro Các chồi dừa cạn có chiều cao - 3cm, xanh, chồi sinh trưởng phát triển bình thường chuyển sang môi trường rễ để hoàn thiện trình nhân giống in vitro Chất kích thích sinh trưởng cảm ứng rễ sử dụng IBA NAA, môi trường MS ½MS 3.5.1 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi dừa cạn môi trường MS NAA chất kích sinh trưởng thuộc nhóm auxin NAA đưa vào môi trường nuôi cấy thúc đẩy sinh trưởng giãn nở tế bào, tăng cường trình sinh tổng hợp trao đổi chất, kích thích hình thành rễ [5] Đây giai đoạn quan trọng, định thành công trình nuôi cấy in vitro Chồi dừa cạn phải có rễ có khả tự hút chất dinh dưỡng môi trường tự nhiên để sinh trưởng phát triển Chồi dừa cạn nuôi cấy môi trường bổ sung kích thích sinh trưởng NAA nồng độ 0,1mg/l; 0,2mg/l, 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l sau tuần nuôi cấy thu kết bảng 3.9 Qua bảng 3.9 cho thấy, môi trường bổ sung NAA có tỉ lệ chồi rễ số rễ/chồi tăng so với công thức đối chứng Số lượng rễ sau tuần tuổi môi trường bổ sung NAA 0,1mg/l; 0,2mg/l, 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0 mg/l tương ứng: 6,64; 9,27; 8,15; 7,53; 6,12, chiều dài rễ: 1,64; 2,21; 1,97; 1,86; 1,83cm Công thức cho số lượng rễ nhiều NAA 0,2mg/l đạt 9,27rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 2,21cm Khi bổ sung NAA 0,1mg/l; 0,2mg/l, 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l cảm ứng tạo rễ tương ứng đạt 85,6; 88,4; 86,9; 84,4; 83,1%, môi trường đối chứng tỉ lệ rễ đạt 25,88% Tại nồng độ NAA 0,2mg/l tỉ lệ phần trăm rễ đạt 88,4%, công thức bổ sung tăng nồng độ NAA lên 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l giá trị trung bình tiêu giảm dần 46 Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ Nồng độ NAA (mg/l) Tỉ lệ chồi rễ (%) 25,88 ± 0,18 Số rễ /chồi Chiều dài rễ (cm) Chất lượng rễ 4,36 ± 0,37 0,31 ± 0,20 RK 0,1 85,6 ± 0,22 6,64 ± 0,39 1,64 ± 0,18 RTB 0,2 88,4 ± 0,16 9,27 ± 0,43 2,21 ± 0,16 RTB 0,3 86,9 ± 0,23 8,15 ± 0,43 1,97 ± 0,15 RTB 0,5 84,4 ± 0,13 7,53 ± 0,36 1,86 ± 0,11 RTB 1,0 83,1 ± 0,19 6,12 ± 0,32 1,83 ± 0,15 RTB Chú thích: RK: Rễ Kém; RTB: Rễ trung bình Hình 3.9 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l (sau tuần) Tuy nhiên, đánh chung quan sát thực nghiệm sử dụng chất kích thích sinh trưởng NAA, chất lượng rễ dừa cạn không tốt, rễ không dài, nhiều rễ con, rễ xốp trắng Để tiếp tục so sánh khả tạo rễ chất lượng rễ tiếp tục thăm dò với chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin IBA 3.5.2 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn môi trường MS IBA chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin IBA có tác dụng tạo rễ nuôi cấy in vitro nhiều đối tượng thực vật [1], [2] Đối với dừa cạn, chồi dừa cạn có kích thước - 3cm cấy chuyển sang môi trường rễ, môi trường bổ sung IBA với nồng độ khác 47 Theo nghiên cứu Mohammed F CS (2011), Agnieszka Pietrosiuk (2007), IBA có ảnh hưởng tích cực đến khả tạo rễ chồi dừa cạn so với NAA, tiêu tỷ lệ % chồi tạo rễ, số rễ/chồi chiều dài rễ cao