Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

58 371 1
Xác định các đột biến trên gen katG liên quan đến tính kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Thông tin tài liệu

Header Page of 166 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Nhiễm vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) là một những nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người Hiện tỷ lệ nhiễm vi khuẩn lao được xác đị nh là chiếm 1/3 dân số thế giới Có khoảng triệu người mắc lao mới và triệu người chết lao mỗi năm Tuy vậy tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tí nh Vì vậy còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị và tiếp tục làm lây lan bệnh cho c ộng đồng Hiện nay, bệnh lao trở nên nghiêm trọng với đặc trưng là kháng đa thuốc Trong các trường hợp bệnh lao kháng đa thuốc, khó khăn không chỉ là điều trị thất bại cao , dẫn đến lan truyền nhanh chóng vi khuẩn lao kháng đa thuốc mà còn chưa tì m được những thuốc thay thế hiệu quả và hợp lý , các thuốc chống lao thực sự có hiệu quả chỉ tập trung co5́ thuốc Những bệnh nhân bị nhiễm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc rấ t khó điều trị Do đó việc phát hiện sớm các chủng vi khuẩn lao kháng đa thuốc sẽ góp phần đáng kể điều trị bệnh lao Để ch ẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc , hiện các sở nước vẫn phải dựa vào nuôi cấ y vi khuẩn và làm kháng sinh đồ chuẩn đoán lao kháng thuốc cần í t nhất Thời gian – tuần Với thời gian dài vậy sẽ khó khăn cho công tác điều trị , khó đáp ứng yêu cầu giám sát và toán bệnh lao Khắc phục nhữ ng nhược điểm đó , việc ứng dụng sinh học phân tử tạo những đột phá chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc chẩn đoán có thể rút ngắn xuống còn vài ngày Thời gian , với độ nhậy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng Footer Page ofTrung 166 Số hóa1bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 Các nghiên cứu về sinh học phân tử chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc đã chỉ rằng mỗi loại kháng thuốc là các gen tương ứng chịu trách nhiệm Ví dụ, nếu chỉ được độ t biến ở gen KatG cũng có nghĩa là chủng lao đó kháng isoniazid Xuất phát từ những lý , chúng tiến hành đề tài : "Xác định các đột biến gen katG liên quan đến tí nh kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao tại Việt Nam" Mục tiêu nghiên cứu Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu Phát hiện đột biến gen katG liên quan đến tính kháng isoniazid các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu Nội dung nghiên cƣ́u - Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu - Tạo vector tái tổ hợp và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E coli - Tách dòng gen katG - Giải trình tự gen katG - Phát hiện, phân tích đột biến gen katG liên quan đến tí nh kháng thuốc isoniazid ở các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu Footer Page ofTrung 166 Số hóa2bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh lao 1.1.1 Tình hình bệnh lao thế giới Bệnh lao gắn liền với sự phát triển xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, thế giới chưa và không có một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc bệnh lao và chết lao [1] Do sự phát minh các thuốc hóa học chống lao khiến việc chữa lao đơn giản và hiệu quả hơn, đồng thời đã phát sinh tâm trạng chủ quan của y giới, đã làm lãng quên bệnh nguy hiểm này Ngày nay, bệnh lao xuất hiện trở lại và với đại dịch HIV/AIDS trở thành một những nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước phát triển Năm 1993, Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối hiểm hoạ của nó tương lai là bệnh lao kháng thuốc [22] Hiện nay, thế giới có khoảng 2,2 tỷ người đã nhiễm lao (chiếm 1/3 dân số thế giới) Theo số liệu công bố của TCYTTG (2004), ước tính năm 2003 có thêm khoảng triệu người mắc lao và triệu người chết lao Khoảng 95% số bệnh nhân lao và 98% số người chết lao các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số bệnh nhân