Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN      Chử Lƣơng Luân NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO KIM LOẠI ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN      Chử Lƣơng Luân NGHIÊN CỨU VÀ THỬ NGHIỆM HẠT NANO KIM LOẠI ĐƢỢC CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT TRONG CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO Chuyên ngành : Sinh học Thực nghiệm Mã số : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS TS Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội - 2012 Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực luận văn tốt nghiệp, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ dẫn tận tình Trước tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phan Tuấn Nghĩa, TS Phạm Bảo Yên TS Nguyễn Thị Vân Anh tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội mang đến kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập nghiên cứu trường Tôi xin gửi lời cảm cán viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Khoa Vi sinh – Viện Quân Y 103 cung cấp mẫu cho trình nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán tập thể nhóm nghiên cứu Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym Protein nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn thạc sĩ Luận văn thực tài trợ kinh phí đề tài mã số 2/2010/HĐ-NCCBUD GS.TSKH Nguyễn Hoàng Lương làm chủ trì Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ để hoàn thành luận văn tốt nghiệp Một lần xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày 21 tháng 12 năm 2012 Học viên Chử Lương Luân Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LAO …3 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn lao 1.1.2 Hệ gene vi khuẩn lao .4 1.1.3 Khả gây bệnh tình hình bệnh lao 1.1.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán vi khuẩn lao 1.2 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ HẠT NANO KIM LOẠI 11 1.2.1 Tính chất hạt nano kim loại 11 1.2.2 Một số loại hạt nano kim loại 13 1.2.3 Ứng dụng hạt nano kim loại y học 17 1.3 CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT NANO TỪ, GẮN KẾT VÀ LÀM GIÀU TẾ BÀO VI KHUẨN LAO………………… …… ………………… 17 1.3.1 Chức hóa bề mặt hạt nano từ 17 1.3.2 Quá trình gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao 19 1.3.3 Làm giàu tế bào vi khuẩn lao từ trƣờng 21 CHƢƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 2.1 NGUYÊN LIỆU 22 2.1.1 Mẫu đờm lao vaccine BCG 22 2.1.2 Hạt nano kim loại có từ tính 23 2.1.3 Mồi đặc hiệu 23 2.1.4 Các loại đệm 23 2.1.5 Các hóa chất nguyên liệu khác 24 2.1.6 Máy móc thiết bị .24 Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân 2.2 PHƢƠNG PHÁP 24 2.2.1 Phƣơng pháp chấm kết tủa miễn dịch .24 2.2.2 Phƣơng pháp gắn kết hạt nano từ đƣợc chức hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao 26 2.2.3 Phƣơng pháp làm giàu vi khuẩn lao để làm khuôn cho phản ứng PCR… …27 2.2.4 Phƣơng pháp ly giải tế bào vi khuẩn lao thu ADN…………….……………27 2.2.5 Đánh giá độ bền phức hệ hạt từ gắn kháng thể kháng lao………………28 2.2.6 Nhân đoạn gen đích đặc hiệu PCR 29 2.2.7 Điện di gel agarose 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN GẮN KHÁNG THỂ LÊN BỀ MẶT HẠT NANO TỪ TRÊN BCG 32 3.1.1 Kiểm tra có mặt kháng thể kháng lao 32 3.1.2 Kiểm tra hiệu suất phản ứng gắn kết đệm khác nhau……….