Header Page of 166 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng năm 2011 Footer Page of 166 Header Page of 166 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Giảng viên hướng dẫn : Th.s LÊ ĐÌNH ĐỨC Sinh viên thực hiện: LÊ THANH HUÂN Lớp : 49 CNSH Khoá : 49 Nha Trang, tháng năm 2011 Footer Page of 166 Header Page of 166 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học Môi trường, trường Đại học Nha Trang quan tâm, bảo giảng dạy nhiệt tình, giúp cho có kiến thức quý báu suốt thời gian học tập trường Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Lê Đình Đức, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học môi trường, trường Đại học Nha Trang định hướng, dìu dắt tận tình hướng dẫn suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, tạo điều kiện thời gian để hoàn thành đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến bạn sinh viên lớp 49SH, toàn thể bạn sinh viên thực tập phòng thí nghiệm nhiệt tình giúp đỡ Cuối cùng, bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, người quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời chỗ dựa tinh thần lớn giúp hoàn thành tốt công việc giao suốt thời gian học tập thực đồ án vừa qua Nha Trang, tháng năm 2011 Sinh viên Lê Thanh Huân GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page of 166 ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ vii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT viii LỜI MỞ ĐẦU 1.1.1 Giới thiệu vê Probiotics 1.1.2 Cơ chế tác động probiotic 1.1.2.1 Sản sinh chất ức chế 1.1.2.2 Cạnh tranh chất, lượng với vi khuẩn khác 1.1.2.3 Cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh 1.1.2.4 Tăng cường đáp ứng miễn dịch 1.1.2.5 Cải thiện chất lượng nước 1.1.3 Ứng dụng probiotic 1.1.3.1 Ứng dụng chế phẩm Probiotic y học, trồng trọt, bảo vệ môi trường 1.1.3.2 Ứng dụng chế phẩm Probiotic nuôi trồng thủy sản 1.1.4 Công nghệ sản xuất chế phẩm probiotics 11 1.1.4.1 Nguyên liệu 12 1.1.4.2 Nhân giống 12 1.1.4.3 Thu sinh khối 12 1.1.4.4 Tạo chế phẩm 12 1.1 Tổng quan cá chim vây vàng 14 1.2.1 Giới thiệu chung cá chim vây vàng 14 1.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng giới nước 15 1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng giới 15 1.2.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng Việt Nam 16 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page of 166 iii 1.2.3 Tình hình bệnh dịch cá nuôi nước mặn nói chung cá chim vây vàng nói riêng 17 1.2.3.1 Bệnh nấm, ký sinh trùng 17 1.2.3.2 Bệnh virus 18 1.2.3.3 Bệnh vi khuẩn 18 1.2 Tổng quan vi khuẩn lactic 20 1.3.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 20 1.3.1.1 Giới thiệu chung 20 1.3.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic 22 1.3.1.2.1 Lên men đồng hình 22 1.3.1.2.1 Lên men dị hình 23 1.3.2 Giới thiệu giống Lactobacillus 23 1.3.2.1 Giống Lactobacillus – đặc tính vi khuẩn probiotic 24 1.3.2.2.1 Khả sinh chất kháng khuẩn đối kháng với vi khuẩn gây bệnh 24 1.3.2.2.3 Khả chịu mặn 25 1.3.2.2.4 Khả tồn đường tiêu hóa 25 1.3.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới phát triển vi khuẩn lactic nói chung Lactobacillus nói riêng 26 1.3.2.1.1 Ảnh hưởng chất dinh dưỡng 26 13.2.2.2 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy 29 1.3.