lao cả nam và nữ độ tuổi lao động Trong đó, có khoảng 80% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao [1,22] Hiện nay, tỷ lệ điều trị thành công toàn cầu đạt 82%, tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân ước tính Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, và theo Footer Page ofTrung 166 Số hóa3bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 ước tính của TCYTTG, mỗi năm có thêm 1% dân số thế giới bị nhiễm lao (65 triệu người) [22] Hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu tại khu vực Đông nam Châu Á Dưới là ước tính bệnh nhân lao mắc năm 2002 theo khu vực [22] Bảng 1.1: Ƣớc tính bệnh nhân lao mới mắc năm 2002 theo khu vực Số BN (nghìn) Khu vực Các thể Châu Phi Châu Mỹ Trung Đông Châu Âu Đông nam Châu Á Tây Thái Bình Dương Toàn cầu 2354 (26%) 370 (4%) 622 (7%) 472 (5%) 2890 (33%) 2090 (24%) 8797 (100%) Tỷ lệ/100 000 AFB Các AFB (+) thể (+) 1000 350 165 Tử vong lao (bao gồm nhiễm HIV) SL (nghìn) TL/100000 149 556 83 43 19 53 279 124 55 143 28 211 54 24 73 1294 182 81 625 39 939 122 55 373 22 3887 141 63 1823 29 Mức độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tới thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển người của các quốc gia Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao sẽ mất trung bình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập Bệnh lao đã tác động mạnh Footer Page ofTrung 166 Số hóa4bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, suất lao động giảm và mùa màng, chợ búa sẽ không tham gia được Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn năm 2001 tại trụ sở của ngân hàng thế giới Washington D.C với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối với sự phát triển kinh tế xã hội [22] Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh, thông khí và dinh dưỡng Trên 95% số bệnh nhân lao, 98% số chết lao toàn cầu thuộc các nước có thu nhập vừa và thấp, 75% số người mắc bệnh lao các lứa tuổi 14-55, tuổi làm nhiều của cải nhất cuộc đời [1, 22] Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển 1.1.2 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và mức độ trung bình cao Việt Nam đứng thứ 13 22 nước có số bệnh nhân lao cao toàn cầu (TCYTTG, 2004) Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philipinnes về số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng bệnh nhân lao xuất hiện hàng năm [1] Năm 1995, trước những biến động xấu của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, Nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình chống lao thành một những Chương trình y tế quốc gia trọng điểm Cùng với sự đầu tư phát triển Chương trình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình Footer Page ofTrung 166 Số hóa5bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 chống lao Ban chỉ đạo Chương trình chống lao và chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, với sự hợp tác và giúp đỡ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế [4] Năm 1996, Chương trình chống lao quốc gia (CTCLQG) với sự hỗ trợ về kỹ thuật và tài chính của Chính phủ Hà Lan, hiệp hợi chớng lao hồng gia Hà Lan, uỷ ban hợp tác y tế Hà Lan - Việt Nam, CTCLQG đã hình thành và xây dựng kế hoạch phòng chống lao giai đoạn 1996-2000 Đến năm 1999, chiến lược DOTS (điều trị bằng hoá trị liệu ngắn ngày có kiểm soát trực tiếp) đã được bao phủ 100% số huyện cả nước [4] Trong giai đoạn 1997-2002, CTCLQG đã phát hiện được 532.703 bệnh nhân lao các thể, tỷ lệ phát hiện đạt 82% số bệnh nhân ước tính (so với mục tiêu của TCYTTG là 70%), CTCLQG đã điều trị 260.698 bệnh nhân lao phổi AFB (+) với tỷ lệ khỏi là 92% [3] Năm 2002, khu vực Tây Thái Bình Dương phát hiện 806.460 bệnh nhân lao các thể, 372.220 bệnh nhân lao phổi AFB (+) Trong đó, số bệnh nhân CTCLQG Việt Nam phát hiện chiếm 12% bệnh nhân các thể và 15% số bệnh nhân lao phổi AFB (+) [1] Với những kết quả đạt được chỉ tiêu phát hiện và điều trị bệnh nhân, năm 1996, Việt Nam là nước đầu tiên Châu Á đã đạt được mục tiêu