……34 3.1.3 Kết ly giải tế bào vi khuẩn lao phƣơng pháp khác 38 3.1.4 Tối ƣu hóa nồng độ BCG sử dụng 41 3.1.5 Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết 42 3.1.6 Độ đặc hiệu phƣơng pháp 43 3.2 THỬ NGHIỆM CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU LÊN MẪU BỆNH PHẨM 45 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG LAO .49 KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic AFB Acid Fast Bacilli AP Đệm gồm 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, mM MgCl2, pH 9,5 APTS – aminopropyl triethoxysilane BCG Bacillus Calmette Guerin bp Cặp bazơ (base pair) BSA Albumin huyết bò (Bovine Serum Albumin) dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate ĐC Đối chứng EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid IS Trình tự đoạn chèn vào (Insert Sequence) kb Kilobase MES - (N-morpholino) ethanesulfonic acid MTB Mycobacterium tuberculosis NP-NH2 Hạt nano từ có gắn nhóm amine NHS N-hydroxysuccinimide PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PBS-TBN Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01% Tween20; 0,1% BSA 0,05 M NaN3 TB Lao (Tuberculosis) TAE Tris base – Acid acetic - EDTA TE Tris-HCl – EDTA TET Tris-HCl – EDTA – Triton X-100 WHO Tổ chức Y tế Thế giới (World Health Organization) Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Số trang Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng phản ứng PCR 23 Bảng 2.2 Các thành phần phản ứng PCR với vaccine BCG 30 Bảng 2.3 Các thành phần phản ứng PCR với mẫu đờm lao 30 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 31 Bảng 3.1 Kết phân tích độ sáng vết đốm tròn màng lai 33 Bảng 3.2 Thành phần tỷ lệ chất tham gia gắn kết 35 Bảng 3.3 Đánh giá mức độ gắn kết qua phần mềm Image J 38 Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân DANH MỤC CÁC HÌNH Số trang Tên hình Hình 1.1 Vi khuẩn lao tiêu nhuộm Ziehl – Neelsen [35] Hình 1.2 Hệ gene chủng MTB H37Rv [16] Hình 1.3 Một cấu trúc tinh thể từ phân tử nano vàng [36] Hình 1.4 Hình ảnh hiển vi điện tử hạt nano từ Fe3O4 [37] Hình 1.5 Hạt nano từ tính Fe3O4 đƣợc chức hóa bề mặt nhóm amine sử dụng APTS [34] Hình 1.6 Quy trình gắn kết hạt nano đƣợc chức hóa với kháng thể [20] Hình 1.7 Nguyên tắc chọn lọc làm giàu tế bào từ trƣờng [6] Hình 2.1 Vaccine BCG sản xuất Việt Nam Hình 2.2 Mô hình hóa phức hệ hạt nano từ đƣợc chức hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao Hình 3.1 Kết kiểm tra có mặt kháng thể kháng lao Hình 3.2 Quy trình đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt Hình 3.3 Kết đánh giá mức độ phức hệ kháng thể gắn hạt Hình 3.4 Kết ly giải tế bào vi khuẩn lao phƣơng pháp khác Hình 3.5 Kết thử nghiệm nồng độ BCG sử dụng Hình 3.6 Tối ƣu hóa thời gian phản ứng gắn kết hạt nano – EDC kháng thể kháng lao Hình 3.7 Kết thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu Hình 3.8 Quy trình ứng dụng điều kiện tối ƣu mẫu đờm lao Hình 3.9 Kết thử nghiệm điều kiện tối ƣu mẫu bệnh lao Hình 3.10 Kết thử nghiệm điều kiện tối ƣu mẫu bệnh lao Hình 3.11 Tối ƣu hóa thời gian ủ mẫu đờm lao Hình 3.12 Quy trình đánh giá độ bền vững phức hạt nano từ gắn kháng thể Hình 3.13 Kết đánh giá độ bền vững phức hạt nano từ gắn kháng thể với mẫu vaccine BCG Hình 3.14 Thử nghiệm độ bền vững phức hạt nano từ gắn kháng thể với mẫu đờm lao Khoa Sinh học Footer Page of 16 14 16 19 20 21 22 26 33 36 37 39 41 42 