môi trường bổ sung NAA Chúng nghiên cứu môi trường rễ sử dụng chất kích thích sinh trưởng IBA, kết cụ thể sau tuần nuôi cấy bảng 3.10 Bảng 3.10 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ Nồng độ Tỉ lệ chồi rễ Số Chiều dài rễ IBA (mg/l) (%) rễ/chồi (cm) 25,88 ± 0,18 4,36 ± 0,37 0,31 ± 0,20 RK 0,1 90,1 ± 0,12 8,31 ± 0,39 2,94 ± 0,25 RT 0,2 96,4 ± 0,13 15,6 ± 0,48 3,21 ± 0,21 RT 0,3 92,3 ± 0,15 13,23 ± 0,46 3,07 ± 0,17 RT 0,5 90,3 ± 0,11 10,72 ± 0,36 2,86 ± 0,21 RT 1,0 91,2 ± 0,17 9,13 ± 0,32 2,73 ± 0,28 RT Chất lượng rễ Chú thích: RT: Rễ tốt So sánh kết bảng 3.9; 3.10 cho thấy, tỉ lệ chồi phát sinh rễ dừa cạn môi trường bổ sung IBA cao môi trường bổ sung NAA Các công thức thăm dò môi trường bổ sung IBA tỉ lệ chồi rễ 90% Tỉ lệ rễ nồng độ IBA tương ứng 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0mg/l 90,1; 96,4; 92,3; 90,3; 91,2 % Tỉ lệ % rễ cao nồng độ IBA 0,2mg/l đạt 96,4% Tỉ lệ % rễ giảm dần nồng độ IBA tiếp tục tăng Chỉ tiêu quan trọng đánh giá môi trường tạo rễ thích hợp số rễ/chồi Từ bảng 3.9; 3.10 cho thấy, môi trường bổ sung IBA đạt kết cao so với môi trường bổ sung NAA Cụ thể, môi trường IBA với dải nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0mg/l, số rễ/chồi tương ứng là: 8,31; 15,6; 13,23; 10,72; 9,13 Số lượng rễ/chồi cao đạt 15,6 môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l Trên môi trường bổ sung NAA 0,2mg/l, số rễ/chồi lớn đạt 9,27 Tỉ lệ 48 giảm nồng độ IBA tăng lên 0,3; 0,5; 1,0 mg/l Số lượng rễ cao lượng rễ phụ lại sử dụng chất kích thích sinh trưởng NAA Hình 3.10 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l môi trường MS (sau tuần) So sánh chiều dài rễ môi trường bổ sung IBA kích thước lớn hơn môi trường NAA Nếu kích thước rễ môi trường bổ sung NAA tối đa đạt 2,21cm, môi trường có bổ sung chất kích thích IBA chiều dài tối thiểu đạt 2,73cm tối đa đạt 3,21cm Chất lượng rễ tốt dài, bóng, không xốp, đáp ứng yêu cầu rễ, rễ khỏe đâm sâu lan rộng để hút chất dinh dưỡng Theo quan sát thực nghiệm chất lượng rễ dừa cạn nuôi cấy môi trường bổ sung IBA tốt NAA Qua khảo sát chất kích thích sinh trưởng NAA, IBA nhóm auxin thấy môi trường MS bổ sung IBA 0,2 mg/l + đường sucrose 30 g/l + agar 8,5g/l + than hoạt tính1g/l thích hợp để tạo rễ cho chồi dừa cạn ống nghiệm 49 3.5.3 Ảnh hưởng IBA đến khả rễ chồi dừa cạn môi trường ½ MS Theo kết nhiều công trình nghiên cứu, môi trường ½MS môi trường rễ lí tưởng loại nuôi cấy in vitro Đối với dừa cạn, theo công trình nghiên cứu Mohammed F CS (2011), Kumar A CS (2013), môi trường rễ dừa cạn hiệu môi trường ½ MS Trên môi trường MS, IBA cảm ứng tốt trình rễ dừa cạn Chúng lặp lại thí nghiệm với kích thích sinh trưởng môi trường ½MS Chồi dừa cạn có kích thước - 3cm, cấy chồi môi trường ½MS bổ sung IBA tương ứng với nồng độ 0,1mg/l; 0,2mg/l; 0,3mg/l; 0,5mg/l; 1,0mg/l sau tuần nuôi cấy thu kết sau: Bảng 3.11 Ảnh hưởng IBA đến khả tạo rễ dừa cạn (sau tuần) Nồng độ Tỉ lệ chồi rễ Số Chiều dài rễ IBA (mg/l) (%) rễ/chồi (cm) 0,1 96,2 ± 0,45 13,31 ± 0,35 3,34 ± 0,18 RT 0,2 99, ± 0,14 17,3 ± 0,38 4,23 ± 0,23 RT 0,3 97,3 ± 0,15 14,3 ± 0,23 3,61 ± 0,17 RT 0,5 95,33 ± 0,25 12,2 ± 0,36 3,46 ± 0,15 RT 1,0 95,33 ± 0,33 12,13 ± 0,21 3,23 ± 0,22 RT Chất lượng rễ Chú thích: RT: Rễ tốt Qua bảng số liệu 3.11, so sánh chất lượng rễ dừa cạn tạo môi trường ½MS cho thấy, số lượng rễ/chồi chất lượng rễ tốt rễ môi trường MS nồng độ chất kích tương ứng Tỉ lệ rễ, số lượng rễ, chiều dài rễ đạt tối đa môi trường ½MS + IBA 0,2mg/l Tỉ lệ rễ đạt 99,6%, số lượng đạt 17,3 rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 4,23cm Rễ dài, bóng khỏe Trong phạm vi thí nghiệm quan sát thực nghiệm lựa chọn môi trường ½MS + IBA 0,2mg/l + đường sucrose 30g/l + agar 8,5g/l + 1g/l than hoạt tính môi trường tối ưu rễ ống nghiệm dừa cạn 50 Hình 3.11 Rễ dừa cạn môi trường bổ sung IBA 0,2mg/l môi trường ½ MS (sau tuần) 3.6 Kết ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng vườn ươm Chọn dừa cạn sau nuôi cấy in vitro có rễ dài, khỏe, xanh, thời kì sung sức để đưa môi trường tự nhiên Tiêu chuẩn con: kích thước khoảng 5- 6cm, rễ dài khoảng - 4,5cm, số đạt 8- 10 Lựa chọn giá thể phù hợp để vườn ươm khâu phải thực tỉ mỉ thận trọng Giá thể phù hợp giá thể cho tỉ lệ sống cao, sinh trưởng, phát triển tốt Tuy nhiên, dừa cạn tự nhiên thích hợp với môi trường đất pha cát [8], [11], nên thử nghiệm loại giá thể kết tỉ lệ sống sinh trưởng sau 45 ngày sau: Bảng 3.12 Ảnh hưởng giá thể đến tỉ lệ sống sinh trưởng dừa cạn (sau 45 ngày) Công thức Tỉ lệ sống Chiều cao Giá thể (%) (cm) Đất thịt trung bình 83,8 ± 0,12 6,38 ± 0,16 Đất thịt trung bình + Cát (2:1) 97,2 ± 0,21 9,04 ± 0,11 Đất thịt + phù sa +cát 96,3 ± 0,13 8,97 ± 0,15 1(ĐC) 51 Với môi trường đất thịt tỉ lệ sống trung bình đạt 83%, chiều cao ban đầu mang trồng trung bình đạt khoảng 5cm, sau 45 ngày chiều cao thay đổi không đáng kể đạt khoảng 6,38 kích thước nhỏ, gầy Đối với đất pha cát tỉ lệ sống cao đạt 97,2%, tăng trưởng nhanh sau 45 ngày chiều đạt 9,04cm Lá to, xanh thẫm, thân mập Khi loại đất hỗn hợp đất thịt, phù sa, pha cát, loại đất tơi xốp, sinh trưởng nhanh, mập, tỉ lệ sống đạt 96,3% Kiểm tra ngẫu nhiên chiều cao 30 sau 45 ngày đạt 8,97cm Quá trình phạm vi thí nghiệm giá thể khác nhận thấy dừa cạn thích hợp với loại đất pha cát (2:1), loại đất tơi xốp (đất thịt + phù sa + cát), đất có khả giữ ẩm, cho tỉ lệ sống cao khả sinh trưởng phát triển tốt A 45 ngày B 60 ngày C 90 ngày Hình 3.12 Ảnh hưởng giá thể đất hỗn hợp đất thịt + phù sa +cát đến sinh trưởng dừa cạn 52 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.Kết luận 1.1 Khử trùng hạt dừa cạn cồn 700 thời gian phút, dung dịch javen 60% thời gian 15 phút cho hiệu cao 1.2 Môi trường MS bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; than hoạt tính 1g/l; BAP 1,0mg/l IBA 0,6mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho phát triển chồi sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên 1.3 Môi trường MS có bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; than