của TCYTTG Việt Nam đã được TCYTTG và ngân hàng thế giới đánh giá cao thành tích đạt được mọi hoạt động chống lao Từ năm 1997, TCYTTG hiệp hội lao bệnh phổi quốc tế phối hợp với CTCLQG Việt Nam tổ chức khoá học về quản lý Chương trình chống lao cho các học viên quốc tế tại Việt Nam Mô hình hoạt động chống lao Việt Nam được xem là mô hình để học viên các nước học tập [4] Vì là một số ít nước sớm nhất đạt được các mục tiêu phòng chống lao TCYTTG đề ra, những kết quả đạt được có tính bền vững, nên tháng 10 Footer Page ofTrung 166 Số hóa6bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 năm 2003 vừa qua CTCLQG Việt Nam đã nhận được giải thưởng của hợi chớng lao hồng gia Hà Lan (KNCV) nhân lễ kỷ niệm 100 năm ngày thành lập tổ chức Nhân ngày thế giới chống lao, 24/3/2004, tại diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ TCYTTG tổ chức tại New Dehli, CTCLQG Việt Nam là một nước thế giới (bao gồm: Việt Nam, Peru, Madives, Cuba, Tunisia và Morocco) và là nước nhất 22 nước có gánh nặng bệnh lao cao được nhận giải thưởng của TCYTTG về thành tích đã đạt được mục tiêu của TCYTTG và kết quả có tính bền vững năm [4] Hiện nguy nhiễm lao hàng năm nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía nam là 2%, các tỉnh phía bắc là 1%) Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm nước ta có một s ố lượng lớn người bị mắc lao mới Số lư ợng người mắc lao mới được thể h iện qua bảng 1.2 Bảng 1.2: Bảng ƣớc tính số bệnh nhân mắc lao mới qua mỗi năm ở Việt Nam Số mắc lao (mọi thể): 130.000 Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000 Tổng số trường hợp lao: 260.000 Tổng số lao phổi BK dương tính: 120.000 Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình Dương, vùng dịch tễ lao vào loại trung bình thế giới Trên thực tế có thể chỉ số nguy nhiễm lao hàng năm có thể cao 1,5% vậy các số nêu có thể còn lớn Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác chống lao không những những năm tới mà có thể còn thời gian khá dài, cả đã bước sang thiên niên kỷ Footer Page ofTrung 166 Số hóa7bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 1.1.3 Tình hình lao kháng thuốc Theo báo cáo dựa thăm dò lớn về lao kháng thuốc toàn cầu của TCYTTG công bố ngày 26/2/2008, tỷ lệ nhiễm lao kháng nhiều thuốc hiện mức cao chưa có Mỗi năm có khoảng nửa triệu ca lao kháng đa thuốc, theo ước tính của TCYTTG, chiếm khoảng 5% số triệu ca nhiễm lao hàng năm Cũng báo cáo này, lần đầu tiên lao kháng thuốc cực mạnh được đề cập, là một dạng gần không chữa lành được [5] Theo TCYTTG, hiện bệnh lao kháng thuốc là một vấn đề toàn cầu, đặc biệt nghiêm trọng là tình hình kháng đa thuốc Bệnh lao kháng thuốc xuất hiện có vi khuẩn lao kháng với một nhiều loại thuốc chống lao, nguyên nhân là bệnh nhân không hợp tác, không tuân thủ đúng nguyên tắc điều trị được quy định của chương trì nh chống lao , một nguyên nhân khác hay gặp là thầy thuốc kê đơn không đúng không phối hợp đầy đủ các thuốc chống lao, liều lượng thuốc không đủ, hướng dẫn bệnh nhân không đúng cách, điều trị không đủ thời gian Kết quả điều trị với bệnh nhân kháng thuốc thường không cao, nhất là đối với bệnh nhân kháng đa thuốc Chi phí điều trị bệnh nhân lao kháng đa thuốc tăng lên 100 lần so với bệnh nhân lao không kháng thuốc và thậm chí không điều trị được một số trường hợp Tỷ lệ kháng đa thuốc bệnh nhân lao khu vực Tây Thái Bình Dương dao đợng khoảng 1% đến 10,8% (theo một số nghiên cứu khu vực) [4] Dự án nghiên cứu kháng t huốc lao sở toàn c ầu được thực hiện từ năm 1995 với mục tiêu là xác đị nh được tổng số bệnh nhân lao kháng thuốc thế giới bằng những phương pháp thống nhất thử độ nhạy với thuốc lao của vi khuẩn Năm 1998, TCYTTG đã công bố kết quả khảo sát tì nh hì nh vi khuẩn lao kháng thuốc ở 35 nước và khu vực thế giới [6] Theo công bố này , tỷ lệ kháng thuốc tiê n phát trung bì nh với riêng từ ng loại thuốc có khác , cụ thể là : kháng isoniazid 3,2%, rifampicin 0,2%, Footer Page ofTrung 166 Số hóa8bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 