44 45 46 47 48 49 50 51 Khóa 2010 - 2012 Header Page of Luận văn16 Thạc sĩ Khoa học Chử Lương Luân MỞ ĐẦU Bệnh lao ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao giới, bệnh đƣợc gây vi khuẩn lao có tên khoa học Mycobacterium tuberculosis (MTB) Tổ chức Y tế giới (WHO) ƣớc tính khoảng 1/3 dân số toàn cầu bị nhiễm MTB có khoảng 1,7 triệu ngƣời tử vong lao hàng năm, tức khoảng 4700 ngƣời tử vong ngày lao Mặc dù công tác tiêm chủng vaccine BCG, phòng chống phát triển thuốc chống lại vi khuẩn lao có bƣớc tiến đáng kể nhƣng bệnh lao vấn đề sức khỏe có tính thách thức toàn cầu Bệnh nhân bị nhiễm chủng vi khuẩn lao phát muộn khó điều trị tăng nguy lây truyền sang ngƣời lành Do việc chẩn đoán sớm chủng vi khuẩn lao góp phần đáng kể điều trị bệnh lao [1, 33] Để chẩn đoán vi khuẩn lao, bệnh viện sở y tế nƣớc phải dựa vào phƣơng pháp cổ điển nhƣ soi trực tiếp, nuôi cấy vi khuẩn…, yêu cầu số lƣợng vi khuẩn lao lớn thời gian chẩn đoán lao cần – tuần Với nhƣợc điểm nhƣ khó khăn cho công tác điều trị, khó đáp ứng yêu cầu giám sát toán bệnh lao [2, 3] Khắc phục nhƣợc điểm đó, việc ứng dụng sinh học phân tử kết hợp công nghệ nano tạo đột phá chẩn đoán vi khuẩn lao nhƣ chủng vi khuẩn khác Thời gian chẩn đoán rút ngắn xuống vài ngày, với độ nhạy độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho việc kiểm soát bệnh lao dễ dàng [23, 25] Công nghệ nano ngày có bƣớc tiến quan trọng chẩn đoán hỗ trợ điều trị bệnh nhằm mục đích cải thiện nâng cao sức khỏe ngƣời Trong số đó, hạt nano kim loại đặc biệt hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức hóa bề mặt đƣợc nghiên cứu, ứng dụng rộng rãi Khoa Sinh học Footer Page of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 10văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân năm gần đây, ví dụ nhƣ phân tách tế bào, tách chiết acid nucleic (ADN, ARN), gắn kết với kháng thể…[5, 27] Xuất phát từ thực tế tiến hành “Nghiên cứu thử nghiệm hạt nano kim loại đƣợc chức hóa bề mặt chẩn đoán vi khuẩn lao” với mục tiêu sau : Xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức hóa bề mặt với kháng thể kháng vi khuẩn lao đánh giá khả làm giàu MTB hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức hóa bề mặt gắn anti-TB để phát MTB kỹ thuật PCR Khoa Sinh học Footer Page 10 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 52văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân Hình 3.7 Kết thí nghiệm kiểm tra tính đặc hiệu Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương Giếng : Mẫu vaccine BCG Giếng : dung dịch chứa vi khuẩn Bacillus licheniformic Giếng : dung dịch chứa vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes Nhƣ biết, hai chủng vi khuẩn vi khuẩn hiếu khí, B lichenifocmic vi khuẩn gram dƣơng P pseudoalcaligenes vi khuẩn gram âm Đây hai chủng vi khuẩn điển hình nghiên cứu vi sinh vật [26, 30] Kết điện di sản phẩm PCR để đánh giá độ đặc hiệu hƣơng pháp (hình 3.7) cho thấy mẫu vaccine BCG xuất băng rõ nét tƣơng đƣơng với đối chứng dƣơng có kích thƣớc 249 bp, đối chứng âm mẫu vi khuẩn B lichenifocmic P pseudoalcaligenes không thấy xuất băng ADN Điều chứng tỏ phƣơng pháp có tính đặc hiệu vi khuẩn lao Khoa Sinh học Footer Page 52 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 53văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân 3.2 THỬ NGHIỆM CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU LÊN MẪU BỆNH PHẨM Với thành công đạt đƣợc việc nghiên cứu, tối ƣu điều kiện gắn kết hạt nano từ với kháng thể kháng lao qua cầu nối EDC tìm phƣơng pháp hiệu để ly giải thu nhận ADN vi khuẩn lao từ mẫu vaccine BCG, tiếp tục thử nghiệm mẫu bệnh phẩm đờm lao Mẫu đờm lao bệnh nhân bị bệnh lao đƣợc nhận từ Viện Quân y 103 Các mẫu đờm đƣợc Viện 103 chẩn đoán phƣơng pháp soi trực tiếp Ứng dụng điều kiện tối ƣu thu đƣợc từ nghiên cứu tiến hành thí nghiệm với mẫu đờm lao theo sơ đồ hình 3.8 nhƣ sau Hình 3.8 Quy trình ứng dụng điều kiện tối ƣu mẫu đờm lao Khoa Sinh học Footer Page 53 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 54văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân Sau thu đƣợc phần dịch làm khuôn cho phản ứng PCR, ban đầu sử dụng ADN taq polymerase với thành phần phản ứng nhƣ trình bày bảng 2.2 Tuy nhiên, kết điện di sản phẩm PCR gel agarose 2% không xuất băng hầu hết mẫu Chính vậy, định sử dụng ADN dream taqTM polymerase thay cho ADN taq polymerase với thành phần phản ứng nhƣ trình bày bảng 2.3 ADN dream taqTM polymerase Taq polymerase tăng cƣờng tối ƣu phản ứng PCR chuẩn, cho phép tăng độ nhạy sản lƣợng sản phẩm PCR điều kiện phản ứng so với ADN taq polymerase [38] Hình 3.9 Kết thử nghiệm điều kiện tối ƣu mẫu bệnh lao Giếng (-) : Đối chứng âm Giếng M : Thang chuẩn ADN kb Giếng (+) : Đối chứng dương Giếng 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 : Các mẫu số đến Giếng 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 : Phần dịch lại mẫu tương ứng Khoa Sinh học Footer Page 54 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 55văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân Hình 3.10 Kết thử nghiệm điều kiện tối ƣu mẫu bệnh lao Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương Giếng 1, 3, 5, 7, 9: Các mẫu số đến 12 Giếng 2, 4, 6, 8, 10: Phần dịch lại mẫu tương ứng Kết điện di gel sản phẩm PCR hình 3.9 3.10 cho thấy, giếng đối chứng âm hai hình khuôn nên không cho băng sản phẩm PCR, giếng đối chứng dƣơng với khuôn ADN MTB có băng 249 bp Ở tất mẫu đƣợc nghiên cứu phần dịch lại không xuất băng, điều đƣợc giải thích phần dịch chứa nhiều chất ức chế phản ứng PCR không chứa ADN vi khuẩn lao Trong đó, mẫu từ số đến mẫu số cho băng ADN có kích thƣớc 249 bp, điều phù hợp với kết soi trực tiếp Viện 103 mẫu bệnh nhân dƣơng tính với MTB Tuy nhiên có điều đáng lƣu ý số mẫu âm tính với MTB mà tiếp nhận từ Viện 103, mẫu số 10 cho băng ADN có kích thƣớc 249 bp nhƣ với mẫu dƣơng tính, kết lặp lại lần tƣơng tự Kết đƣợc Khoa Sinh học Footer Page 55 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 56văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân ghi nhận giải thích phƣơng pháp sử dụng có tính nhạy cao so với phƣơng pháp soi trực tiếp Viện 103 Và để chứng minh cho điều nghiên cứu thời gian tiếp theo, nghiên cứu với số lƣợng mẫu nhiều Sau thử nghiệm điều kiện tối ƣu mẫu bệnh phẩm, tiếp tục nghiên cứu tối ƣu thời gian ủ mẫu bệnh phẩm nhằm mục đích tiết kiệm thời gian hoàn thành quy trình Các khoảng thời gian đƣợc thử nghiệm 15 phút, 30 phút 45 phút Kết đƣợc thể hình 3.11 dƣới Hình 3.11 Tối ƣu hóa thời gian ủ mẫu đờm lao Giếng (-) : Đối chứng âm, Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương Giếng 1, : Mẫu đờm lao phần dịch lại thời gian ủ 15 phút Giếng 3, : Mẫu đờm lao phần dịch