hoạt tính 1g/l; BAP 0,5mg/l IBA 0,4mg/l; nước dừa 100ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm 1.4 Phương pháp gây tổn thương trình tạo đa chồi phục vụ chuyển gen là: chẻ dọc qua đoạn thân mang mắt chồi bên gây tổn thương mũi dao 1.5 Môi trường ½ MS có bổ sung sucrose 30g/l; agar 8,5g/l; IBA 0,2mg/l; than hoạt tính 1g/l; pH = 5,8 thích hợp cho rễ chồi dừa cạn in vitro 1.6 Giá thể thích hợp cho dừa cạn sinh trưởng giai đoạn vườn ươm đất thịt trung bình + cát theo tỉ lệ 2:1 (hoặc dạng đất tơi xốp có khả giữ ẩm) Đề nghị 2.1 Cần tiến hành thí nghiệm kiểm tra sai khác DNA trồng hạt nuôi cấy in vitro, qua giúp khẳng định tính ổn định mặt di truyền dừa cạn nuôi cấy in vitro 2.2 Thí nghiệm kết hợp BAP IBA kết tạo chồi đạt tốt nhất, số lượng chồi nhiều, sinh trưởng chậm đề nghị nghiên cứu thêm phương pháp kéo dài chồi để rút ngắn thời gian thí nghiệm 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải tiến giống trồng, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thị Thúy Hà (2003), Giáo trình Công Nghệ Sinh học, Nxb Nông Nghiệp Hà Nội Võ Văn Chi (1997), Từ điển thuốc Việt Nam, Nxb Y học Đào Hùng Cường, Lê Xuân Văn (2011), “Nghiên cứu chiết tách alkaloid rễ dừa cạn hoa hồng Bình Định”, Tạp chí khoa học Công nghệ Đại học Đà Nẵng, Số (43), tr 85 - 92 Nguyễn Như Khanh, Nguyễn Văn Đính (2011), Giáo trình chất điều hòa sinh trưởng thực vật, Nxb Giáo dục Việt Nam Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Bùi văn Lệ , Nguyễn Ngọc Hồng (2006), “Ảnh hưởng chất điều hòa tăng trưởng thực vật đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn Catharanthus roseus”, Tạp chí phát triển KH&CN-ĐHQG HCM, 9(6), tr 59 - 66 Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, Nxb Nông Nghiệp 10 Nguyễn Hải Tuất, Ngô Kim Khôi (1996), Xử lí thống kê kết nghiên cứu thực nghiệm nông lâm ngư nghiệp máy vi tính, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 11 Viện dược liệu (2013), Kỹ thuật trồng thuốc, Nxb Nông nghiệp 12 Viện dược liệu (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, Tập 1, Nxb Y học 54 13 Nguyễn Văn Vinh (2010), “Khảo sát số hợp chất alkaloid có hoạt tính sinh học dừa cạn (Catharanthus roseus)”, Tạp chí Khoa học Công nghệ - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Số 1, tr 81- 86 14 Đỗ Năng Vịnh, Ngô Xuân Bình (2008), Giáo trình công nghệ sinh học đại cương, Nxb Nông nghiệp Hà Nội Tài liệu tiếng Anh 15 Agnieszka Pietrosiuk, Mirosława Furmanowa, Barbara Łata (2007), “Catharanthus roseus: micropropagation and in vitro techniques”, Phytochemistry Reviews, vol 6(2-3), pp 459-473 16 Felipe Vázquez - Flota (2008), “Vindoline formation in shoot cultures of Catharanthus roseus is synchronously activated with morphogenesis through the last biosynthetic step”, Annals of Botany,102, pp 409-415 17 Kumar A , Prakash K , Sinha RK , Kumar N.