166 ethambutol 0,3%, steptomycin 2,5% %, đó kháng steptomycin ở vùng Ivanovo (Nga) là nơi kháng đơn thuốc cao nhất Tỷ lệ kh áng thuốc tiên phát trung bì nh là 9,9 % đó kháng thuốc chiếm 6,6 %, kháng thuốc chiếm 2,5 %, kháng thuốc chiếm 0,6 %, kháng bốn thuốc chiếm 0,2 %, kháng đa thuốc trung bì nh là 1,4 % Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát cao n hất 40,6 % cộng hòa Dominica , thấp nhất là 2% cộng hòa Séc [6] Tình hình kháng thuốc mắc phải với loại thuốc cũng khác kháng isoniazid trung bì nh : 6,3 %, rifampicin 0,7 %, ethambutol 0,4 %, steptomycin 2,6 % Kháng thuốc mắc phải với steptomycin ở Cuba có tỷ lệ cao nhất 57 % Tỷ lệ kháng thuốc mắc phải trung bình toàn thế giới là 36 %, đó kháng loại thuốc 12,2 %, loại thuốc 9,7 %, loại thuốc 5,4 %, loại thuốc 4,4 % Lao kháng đa thuốc mắc phải có tỷ lệ trung bì nh là 13 % Kháng đa thuốc mắc phải cao nhất Latvia , có tỷ lệ 54 % [6] Vi khuẩn lao kháng đa thuốc là một thách thức lớn , đe dọa công cuộc phòng chống lao toàn cầu , vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc Trong các thuốc chống lao hàng đầu chỉ có năm thuốc thì các thuốc chống lao loại hai lại thường có độc tí nh cao và giá thành đắt [5] Việc nghiên cứu lao kháng thuốc ở Việt Nam được tiến hành khá sớm Năm 1958 Phạm Ngọc Thạc h và cộng sự đã công bố t ỷ lệ kháng thuốc mắc phải v ới isoniazid là 53 %, với paraminosalicylic acid là 26 %, với steptomycin là 59 % [6] Báo cáo của CTCLQG năm 1998 cho thấy tì nh hì nh kháng thuốc của vi khuẩn lao ở Việt Nam là một vấn đề đáng lo ngại Tỷ lệ kháng thuốc tiên phát là 32,5 % đứng thứ tư khảo sát của TCYTTG sau Latvia (34%), Thái Lan (36,6%), và Cộng hòa Dominica (40,6%) Qua các nghiên cứu đã cho thấy Việt Nam là một những quốc gia có tỷ lệ bệnh lao kháng thuốc cao thế giới [6] Footer Page ofTrung 166 Số hóa9bởi tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 10 of 166 Nhiễm vi khuẩn lao kháng thuốc là nguyên nhân dẫn đến thấ t bại điều trị Những bệnh nhân lao mới có thể chữa khỏi 95 – 100% Nhưng bệnh nhân lao kháng thuốc mắc phải , tỷ lệ chữa khỏi chỉ 20 – 30% [22] Kết quả còn thấp nữa ở những trường hợp kháng đa thuốc mắc phải, thậm chí không chữa được Nguy hiểm là các bệnh nhân này có thể tiếp tục truyền bệnh cho người khác Vì vậy việc phát hiện và ngăn chặn sự lan tràn của các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất chiến lược điều trị lao hiện 1.2 Vi khuẩn lao 1.2.1 Đặc điểm phân loại Vi khuẩn lao thuộc giới Bacteria , ngành Actinobacteria , bộ Actinomycetales , phân bộ, họ Mycobacteriaceae, giống Mycobacterium [18] Tên khoa học của vi khuẩn lao là: Mycobacterium tuberculosis Các chủng vi khuẩn lao được chia làm tuberculosis gồm bốn nhóm : Mycobacterium loài có khả gây bệnh người , và nhóm Mycobacteria other than tuberculosis gồm nhiều loài không gây bệnh ở người [6,7] 1.2.2 Đặc điểm hình thể Vi khuẩn lao có hình trực khuẩn , kích thước – μm, rộng 0,3 – 1,5 μm Trực khuẩn mảnh , đứng riêng lẻ hoặc xếp thành hì nh chữ N , Y, V hoặc thành dãy phân nhánh cành Vi khuẩn lao không di động , không sinh bào tử, khó bắt màu các thuốc nhuộm thông thường có lớp sáp thành tế bào [7] 1.2.3 Khả gây bệnh Các bệnh lý nhiễm trùng là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu thế giới Không chỉ có những bệnh nhiễm trùng phát sinh mà những bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người đã biết từ lâu cũng tái xuất hiện Hơn nữa tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày càng tăng cao là nguy lớn cho sức khỏe cộng đồng Những bằng chứng gần cho thấy các tác nhân gây bệnh rất khác đều sử dụng những phương thức chung để 10 Footer Page 166 Số hóa10 of Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 44 of 166 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CƢ́U VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết quả nhân bản gen katG các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 25 3.2 Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli DH5α 26 3.3 Kết quả tách dòng