lại thời gian ủ 30 phút Giếng 5,6 : Mẫu đờm lao phần dịch lại thời gian ủ 45 phút Kết hình 3.11 cần ủ mẫu đờm lao vòng 30 phút cho kết băng ADN 249 bp, điều cần thiết cho việc rút ngắn thời gian chẩn đoán bệnh Khoa Sinh học Footer Page 56 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 57văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘ BỀN CỦA PHỨC HỆ HẠT NANO TỪ GẮN KHÁNG THỂ KHÁNG LAO Theo đánh giá chúng tôi, việc tạo đƣợc liên kết gắn kết hạt nano từ với kháng thể thông qua cầu nối EDC thành công mà minh chứng ứng dụng nghiên cứu, thử nghiệm mẫu vaccine BCG mẫu đờm lao đạt kết cao Tuy nhiên, phức hệ sinh học dễ biến đổi không đƣợc áp dụng biện pháp bảo quản thích hợp Bên cạnh đó, nhằm hƣớng tới việc chế tạo sinh phẩm phát vi khuẩn lao tiến hành bảo quản phức hệ dung dịch PBS-TBN (Đệm PBS pH 7,4 bổ sung 0,01% Tween20; 0,1% 0,05 M NaN3) tiến hành đánh giá độ bền vững phức hệ dung dịch bảo quản qua mốc thời gian : 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày theo quy trình hình 3.12 Hình 3.12 Quy trình đánh giá độ bền vững phức hạt nano từ gắn kháng thể Khoa Sinh học Footer Page 57 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 58văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân Các dịch thu đƣợc sau ly giải đƣợc bảo quản 4oC, đến ngày thứ 28 tất mẫu đƣợc tiến hành chung phản ứng PCR Hình 3.13 Kết đánh giá độ bền vững phức hạt nano từ gắn kháng thể với mẫu vaccine BCG Giếng (-) : Đối chứng âm Giếng M : Thang chuẩn ADN kb Giếng (+) : Đối chứng dương Giếng 1-8 : Kết đánh giá độ bền vững phức hạt nano từ gắn kháng thể mốc thời gian 0, 1, 3, 7, 10, 14, 21, 28 ngày Kết điện di hình 3.13 cho thấy tất mốc thời gian xuất băng ADN nhân có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho vi khuẩn lao, có nghĩa phức hệ hạt từ gắn kháng thể bền vững dung dịch bảo quản PBS-TBN hay nói cách khác dung dịch PBS-TBN thích hợp cho việc lƣu giữ phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể Sau nghiên cứu độ bền vững phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể dung dịch bảo quản PBS-TBN mẫu vaccine BCG tiến hành Khoa Sinh học Footer Page 58 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 59văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân thử nghiệm ngày 28 với mẫu đờm lao kết thành công xuất băng ADN nhân có kích thƣớc 249 bp đặc hiệu cho MTB Kết thể hình 3.14 Hình 3.14 Thử nghiệm độ bền vững phức hạt nano từ gắn kháng thể với mẫu đờm lao Giếng (-) : Đối chứng âm Giếng M : Thang chuẩn ADN 100 bp Giếng (+) : Đối chứng dương Giếng : Thử nghiệm mức độ bền vững phức hệ mẫu đờm lao ngày 28 Giếng : Phần dịch lại mẫu đờm lao ngày thử nghiệm 28 Theo nhiều nghiên cứu PBS-TBN dung dịch thƣờng đƣợc sử dụng để bảo quản phức hệ sinh học Công trình nghiên cứu Ambrosino E cộng [8] cho thấy PBS-TBN có tác dụng lƣu giữ hoạt tính phức hệ peptide bắt nguồn từ protein Starp hồng cầu Plasmodium falciparum với hạt đƣợc bọc lớp kháng nguyên đƣợc 01 tháng, peptide bắt nguồn từ protein Lsa1, Lsa3, Glurp, Salsa, Trap, CSP Pf11.1 hồng cầu Plasmodium falciparum peptide bắt nguồn từ protein gSG6 nƣớc bọt loài Khoa Sinh học Footer Page 59 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 60văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân Anopheles gambiae với hạt đƣợc bọc lớp kháng nguyên đƣợc 03 tháng Đáng ý phức hệ đƣợc tạo thông qua cầu nối trung gian EDC NHS Chính vậy, nói kết đạt đƣợc việc sử dụng dung dịch PBS-TBN lƣu giữ độ bền vững phức hệ hạt nano từ gắn kháng thể kháng lao có ý quan trọng việc định hƣớng phát triển sinh phẩm phát sớm vi khuẩn lao, góp phần phòng chống lao đất nƣớc Việt Nam nhƣ giới Khoa Sinh học Footer Page 60 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 61văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân KẾT LUẬN VÀ HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu trên, rút đƣợc kết luận nhƣ sau: Đã xây dựng đƣợc quy trình sử dụng hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức hóa bề mặt chẩn đoán vi khuẩn lao đối tƣợng vaccine BCG, gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức hóa bề mặt với kháng thể kháng lao với việc sử dụng cho phản ứng 71µl đệm PBS pH 6,5; 2µl kháng thể kháng lao (7 mg/ml); µl EDC (250 mg/ml), hỗn hợp đƣợc ủ 22 oC 30 phút cho phép phát BCG nồng độ 4x10-5mg/ml Đã thử nghiệm thành công điều kiện tối ƣu quy trinh mẫu bệnh phẩm (đờm lao), sử dụng cặp mồi đặc hiệu IS6110 ADN Dream taq TM polymerase 100% mẫu bệnh lao dƣơng tính đƣợc chẩn đoán có kết trùng với kết Viện Quân Y 103 Phức hệ hạt nano từ gắn kết với kháng thể kháng lao qua cầu nối EDC đƣợc bảo quản dung dịch PBS-TBN có độ bền đến ngày thứ 28 thử nghiệm với mẫu vaccine BCG mẫu đờm lao HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Tiếp tục thử nghiệm độ xác quy trình chẩn đoán vi khuẩn lao hạt từ nano đƣợc chức hóa bề mặt số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm nhiễm lao, đồng thời mở rộng đối tƣợng vi khuẩn, virus khác Tiến tới chế tạo sinh phẩm phát vi khuẩn lao phối hợp với phòng xét nghiệm bệnh viện để thử nghiệm ứng dụng hạt nano từ đƣợc chức hóa bề mặt chẩn đoán bệnh liên quan đến vi khuẩn lao Khoa Sinh học Footer Page 61 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 62văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bộ Y tế (2012), Báo cáo tổng kết chương trình phòng chống lao quốc gia, Hội nghị tổng kết công tác chống lao giai đoạn 2007 - 2011, định hƣớng hoạt động giai đoạn 2012 – 2015, Hà Nội ngày 24 tháng 03 năm 2012 Nguyễn Thị Chính, Trƣơng Thị Hòa (2005), Vi sinh vật Y học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Nguyễn Việt Cồ, Trần Văn Sáng, Ngô Ngọc Am, Lê Ngọc Hƣng, Mai Văn Khƣơng, Nguyễn Xuân Nghiêm, Trần Thị Xuân Phƣơng (2006), Bệnh học lao, NXB Y học Nguyễn Hữu Đức, Trần Mậu Danh, Trần Thị Dung (2007), “Chế tạo nghiên cứu tính chất từ hạt nano Fe3O4 ứng dụng y sinh học”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 23, tr 231-237 Nguyễn Hoàng Hải (2007), “Các hạt nano kim loại (Metallic nanoparticles)”, Tạp chí Vật lý Việt Nam, 1(1), tr 7-10 Nguyễn Hoàng Hải, Nguyễn Châu, Nguyễn Hoàng Lƣơng, Nguyễn Thị Vân Anh, Phan Tuấn Nghĩa, Mai Anh Tuấn (2007), Ứng dụng hạt nano ôxít sắt từ để tách chiết DNA, đếm tế bào bạch cầu, cải tiến trình xử lí nước nhiễm bẩn, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Vật lý Chất rắn toàn quốc lần thứ 5, Vũng Tàu, 12-14/11/2007, tr.18-24 TIẾNG ANH Adikaram C.P., Perera J., Wijesundera S.S (2012), “The manual mycobacteria growth indicator tube and the nitrate reductase assay for the rapid detection of rifampicin resistance of M Tuberculosis in low resource settings”, BMC Infect Dis.12: 326 Ambrosino E., Dumoulin C., Orlandi-Pradines