( 2013), “ In vitro plant propagation of Catharanthus roseus and assessment of genetic fidelity of micropropagated plants by marker assay”, Appl Biochem Biotechnol, vol 169(3), pp 894-900 18 Larraburu E.E., Apostolo N.M., Llorente B.E (2012) “In vitro propagation of Pink Lapacho: mesponse murface methodology and factorial analysis for optimisation of medium components” Int J Fores Res., vol 2012, Article ID 318258, pages 19 Mohammed Faheem, Satyapal Singh, Babeet Singh Tanwer, Moinuddin Khan and Anwar Shahzad (2011) “In vitro regeneration of multiplication shoots in Catharanthus roseus - An important medicinal plant”, Pelagia Research Library, vol 2(1), pp 208-213 20 Mohsen Zargar, Tahereh Nabavi, Farah Farahaniand (2010) , “Hairy roots production of transgenic Catharanthus roseus (L) plants with Agrobacterium rhizogenes under in vitro conditions”, Journal of Medicinal Plants Research, vol 4(21), pp 2199 - 2203 55 21 Parida R., Mohanty S., Kuanar A., Nayak S (2010) “Rapid multiplication and in vitro production of leaf biomass in Kaempferia galanga through tissue culture” Electron J Biotechnol, vol.13(4), pp - 22 Taha, H S.; El-Bahr, M K.; Seif-El-Nasr, M M (2009), “In vitro studies on Egyptian Catharanthus roseus (L.) G Don IV: Manipulation of some amino acids as precursors for enhanced of indole alkaloids production in suspension cultures”, Australian Journal of Basic & Applied Sciences, vol 3(4), pp 3137-3144 Tài liệu trang web 23 http://www.cpv.org.vn/cpv/Modules/News/NewsDetail.aspx Khơi.dậy tiềm lớn từ dược liệu Việt Nam, tác giả: Vũ Trang 24 http://www.duoclieu.org/2012/04/dua-can-cathranthus-roseus-l-g-don.html 25 http://suckhoedoisong.vn/y-hoc-co-truyen/dua-can-vi-thuoc-quy-.htm, tác giả: Lương y Thanh Ngọc 26 http://www.uphcm.edu.vn/caythuoc/index.phpq=node/195 27 http://vietnamnet.vn/vn/xa-hoi/102565/sung-sot-vi-benh-nhan-ung-thutang- nhanh.html, tác giả: Cẩm Quyên 28 http://ykhoa.net/yhoccotruyen/baiviet/29_261.htm/Cây.dừa.cạn,.nguyên liệu chế tạo thuốc trị ung thư, tác giả: GS Ðoàn Thị Nhu 56 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường MS STT Thành phần Nồng độ( mg/l) MS1 1 10 11 12 13 14 15 16 17 18 CaCl-2.2H2O KH2PO KNO NH4NO MgSO 4.7H2O H3BO3 ZnSO 4.7H2O MnSO 4.4H2O CoCl2.6H2O KI CuSO 4.5H2O Na2MoO 4.2H2O FeSO 4.7H2O Na2EDTA 440 MS2 170 1900 370 1650 MS3 6,2 8.6 22,3 0,025 0,83 0,025 0,25 MS4 27,8 37,3 MS5 Pirydoxine Thiamin HCl Nicotinic acid(P.P) Myo-inositol glycine 0,5 0,1 0,5 100 ... roseus (L.) G Don) phục vụ chuyển gen Mục tiêu nghiên cứu Tìm môi trường thích hợp cho tái sinh dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) phục vụ chuyển gen Nội dung nghiên cứu (1) Nghiên cứu khử trùng...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TRẦN THỊ ANH NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG TÁI SINH CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON) PHỤC VỤ CHUYỂN GEN Chuyên ngành: DI TRUYỀN HỌC... thăm dò môi trường tối ưu cho hệ thống tái sinh dừa cạn để phục vụ chuyển gen hiệu 19 1.4.2 Tình hình nuôi cấy in vitro dừa cạn Việt Nam Hiện nay, Việt Nam công trình nghiên cứu nuôi cấy dừa cạn