gen katG 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Kết luận 42 1.1 Nhân bản thành công gen katG từ các chủng vi khuẩn lao 42 1.2 Đột biến gene katG liên quan đến tính kháng Isoniazid vi khuẩn lao 42 Kiến nghị 42 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 44 of 166 44 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 45 of 166 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế , Trung tâm phòng chống lao quốc gia (2006), Báo cáo tổng kết Chương trì nh chống lao quốc gia 2005 Trần Văn Sáng (1999), Vi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng và điều trị , Nhà xuất bản giáo dục Lê Thị Luyến , Bộ Y tế (2007), Tình hình dịch tễ , điều trị , dự phòng và nghiên cứu Lao tại Việt Nam , Hộ i thảo sinh học phân tử về bệnh lao , Đại học Quốc gia Hà Nội, tháng 8/2007 Bộ Y tế, Viện Thông tin Thư viện Y học Trung ương (2007), Tình hình bệnh lao http://www.hoilhpn.org.vn/ Thuốc - sức khỏe (2009), Thuốc chống lao http://www.thuoc-suckhoe.com/khainiem/baiviet/phanloai062.htm Phùng Công Thưởng (2007), Nghiên cứu chẩn đoán vi khuẩn lao kháng rifampicin bằng phương pháp xác đị nh đột biến gene rpoB , Luận văn thạc sỹ Y học Nguyễn Văn Hưng (2001), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của Mycrobacterium Tuberculosis phân lập tại Viện lao và Bệnh phổi , Luận án tiến sỹ Y học http://vi.wikipedia/wiki/cochedocluccuavikhuan Lâm Kim Cương (2008), Ứng dụng phương pháp PCR để tìm vi trùng lao, http://www.yduocngaynay.com 10 Hồ Huỳnh Thùy Dương (2004), Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 45 of 166 45 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 46 of 166 11 Nguyễn Văn Cách (2005), Tin sinh học , Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật 12 PGS.TS Bùi Khắc Hậu (2009), Tại vi khuẩn lao kháng thuốc http://www.toquoc.gov.vn/Print/Article/Tai-Sao-Vi-Khuan-Lao-Khangthuoc/pdf 13 Đặng Đức Anh (2001), Nghiên cứu sự đáp ứng miễn dị ch một số thể bệnh lao, Luận án tiến sỹ Sinh học 14 Trần Văn Sáng (1999), Sinh học phân tử và miễn dị ch học bệnh lý hô hấp, Nhà xuất bản giáo dục 15 Quyền Đì nh Thi (2005), Công nghệ sinh học , Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật 16 Nguyễn Xuân Triều (2006), "Chẩn đoán lao", Bài giảng lao và bệnh phổi sau đại học, Học viện quân y 17 Phạm Thành Hổ (2006), Di truyền học, Nhà xuất bản giáo dục 18 Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Đì nh Quyến , Phạm Văn Ty (2003), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản giáo dục 19 Đoàn Trọng Phụng (2005), "Acid nucleic và sinh tởng hợp protein ", Hóa sinh y học, Học viện Quân Y , tr.191-270 20 Phạm Hùng Vân (2007), Các quy trình kỹ thuật sinh học phân tử thường được sử dụng chẩn đoán và nghiên cứu y sinh học http://www.nk-biotek.com.vn Tiếng Anh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 46 of 166 46 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 47 of 166 21 Juan Carlos Palomino , Sylvia Cardoso Leão , Viviana Ritacco (2007), Tuberculosis 2007 - from basic science to patient care, http://www.tuberculosisTexbook.com 22 WHO (2007), Fact sheet N0104 Revised March 2007, Tuberculosis, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/ 23 Jame M Musser (1995), Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: Molecular Genetic Insights, Clinical Microbiology Reviews, Vol 8, No 4, p.496-514 24 Wu X, Zhang J, Hu Z (2009), Study on the mutations of ahpC genes in M tuberculosis isoniazid-resistant isolates, 1998 Dec;21(12):727-9 Chinese 25 WHO (2004), Anti - tuberculosis drug resistance in the world, Report No 3, http://www.who.int/tb/publications/who_htm_tb_2004_343/en/ 26 WHO (2007), Global Tuberculosis Control Surveillance, Planning, Financing, WHO report 2007 27 Sonal S.Munsiff et al (2002), Molecular Epidemology of MultidrugResistance Tuberculosis, New York city, Emerg Infect Dis 8(11) Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 28 S.H.E Kaufmann, H Hahn, Mycrobacteria and TB 29 Beate Heym, Ying Zhang, Sylvie Poulet (1993), Characterization of the katG Gene Encoding a Catalase-Peroxidase Required for the Isoniazid Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis 30 Marttila HJ (2009), A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St Petersburg area in Russia, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9736581?ordinalpos=9&itool=EntrezS Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 47 of 166 47 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 48 of 166 ystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPanel Pubmed_RVDocSum 31 Marttila HJ, Soini H, Huovinen P, Viljanen MK (2009), katG mutations in isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates recovered from Finnish patients, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8878604?ordinalpos=11&itool=Entrez System2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPane l.Pubmed_RVDocSum 32 Aslan G, Tezcan S, Serin MS, Emekdas G (2009), Genotypic analysis of isoniazid and rifampin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern Turkey, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18653964?ordinalpos=1&itool=Entrez System2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DefaultReportPane l.Pubmed_RVDocSum 33 Amina A (2009), Genotypic detection of rifampicin and isoniazid resistant Mycobacterium tuberculosis strains by DNA sequencing: a randomized trial Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials 8:4 34 Ahmad S, Fares E, Araj GF, Chugh TD, Mustafa AS (2002), Prevalence of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Dubai and Beirut Inter J Tuber and lung dis 6(10):920-926 35 Wengenack NL, Todorovic S, Yu L, Rusnak F (2009), Evidence for differential binding of isoniazid by Mycobacterium tuberculosis KatG and the isoniazid-resistant mutant KatG(S315T), Biochemistry 1998 Nov 10;37(45):15825-34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 48 of 166 48 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 49 of 166 36 Tracevska T, Jansone I, Broka L, Marga O, Baumanis V (2009), Mutations in the rpoB and katG genes leading to drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Latvia, J Clin Microbiol 2002 Oct;40(10):3789-92 37 Molecular Cloning (2007), http://www.fermentas.com/catalog/cloning/index.html 38 NCBI (2007), Mycobacterium tuberculosis H37Rv, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=83332 39 NCBI (2007), NCBI/ BLAST Home, nucleotide blast, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi 40 Neil W Schluger (2007), Epidemiology and molecular mechanisms of drug-resistant tuberculosis, http://www.patients.uptodate.com/topic.asp?file=tubercul/9211 41 V Nikolayevsky, T.Brown, et al (2004), Detection of Mutations Associated with Isoniazid and Rifampin Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates from Samara Region, Russian Federation, J Clin Microbiol, 42(10), p.4498-4502 42 Rakhi Agrawal (2006), DNA Isolation from Rhizobium by Phenol Chloroform Method, http://www.protocol-online.org/prot/Protocols/DNA-Isolation-fromRhizobium-by-Phenol-Chloroform-Method-4449.html 43 Sechi, L A., S.Zanetti, et al (2001), Molecular basis of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium bovis strains isolated in Sardinia, Italy, Antimicrob Agents Chemother 45:1645-1648 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 49 of 166 49 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 50 of 166 44 Miotto, P., Piana, et al., (2006) Use of Genotype MTBDR Assay for Molecular Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Clinical Strains Isoniazid in Italy J Clin Microbiol 44: 24852491 45 Mateu Espasa et al (2005), Direct detection in clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicin using fluorogenic probes, Journal of Antimicrobial Chemotherapy 55, p 860-865 46 Sonal S Munsiff et al (2002), Molecular Epidemology of multidrugResistant Tuberculosis, New York city, Emerg Infect Dis 8(11) Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 