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Lactobacillus bổ sung vào chế phẩm probiotic nuôi trồng thủy sản 30 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.1 Mẫu cá 33 2.1.2 Môi trường nghiên cứu 33 2 Nội dung nghiên cứu 35 Hình 2.1:Sơ đồ cách tiếp cận nội dung nghiên cứu đề tài 35 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page of 166 iv Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1 Phương pháp phân lập, tuyển chọn 36 2.3.1.1 Phân lập Lactobacillus 36 2.3.1.2 Nuôi cấy bảo quản chủng Lactobacillus 36 2.3.1.3 Tuyển chọn chủng Lactobacillus kháng Vibrio 37 2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái đặc tính sinh hóa 38 2.3.2.1 Quan sát đặc điểm hình thái 38 2.3.2.1.1 Quan sát tế bào vi khuẩn kính hiển vi 38 2.3.2.1.2 Nhuộm Gram 38 2.3.2.2 Quan sát đặc tính sinh hóa 39 2.3.2.2.1 Khả sinh acid lactic 39 2.3.2.2.2 Phản ứng catalase 40 2.3.2.2.3 Khả di động 40 2.3.2.2.4 Khả sử dụng loại đường: 41 2.3.3 Xác định điều kiện nuôi cấy 41 2.3.3.1 Xác định khả sinh trưởng 41 2.3.3.2 Xác định nhiệt độ thích hợp 42 2.3.3.3 Xác định thời gian nuôi cấy 42 2.3.3.4 Xác định pH thích hợp 42 2.3.4 Xác định đặc tính probiotic 42 2.3.4.1 Xác định khả sinh enzyme tiêu hóa 42 2.3.4.2 Xác định khả chịu mặn 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết phân lập tuyển chọn 44 3.1.1 Phân lập Lactobacillus từ nội tạng cá chim vây vàng 44 3.1.2 Kết tuyển chọn chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng Vibrio 44 3.2 Đặc điểm hình thái đặc điểm sinh hóa 46 3.2.1 Đặc điểm hình thái 46 3.2.1.1 Đặc điểm hình thái chủng L1.2 46 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page of 166 v 3.2.1.2 Đặc điểm hình thái chủng L1.3 48 3.2.2 Đặc điểm sinh hóa 51 3.3 Đặc tính nuôi cấy đặc tính probiotic 52 3.3.1 Đường cong sinh trưởng chủng L1.2 L1.3 52 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng L1.2 L1.3 54 3.3.3 Thời gian nuôi cấy 55 3.3.4 pH nuôi cấy 56 3.3.5 Khả chịu mặn hai chủng L1.2 L1.3 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 Kết luận 59 Kiến nghị 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page of 166 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hoạt tính kháng chủng Vibrio chủng Lactobacillus môi trường MRS, nhiệt độ 37oC 45 Bảng 3.2: Kết thử đặc tính hai chủng L1.2 L1.3 52 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page of 166 vii DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 : Cá chim vây vàng 14 Hình 3.1: Khả đối kháng chủng Vibrio (V 2.1, V 2.2, V 2.3, V 2.4, C1, C7 C23) chủng Lactobacillus môi trường MRS, xác định đường kính vòng kháng khuẩn (D-d) sau 1-2 ngày nuôi 37oC 45 Hình 3.2: Vòng kháng Vibrio chủng Lactobacillus lựa chọn sau 24h nuôi cấy môi trường MRS, lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ 28 - 30oC 46 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.2 sau 24h môi trường MRS nuôi 340C 47 Hình 3.4: Hình thái tế bào chủng L1.2 soi tươi vật kính 100X 47 Hình 3.5: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.2 48 Hình 3.6: Hình thái khuẩn lạc chủng L1.3 sau 24h môi trường MRS nuôi 340C 49 Hình 3.7: Hình thái tế bào chủng L1.3 soi tươi vật kính 100X 49 Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 50 Hình 3.9: Khả di động chủng L1.2 L1.3 51 Hình 3.10: Khả lên men loại đường chủng L1.2 L1.3 51 Hình 3.11: Mối tương quan thời gian OD600 nm chủng L1.2 53 Hình 3.12: Mối tương quan thời gian OD600 chủng L1.3 53 Hình 3.13 : Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng phát triển chủng L1.2 L1.3 55 Hình 3.14: Mối tương quan thời gian nuôi cấy mật độ tế bào sống hai chủng L1.2 L1.3 OD600 nm 56 Hình 3.15: Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng phát triển chủng L1.2 L1.3 57 Hình 3.16: Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến phát triển chủng L1.2 L1.3 58 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 10 of 166 viii KÍ HIỆU CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 10 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 60 of 166 50 Hình 3.8: Hình ảnh nhuộm gram chủng L1.3 Kết nuôi cho thấy: Chủng L1.3 có khuẩn lạc tròn, có màu trắng đục sữa, bề mặt trơn bóng, kích thước khuẩn lạc sau 24 nuôi cấy khoảng 2,2 mm Chủng L1.3 Tế bào có dạng hình que dài 1-2μm, đứng đơn, xếp đôi, tạo chuỗi, bắt màu tím thuốc nhuộm gram Kết luận chủng L1.3 trực khuẩn, gram dương GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 60 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 61 of 166 51 3.2.2 Đặc điểm sinh hóa Song song với thí nghiệm xác định đặc điểm hình thái chủng, đồng thời tiến hành kiểm tra khả sinh axit lactic, khả tạo catalase, khả di động chủng L1.2 L1.3 Thử catalase cách nhỏ H2O2 vào khuẩn lạc, không thấy sủi bọt catalase âm tính Thử khả sinh axit lactic phương pháp cho tạo phức với phenol Kiểm tra khả di động phương pháp cấy đâm sâu môi trường thạch đứng Kết thử nghiệm khả di động thể hình 3.9; hình 3.10 khả lên men lọai đường bảng 3.2: L1.2 L1.3 Hình 3.9: Khả di động chủng L1.2 L1.3 L1.2 L1.3 Hình 3.10: Khả lên men loại đường chủng L1.2 L1.3 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 61 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 62 of 166 52 Bảng 3.2: Kết thử đặc tính hai chủng L1.2 L1.3 Chủng L1.2 L1.3 Khả sinh axit lactic + + Gram + + Khả di động - - Hoạt tính catalase - - Khả sử dụng đường + + Tinh bột 0 Kết thí nghiệm cho thấy L1.2 L1.3: vi khuẩn có sinh axit lactic, gram dương, catalase âm tính, không di động, không tạo bào tử Theo khóa phân loại Bergey kết luận chủng L1.2 L1.3 vi khuẩn lactic Hai chủng L1.2 L1.3 lựa chọn đem thí nghiệm 3.3 Đặc tính nuôi cấy đặc tính probiotic 3.3.1 Đường cong sinh trưởng chủng L1.2 L1.3 Xác định đường cong sinh trưởng chủng giúp ta kiểm soát trình nuôi cấy xác định thời gian thích hợp cho trình thu sinh khối Chúng tiến hành xác định đường cong sinh trưởng môi trường MRS lỏng, pH 6,5 nhiệt độ nuôi cấy 370C ± Được xác định đến 30h, 3h lấy mẫu lần đo OD GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 62 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 63 of 166 53 a)Chủng L1.2 OD (600 nm) 2.5 2.43 2.46 2.44 2.42 2.35 2.41 2.31 2.13 1.5 1.71 0.83 0.34 0.5 0 10 15 20 25 30 35 Time (h) Hình 3.11: Mối tương quan thời gian OD600 nm chủng L1.2 Nhìn vào hình 3.11 thấy chủng L1.2 đạt đến pha cân 18h Mật độ tế bào đạt giá trị lớn 21 – 24h Ở 27h – 30h tế bào bắt đầu già chết dần Nhự ta thu sinh khối 21 – 24h b)Chủng L1.3 O D (600) 2.5 2.45 2.47 2.5 2.53 2.23 2.51 2.49 2.41 1.88 1.5 1.03 0.5 0.47 0 10 15 20 Time (h) 25 30 35 Hình 3.12: Mối tương quan thời gian OD600 chủng L1.3 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 63 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 64 of 166 54 Nhìn vào hình 3.12 thấy chủng L1.3 đạt đến pha cân 15h Mật độ tế bào đạt giá trị lớn 18h – 21h Ở 