E., Remoue F., Toure A., Tall A., Sarr J.B., Poinsignon A., Sokhna C., Puget K., Jean T., Pascual A., Druilhe P., Fusai T., Rogier C (2010), “A multiplex assay for the simultaneous Khoa Sinh học Footer Page 62 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 63văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân detection of antibodies against 15 Plasmodium falciparum and Anopheles gambiae saliva antigens”, Malar J 9: 317 Amita J., Vandana T., Guleria R.S., Verma R.K (2002), “Qualitative Evaluation of Mycobacterial DNA Extraction Protocols for Polymerase Chain Reaction”, Mol Biol Today 3: 43-50 10 Arruebo M., Valladares M (2009), “Antibody-Conjugated Nanoparticles for Biomedical Applications”, J Nanomater 2009: 1-24 11 Awua A.K., Doe E.D., Gyamfi O.K (2010), “Evaluation of cost- effective total nucleic acidsextraction protocols for cultured Mycobacterium tuberculosis; a comparison by PCR amplification of genes associated with drug resistance”, BMC Res Notes 3:48 12 Bemer P., Palicova F., Rusch-Gerdes S., Dugeon H.B., Pfyffer G.E (2002), “Multicentre evaluation of fully automatic BACTEC mycobacteria growth indicator tube 960 system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis”, J Clin Microbiol 40: 150-154 13 Brighenti S., Lerm M (2012), “How Mycobacterium tuberculosis Manipulates Innate and Adaptive Immunity – New Views of an Old Topic”, Pathog J 4: 42-53 14 Bruce I.J., Taylor J., Michael T., Martin J.D., Borioni E., Sangregorio C., Sen T (2004), “Synthesis,characterisation and application of silica-magnetite nanocomposites”, J Magnet Magnet Mater 284: 145–160 15 Campo A.D., Sen T., Lelluoche J.P., Bruce I.J (2005), “Multifunctional magnetite and silica-magnetite nanoparticles: Synthesis, surface activation and applications in life science”, J Magnet Magnet Mater 293: 33–40 16 Cole S T., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C E., Tekaia F., Badcock K., Basham D., Brown D., Chillingworth T., Connor R., Davies R., Devlin K., Feltwell T., Gentles S., Hamlin N., Holroyd S., Hornsby T., Jagels K., Krogh A., McLean J., Moule S., Murphy L., Oliver K., Osborne J., Quail M A., Rajandream M.A., Khoa Sinh học Footer Page 63 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 64văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân Rogers J., Rutter S., Seeger K., Skelton J., Squares R., Squares S., Sulston J E., Taylor K., Whitehead S., Barrell B.G (1998), “Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence”, Nature 393: 537-544 17 Cousins D.V., Bastida R., Cataldi A., Quse V., Redrobe S., Dow S., Duignan P., Murray A., Dupont C., Ahmed N., Collins D.M., Butler W.R., Dawson D., Rodriguez D., Loureiro J., Romano M.I., Alito A., Zumarraga M (2003), “Tuberculosis in seals caused by a novel member of the Mycobacterium tuberculosis complex: Mycobacterium pinnipedii sp”, Int J Syst Evol Microbiol 53: 1305-1314 18 Eichbaum Q., Rubin E.J (2002), “Tuberculosis: Advances in Laboratory Diagnosis and Drug Susceptibility Testing”, Am J Clin Pathol 118: S3-S17 19 Emovon O (2009), “Current trends in the laboratory diagnosis of Tuberculosis”, Benin J Postgrad Med 11: 80-90 20 Hermanson G T (2008), Bioconjugate techniques 2nd Edition, San Diego: Academic Press, 1202 p 21 Kolk A.H.J., Kox L.F.F., Leeuwen J.V., Kuijper S.,Jansen H.M (1998), “Clinical utility of the polymerase chain reaction in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis”, Eur Res J 11: 1222–1226 22 Kubica G.P., Dye W.E., Cohn M.L., Middlebrook G (1963), “Sputum digestion and decontamination with N-Acetyl-l-cysteine sodium hydroxide for culture of bacteria”, Am Rev Resp Dis 87: 775–779 23 Kumar N., Kumar P (2011), “Nanotechnology: A focus on Treatment of Tuberculosis”, Int J Drug Del 3: 25-42 24 Letfullin R., Murphy B (2011), “Application of plasmonic nanomaterials in Nanomedicine”, Nanomater.: Appl Prop 1: 92-96 Khoa Sinh học Footer Page 64 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 65văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận 25 Chử Lương Luân Mathuria J.P (2009), “Nanoparticles in tuberculosis diagnosis, treatment and prevention: A hope for future”, Dig J Nanomater Biostr 4: 309 – 312 26 Němečková I Solichová K., Roubal P., Uhrová B., Šviráková E (2011), “Methods for Detection of Bacillus sp., B Cereus and B licheniformis in Raw Milk”, Czech J Food Sci 29: S55–S60 27 Pankhurst Q.A., Connolly J., Jones S.K., Dobson J (2003), “Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine”, J Physic D: Appl Physic 36: 167-181 28 Pooja M.T., Komal V., Vida A., Shree R (2011), “Functionalized Gold Nanoparticles and Their Biomedical Applications”, Nanomater 1: 31-63 29 Rai M., Yadav A., Gade A (2009), “Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials”, Biotechnol Adv 27: 76-83 30 Shi B., Xia X (2003), “Morphological changes of Pseudomonas pseudoalcaligenes in response to temperature selection”, Current Microbiol 46: 120–123 31 Shukla I., Varshney S., Malik A (2011), “Evaluation of nested PCR targeting IS6110 of Mycobacterium tuberculosis for the diagnosis of pulmonary and extra-pulmonary tuberculosis”, Biol and Med 3: 171-175 32 Sounderya N., Zhang Y (2008), “Use of Core/Shell Structured Nanoparticles for Biomedical Applications”, Rec Pat Biomed Engin 1: 34-42 33 WHO (2012), Global Tuberculosis report, WHO report 2012 34 Wu W., He Q., Jiang Q (2008), “Magnetic Iron Oxide Nanoparticles: Synthesis and Surface functionalization strategies”, Nanoscale Res Lett 3:397– 415 Khoa Sinh học Footer Page 65 of 16 Khóa 2010 - 2012 Header Page 66văn of Thạc 16 sĩ Khoa học Luận Chử Lương Luân TÀI LIỆU INTERNET 35 http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Mycobacterium_tuberculosis_Zi ehl-Neelsen_stain_02.jpg 36 http://www.rsc.org/chemistryworld/news/2007/october/18100702.asp 37 http://openi.nlm.nih.gov/ 38 http://www.thermoscientificbio.com/pcr-enzymes-master-mixes-and- reagents/dreamtaq-dna-polymerase/ 39 http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Dot%20blot%20protocol.pdf Khoa Sinh học Footer Page 66 of 16 Khóa 2010 - 2012 ... tiến hành Nghiên cứu thử nghiệm hạt nano kim loại đƣợc chức hóa bề mặt chẩn đoán vi khuẩn lao với mục tiêu sau : Xây dựng quy trình gắn kết hạt nano kim loại có từ tính đƣợc chức hóa bề mặt với... VỀ HẠT NANO KIM LOẠI 11 1.2.1 Tính chất hạt nano kim loại 11 1.2.2 Một số loại hạt nano kim loại 13 1.2.3 Ứng dụng hạt nano kim loại y học 17 1.3 CHỨC NĂNG HÓA BỀ MẶT HẠT... bệnh lao, chẩn đoán vi khuẩn lao ƣu tiên hàng đầu công tác chống lao Vi t Nam 1.1.4 Các phƣơng pháp chẩn đoán vi khuẩn lao Phát đƣợc vi khuẩn lao tiêu chuẩn định để chẩn đoán bệnh lao Chẩn đoán vi