47 Weezenbeck C.S.B, Veen J (1995), Control of drug-resistant tuberculosis, Tubercle and Lung Disease, 76: 455-459 48 Escalante, P., S Ramaswamy, et al (1998), Genotypic characterization of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Peru, Tuber Lung Dis 79: 111-118 49 Department of Biological Sciences 1000 Hilltop Circle Baltimore (2007), Preparation of Genomic DNA from Bacteria, http://www.research.umbc.edu/~jwolf/genomic 50 Sambork and Russell (2001), Molecular cloning a laboratory manual vol.1: 1.31-1.162, vol 2: 8.18-8.113, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, New york 51 García de V, Infantes S D, Lasala F, Chaves F, Alcala L, Bouza E (2002), New real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 50 of 166 50 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 51 of 166 mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis J Clin Microbiol 40:988-995 52 Dalla Costa and et (2009), Correlations of mutations in katG, oxyR-ahpC and inhA genes and in vitro susceptibility in Mycobacterium tuberculosis clinical strains segregated by spoligotype families from tuberculosis prevalent countries in South America 53 Gonul Aslan and et (2008), Genotypic analysis of isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical mycobacterium tuberculosis complex isolates in southern tukey Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 51 of 166 51 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 52 of 166 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÃ DUY ANH XÁC ĐỊNH CÁC ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KATG LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH KHÁNG THUỐC ISONIAZID CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN LAO TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Chu Hoàng Hà Thái Nguyên - 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 52 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 53 of 166 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trình nghiên cứu của Các số liệu và kết quả nghiên cứu luận văn hoàn toàn trung thực và chưa có công bố một công trình nào khác Tác giả Lã Duy Anh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 53 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 54 of 166 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Chu Hồng Hà – Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ Sinh học tận tình hướng dẫn, bảo và giúp đỡ trình thực đề tài này Với tất cả lòng kí nh trọng, xin gửi lời cảm ơn tới GS TS Lê Trần Bình, TS Nguyễn Hữu Cƣờng, TS Nghiêm Ngọc Minh Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện và đóng góp ý kiến quý báu cho thời gian làm việc Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn CN Hoàng Hà, CN Nguyễn Văn Bắc tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ hoàn thành đề tài này Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới toàn thể thầy cô giáo khoa Sinh KTNN - Đại học Sư phạm Thái Nguyên, khoa Sau Đại học - Đại học Sư phạm Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ học tập và hoàn thành nghiên cứu đề tài Cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, người thân, gia đì nh đã động viên giúp đỡ rất nhiều Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, Tháng năm 2009 Học viên Lã Duy Anh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 54 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 55 of 166 DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT INH : Isoniazid RMP : Rifampicin EMB : Ethambutol PAS : Paraminosalicylic acid PAZ : Pyrazinamid MDR : Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc) EDR : Exetensively drug resitant (Kháng thuốc mở rộng) HRSE : Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin, ethambutol HRS : Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin DNA : Acit deoxyribonucleic RNA : Acid Ribonucleic PCR : Polymerase Chain Reaction IPTG : Isopropyl-thio-β-D-galactoside X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside TAE : Tris-Acetate-EDTA LB : Luria - Bertani dNTPs : Deoxyribonucleotide Triphosphate E.coli : Escherichia coli Taq-DNA polymeraza : Thermus aquaticus DNA polymerase Bp : Base pairs Kb : Kilo base CNSH : Công nghệ sinh học TTYTTT : Tổ chức y tế thế giới CTCLQG : Chương trì nh chống lao q́c gia Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 55 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 56 of 166 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1: Ước tính bệnh nhân lao mắc năm 2002 theo khu vực Bảng 1.2: Bảng ước tính số bệnh nhân mắc lao qua mỗi năm Việt Nam Bảng 2.1: Đặc điểm kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn lao 14 Bảng 2.2: Các sinh phẩm hóa chất ch ính 15 Bảng 2.3: Các máy và thiết bị chính 16 Bảng 2.4: Tính toán các thành phần cho phản ứng PCR 19 Bảng 2.5: Tính toán các thành phần cho phản ứng nối đầu A 21 Bảng 3.1: Các vị trí xảy đột biến đoạn gen katG của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 34 Bảng 3.2: Các vị trí xảy đột biến thay thế acid amin của các chủng vi khuẩn lao nghiên cứu 35 DANH MỤC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ nghiên cứu 17 Sơ đồ qui trì nh nhân bản đoạn gen KatG 18 Sơ đồ qui trì nh tách dòng 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 56 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 57 of 166 DANH MỤC ẢNH Ảnh 3.1: Điện di kiểm tra DNA các chủng vi khuẩn lao ĐA 1, ĐA2, ĐA3, ĐA4, ĐA5, ĐA6, ĐA7, ĐA8, ĐA9, (-) 25 Ảnh 3.2: Điện di kiểm tra DNA các chủn g vi khuẩn lao ĐA10, ĐA11, ĐA12, ĐA13, ĐA14 25 Ảnh 3.3: Ảnh 3.3: Sơ đồ vector pBT 27 Ảnh 3.4: Chọn dòng khuẩn mang plasmid tái tổ hợp môi trường LB có bổ sung carbenicillin , X-gal và IPTG 28 Ảnh 3.5: Điển di kiểm tra đoạn gen katG các mẫu ĐA1, ĐA3, ĐA6, ĐA12, ĐA13 sau cắt bằng enzym BamHI 29 Ảnh 3.6: Điện di kiểm tra đoạn gen katG các mẫu ĐA2, ĐA4, ĐA5, ĐA8, ĐA11, ĐA 12 sau cắt bằng enzym BamHI 29 Ảnh 3.7: Điện di kiểm tra đoạn ge n katG các mẫu ĐA7, ĐA9, ĐA10 sau cắt bằng enzym BamHI 30 Ảnh 3.8: Điện di kiểm tra đoạn gen katG các mẫu ĐA1, ĐA2, ĐA5, ĐA14, S8 sau cắt bằng enzym BamHI 30 Ảnh 3.9: So sánh trì nh tự nucleotide các mẫu bệnh phẩm vớ i trì nh tự nucleotide của chủng dại H 37Rv 32 Ảnh 3.10: So sánh trì nh tự acid amin các mẫu bệnh phẩm với trì nh tự acid amin của chủng dại H 37Rv Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 57 of 166 33 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 58 of 166 PHỤ LỤC  Các dung dịch sử dụng tách chiết plasmid từ vi khuẩn.: - Sol I: Tris- HCL 25mM, pH=8; EDTA 10mM, pH=8; glucose 50mM - Sol II: NaOH 0,2M; SDS 1% - Sol III: kali axetat 3M; axit axetic 11,5%; natri axetat 3M  Dung dịch đệm TE: Tris-HCL 10mM, pH=8; EDTA 1mM, pH=8  Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1), 24ml chloroform: 1ml isoamylalcohol  Dung dịch đệm TAE đặc 50 lần: Tris-HCL 24,2%, axit axetic 5,71 ml, 10ml EDTA 0,5M pH=8  Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide: 0,5μg/ml  Các loại môi trường - Môi trường LB lỏng: 0,5% dịch chiết nấm men; 1% bacto-pepton; 1% NaCl - Môi trường LB đặc: môi trường LB lỏng thêm 1,5% Bacto-aga - Môi trường chứa chất cảm ứng IPTG: môi trường LB có bổ xung IPTG tới nờng đợ ći 1mM Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 58 of 166 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... kháng thuốc i soniazid của một số chủng vi khuẩn lao ta? ?i Vi? ?̣t Nam" Mục tiêu nghiên cứu Nhân bản đoạn gen katG từ các chủng vi khuẩn lao nghiê n cứu Phát hiện đột biến gen katG. .. plasmid có chứa đoạn gen katG đủ tiêu chuẩn phục vụ gia? ?i trình tự gen 1.2 Đột biến gene katG liên quan đến tí nh kháng I soniazid ở vi khuẩn lao Tỷ lệ đột biến genkatG 14 chủng. .. [53] nghiên cứu về xác ? ?i? ? nh đột biến liên quan tơ? ?i tí nh kháng thuốc isoniazid cũng cho thấy , ngoa? ?i codon 315 là đột biến chính thì tồn ta? ?i các đột biến ta? ?i các codon

Ngày đăng: 18/03/2017, 21:01

Từ khóa liên quan

Tài liệu cùng người dùng

  • Đang cập nhật ...

Tài liệu liên quan