27h – 30h tế bào bắt đầu già chết dần Như ta thu sinh khối 18 – 21h Qua kết thấy chủng bỏ qua giai đoạn thích ứng Điều dễ giải thích môi trường hoạt hóa giống không khác nhiều với môi trường lên men Giai đoạn phát triển logarit ngắn, điều có lợi cho trình sản xuất thu sinh khối, rút ngắn thời gian lên men Giai đoạn cân dài chứng tỏ chủng có khả trì phát triển tốt Điều thuận lợi cho trình sản xuất xử lý thu sinh khối 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển chủng L1.2 L1.3 Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn hoạt động sống vi sinh vật Ở nhiệt độ thấp kéo dài thời gian sinh trưởng kéo dài thời gian thu sinh khối Còn nhiệt độ cao chủng bị ức chế Với mục đích thu sinh khối lớn thời gian ngắn ta cần tìm nhiệt độ tối thích cho chủng phát triển đạt yêu cầu mong muốn nhà sản xuất Để tìm khoảng nhiệt độ tối thích tiến hành lên men môi trường MRS lỏng khoảng nhiệt độ khảo sát là: 300C; 340C; 370C 400C Với pH 6,5 Kết đo sinh khối phương pháp đo mật độ quang OD bước sóng λ = 600nm Kết trình bày hình 3.13: GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 64 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 65 of 166 55 OD 600 nm L1.2 2.5 L1.3 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 Nhiệt độ Hình 3.13 : Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên sinh trưởng phát triển chủng L1.2 L1.3 Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến phát triển hai chủng L1.2 L1.3, hai chủng vi khuẩn ưa ấm Đối với chủng L1.2 nhiệt độ tối thích cho phát triển chủng 35 -370C mạnh 370C , nhiệt độ từ 37 – 40oC chủng bị ức chế nhiệt độ Do để đáp ứng mục tiêu sản xuất sinh khối chọn nhiệt độ 370C làm nhiệt độ thích hợp cho chủng L1.2 phát triển Chủng L1.3 phát triển tốt 33 - 350C mạnh 340C, sau 350C chủng L1.3 phát triển dần Chúng chọn nhiệt độ 340C cho mục tiêu sản xuất thu sinh khối chủng L1.3 3.3.3 Thời gian nuôi cấy Trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm việc xác định thời điểm thu nhận sinh khối có vai trò quan trọng, ý nghĩa việc rút ngắn thời gian sản xuất mà ảnh hưởng tới chất lượng chế phẩm sau Việc nghiên cứu thời gian nuôi cấy thực môi trường MRS với tỷ lệ tiếp giống 10% Thực GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 65 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 66 of 166 56 trình nuôi cấy tĩnh tủ ấm, chủng L1.2 nuôi 370C chủng L1.3 nuôi 340C , theo dõi kết đo OD600nm sau thời gian từ 8h đến 40h OD 600 nm 2.5 L1.2 1.5 L1.3 0.5 0 10 20 30 40 50 Time (h) Hình 3.14: Mối tương quan thời gian nuôi cấy mật độ tế bào sống hai chủng L1.2 L1.3 OD600 nm Kết nghiên cứu cho thấy chủng L1.2 phát triển cho sinh khối lớn khoảng từ 24 - 28 h nuôi cấy, chủng L1.3 cho sinh khối lớn khoảng thời gian từ 20 – 24h nuôi cấy Thời gian chậm so với đường cong sinh trưởng khoảng 3h nuôi Nguyên nhân dẫn đến chênh lệch trình nuôi để lấy sinh khối thực thể tích lớn nhiều ,so với thể tích nuôi để xác định đường cong sinh trưởng 200 ml thể tích nuôi sinh khối L thể tích nuôi cấy lớn ảnh hưởng chất ức chế axit lên vi sinh vật yếu thời gian phát triển để thu sinh khối lớn kéo dài Từ kết trên, xác định thời gian nuôi cấy thu nhận sinh khối quy mô lớn quy mô công nghiệp 3.3.4 pH nuôi cấy Tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng pH đến phát triển chủng L1.2 L1.3 môi trường MRS lỏng Dải pH khảo sát từ – 8, chủng L1.2 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 66 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 67 of 166 57 nuôi cấy nhiệt độ 370C chủng L1.3 nuôi 340C 48h Cứ 3h lấy mẫu đo OD lần Kết biểu diễn hình 16, 24h 2.4 OD 600nm 2.3 L1.2 2.2 L1.3 2.1 2 pH Hình 3.15: Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng phát triển chủng L1.2 L1.3 Từ hình 3.15 ta thấy pH ảnh hưởng lớn đến trình sinh trưởng chủng Chủng L1.2 phát triển tối thích pH = – , tốt pH = Ở pH = chủng bắt đầu có dấu hiệu phát triển Khoảng pH từ – chủng phát triển pH từ – 4,5 phát triển chủng bị ức chế Chủng L1.3 phát triển tốt pH = – 7.5 tối thích pH = 6.5 Ở pH = chủng phát triển hơn, pH = – chủng phát triển yếu dần Qua khảo sát ta thấy hai chủng phát triển tốt pH trung tính kiềm Điều chứng tỏ chủng thích hợp phát triển môi trường nước biển Dựa vào khảo sát pH chọn pH = 6,5-7 làm pH môi trường cho trình lên men thu sinh khối chủng L1.2 L1.3 3.3.5 Khả chịu mặn hai chủng L1.2 L1.3 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 67 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 68 of 166 58 Với mục đích ứng dụng chủng vi khuẩn lactic làm chế phẩm probiotic cho nuôi trồng thuỷ sản Do vậy, ta cần kiểm tra khả chịu mặn chủng L1.2 L1.3 Thí nghiệm kiểm tra môi trường MRS với độ mặn khác Kết cho hình 3.16 OD 600nm 2.5 L1.2 1.5 L1.3 0.5 Nồng độ muối NaCl (%) Hình 3.16: Ảnh hưởng nồng độ muối NaCl đến phát triển chủng L1.2 L1.3 Chủng L1.2 có khả phát triển nồng độ muối 5% Sự phát triển chủng tỷ lệ nghịch với độ mặn môi trường Chủng L1.3 có khả chịu mặn yếu hơn, mật độ tế bào giảm dần nồng độ muối cao đến 5% muối phát triển chủng L1.3 yếu ( OD600 = 0.95) Tuy nhiên nồng độ muối 1% chủng phát triển yếu nồng độ muối 2%, điều chứng tỏ nồng độ muối NaCl có ảnh hưởng đến phát triển L1.3 Chúng ta nhận thấy chủng có khả chịu mặn tốt, đặc biệt chủng L1.2 có khả chịu mặn tương đối cao 5%( so với độ mặn trung bình nước biển khoảng 3%) Đây đặc tính quý sử dụng chủng làm chế phẩm cho NTTS vùng khác GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 68 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 69 of 166 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu cá chim vây vàng lấy từ Trại cá Trường đại học thủy sản Nha Trang (tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa) phân lập chủng Lactobacillus có hoạt tính kháng chủng Vibrio spp Trong năm chủng có hoạt tính kháng Vibrio spp , hai chủng L1.2 L1.3 có hoạt tính kháng mạnh sau 24h nuôi cấy Các điều kiện thích hợp cho chủng phát triển: - Chủng L1.2: nhiệt độ 370C, pH= 6.5 - , thời gian thu sinh khối 24 - 28h, khả chiu mặn đến 5% - Chủng L1.3: nhiệt độ thích hợp 340C, pH= - 7, thời gian thu sinh khối 20 – 24h, khả chịu mặn đến 5% Hai chủng L1.2 L1.3 nghiên cứu có đặc điểm sinh học chi vi khuẩn Lactobacillus gồm: hình que, không di động, sinh axit lactic, lên men loại đường (glucose, saccharose, sucrose, mantose, manitol, sorbitol) Kiến nghị Hướng nghiên cứu tiếp theo: Sử dụng hai chủng L1.2 L1.3 vào chế phẩm probiotic để thử nghiệm invivo cá chim vây vàng Nghiên cứu sâu chế kháng khuẩn chủng Lactobacillus Giải trình tự gene hai chủng Lactobacillus nói GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 69 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 70 of 166 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Bộ thủy sản (2004), “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh vật thực phẩm thủy sản, dự án cải thiện chất lượng xuất thủy sản”, NXB nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội, 296 tr Bùi Trọng Khiêm, (2008) “Tìm hiểu kỹ thuật ương giống cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) Trại Thực nghiệm sản xuất Hải sản Vĩnh Hòa - Nha Trang” 41 tr Nguyễn Văn Sơn, (2008) “Kỹ thuật nhân tạo sản xuất giống cá chim vây vàng (Trachinotus blochii Lacepede, 1801) trại thực nghiệm Trường Cao Đẳng Thủy Sản – Yên Hưng – Quảng Ninh” tr – Trần Duy Thiết, (2004) “ Nghiên cứu ứng dụng chủng Lactobacillus acidopillus sản xuất chế phẩm sinh học (BIOF) dùng phòng trị bệnh cho tôm cá” 54 tr Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội (2004), “Bệnh học thủy sản”, NXB Nông nghiệp Tp Hồ Chí Minh, Tp Hồ Chí Minh, tr 224 – 231 Đỗ Thị Hòa, Trần Vỹ Hích, Nguyễn Thị Thùy Giang, Phan Văn Út, Nguyễn Thị Nguyệt Huệ “Các loại bệnh thường gặp cá biển nuôi Khánh Hòa” Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản số 02/2008 – Đại học Nha Trang, tr 16 – 24 Trần Vĩ Hích, Phạm Thị Duyên “Bệnh tử hoại thần kinh cá biển nuôi Khánh Hòa” Tạp chí Khoa học –Công nghệ Thủy Sản số 01/2008 – Đại học Nha Trang, tr 19 – 24 Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nhà xuất nông nghiệp, Hà Nội, 358 tr Trần Linh Thước (2007), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nhà xuất giáo dục, 232 tr GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 70 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 71 of 166 61 Tài liệu nước ngoài: Bernet MF, Brassart D, Neeser JR, Servin AL, (1994) “Lactobacillus acidophilus LA binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment and cell invasion by enterovirulent bacteria” Gut 35, pp 483-489 Briggs, M R P & Funge-Smith, S J.,(1994) “A nutrient budget of some intensive marine shrimp ponds in Thailand” Aquaculture and Fisheries Management 25, pp 789-811 Carvalho, A.S Silva J, Ho P Teixeia, F X Gibbs, (2004) Relevant factor for the preparation of freeze-died lactic acid bacteria International Dairy Journal, 14, 835-847, Elsrier Science B.V De Man J.C., Rogosa, M and Sharpe, M.E (1960) “A medium for the cultivation of Lactobacilli” Journal of applied bacteriology 23: pp 130-135 Direkbusarakom, S., Yoshimizu, M., Ezura, Y., Ruangpan, L., Danayadol Y., (1998) “Vibrio spp the dominant flora in shrimp hatchery against some fish pathogenic viruses” J Mar Biotechnol 6, pp 266–267 Ho Phu Ha and Michelle Cartherine Adams, (2007) “Selection and identifinication of a novel probiotic strans of Lactobacillus fermentum isolated from Vietnamese fermented food” School of Enviromental and Life Science, Faculty of Science and Information Technology, The University of Newcastle, Australia Hollang, K T., J S Knapp, and J G Shoesmith (1987) “Anaerobic Bacteria” 1st ed Blackie and Son, Ltd., London Kamei, Y., Yoshimizu, M., Ezura Y., Kimura, T., (1988) ” Screening of bacteria with antiviral activity from fresh water salmonid hatcheries” Microbiol Immunol 32, pp 67–73 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 71 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 72 of 166 62 Kenneth H Wilson and Fulvio Perin2, (1998) “Role of Competition for Nutrients in Suppression of Clostridium dijficile by the Colonic Microflora” INFECTION AND IMMUNITY, Oct 1988, p 2610-2614 10 LARS AXELSSON, (2004), “Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology” MATFORSK, Norwegian Food Research Institute, As, Norway 11 Mack DR, Michail S, Wei S, Wei S, Macdougal L, Hollingsworth MA, (1999) “Probiotics inhibit enteropathogenic E coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression” Am J Physiol 39, pp 941-950 12 Mishra, C and J Lambert (1996) “Production of anti-microbial substances by probiotics” Asia Pacific J Clin Nutr 5, pp 20–24 13 Nikoskelainen S, Ouwehand AC, Salminen S, Bylund G, (2001) “Protection of rainbow trout(Oncorhynchus mykiss) from furunculosis by Lactobacillus rhamnosus” Aquaculture 2001b;198:pp 229-236 14 O’Sullivan, D J and M J Kullen (1998) “Tracking of probiotic bifidobacteria in the intestine” Intl Dairy J 8: pp 513–525 15 Patricia Neysens, Winy Messens, Luc De Vuyst, (2003) “Effect of sodium chloride on growth and bacteriocin production by Lactobacillus amylovorus DCE 471” International Journal of Food Microbiology 88, pp 29– 39 16 Porter, C B., Krom, M D., Robbins, M G., Brickel, L & Davidson, A, (1987) “Ammonia excretion and total N budget for Gilthead Seabream (Sparus aurata) and its effect of water quality conditions” Aquaculture 66, pp 287297 17 Prieur, G., Nicolas, J.L., Plusquellec, A., Vigneulle M., (1990) “Interactions between bivalves molluscs and bacteria in the marine environment” Oceanogr Mar Biol Annu Rev 28, pp 227–352 18 Sakata, T., (1990) “Microflora in the digestive tract of fish and shellfish” In: Lesel, R (Ed.), Microbiology in Poecilotherms Elsevier, Amsterdam, pp 171–176 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 72 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 73 of 166 63 19 Saurabh S, Choudhary AK and Sushma GS (2005) “Concept of probiotics in aquaculture” Fishing Chimes 25, pp 19–22 20 Srikanjana Klayraung, Helmut Viernstein, Jakkapan Sirithunyslug, Siriporn Okonogi(2008) “Probiotic Properties of Lactobacilli Isolated from Thai Traditional” Sci Pharm 76: pp 485–503 21 Tanaka S, I Kuriyama, T Nakai and Miyazaki (2003) “Susceptibility of cultured juveniles of several marine fish to the sevenband grouper nervous necrosis virus” Journal of fish diseases 26, pp 109-115 22 Teruo Higa, (2002) “Technology of Effective Microorganisms” Concept and Phisiology Royal Agricultural College, Cirencester, UK 23 Thompson, J.; Chassy, B.M.(1981) “Uptake and metabolism of sucrose by Streptococcus lactis” J Bacteriol 1981, 147, pp 543–551 24 Wu, R.,(1995) “The environmental impact of marine fish culture: toward a sustainable future” Mar Pollut Bull 31, pp 159-166 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 73 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân Header Page 74 of 166 64 GVHD: Th.s Lê Đình Đức Footer Page 74 of 166 http://www.ebook.edu.vn SVTH: Lê Thanh Huân ... BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS TRÊN CÁ CHIM. .. Tổng quan cá chim vây vàng 14 1.2.1 Giới thiệu chung cá chim vây vàng 14 1.2.2 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng giới nước 15 1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu cá chim vây vàng giới... nuôi cá chim vây vàng Các nội dung nghiên cứu đề tài: - Phân lập chủng Lactobacillus Vibrio ruột cá chim vây vàng - Tuyển chọn chủng Lactobacillus có hoạt tính khảng Vibrio - Nghiên cứu đặc điểm