Header Page of 148 LỜI CAM ĐOAN Luận án sản phẩm khoa học thuộc đề tài.“Nghiên cứu quy trình công nghệ tạo chế phẩm CoQ10 từ Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp để sản xuất thực phẩm chức năng” mã số ĐT.07.14/CNSHCB Bộ Công thương Là người tham gia trực tiếp nội dung thuộc đề tài trình bày luận án này, xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận án trung thực chưa tác giả khác công bố công trình nghiên cứu chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng vào luận án Hà Nội, ngày tháng năm 2016 GVHD GVHD Nghiên cứu sinh GS.TS Đặng Thị Thu PGS.TS Trƣơng Quốc Phong Nguyễn Việt Phƣơng Footer Page of 148 Header Page of 148 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới GS.TS Đặng Thị Thu, nguyên Phó viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, PGS.TS Trương Quốc Phong, Trưởng phòng Proteomic - Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình hướng dẫn, bảo cho suốt trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cám ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm, Trưởng môn Vi Sinh – Hóa sinh Sinh học Phân tử thầy giáo, cán bộ môn Vi sinh – Hóa sinh Sinh học Phân tử, Trung tâm Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình giúp đỡ, dạy bảo động viên trình học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cám ơn tới Ban giám hiệu Trường Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm tạo điều kiện giúp đỡ thời gian vật chất để hoàn thành Luận án Cuối cùng, xin bày tỏ lòng kính yêu biết ơn tới gia đình, bố mẹ, vợ, anh chị em, bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Footer Page of 148 Header Page of 148 MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 CẤU TẠO COENZYME Q10 1.2 NGUỒN THU COENZYME Q10 1.2.1 Tổng hợp hóa học 1.2.2 Coenzyme Q10 từ động vật, thực vật 1.2.3 Coenzyme Q10 từ vi sinh vật 1.3 CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ VI SINH VẬT 1.4 LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A TUMEFACIENS 10 1.4.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon nồng độ cacbon 10 1.4.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ nồng độ nitơ 11 1.4.3 Ảnh hưởng nguồn khoáng 12 1.4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ 12 1.4.5 Ảnh hưởng pH 13 1.4.6 Ảnh hưởng nồng độ oxy hòa tan 13 1.5 KỸ THUẬT LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 14 1.5.1 Lên men gián đoạn 14 1.5.2 Lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng (Fed – batch) 14 1.6 TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH COENZYME Q10 15 1.6.1 Tách chiết Coenzyme Q10 15 1.6.2 Tinh Coenzyme Q10 17 1.6.3 Đặc tính Coenzyme Q10 18 1.7 CẢI BIẾN CHỦNG VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 21 1.7.1 Đột biến chủng 21 1.7.2 Chủng tái tổ hợp 21 1.8 VAI TRÕ VÀ ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 29 1.8.1 Vai trò Coenzyme Q10 29 1.8.2 Ứng dụng Coenzyme Q10 31 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 35 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 35 2.1.2 Hóa chất 35 2.1.3 Thiết bị sử dụng 36 2.1.4 Môi trường dung dịch sử dụng 37 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1 Phương pháp vi sinh 38 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 39 2.2.3 Phương pháp hóa lý, hóa sinh 46 2.2.4 Phương pháp toán học 52 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 55 3.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN A TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 55 3.1.1 Phân lập, tuyển chọn chủng sinh tổng hợp Coenzyme Q10 55 3.1.2 Định tên chủng A tumefaciens TT4 59 3.2 NGHIÊN CỨU CẢI BIẾN A TUMEFACIENS SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 61 Footer Page of 148 Header Page of 148 3.2.1 Tách dòng gen dps dxs từ A tumefaciens TT4 61 3.2.2 Tạo cấu trúc biểu mang gen dps dxs 66 3.3 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP 73 3.3.1 Ảnh hưởng điều kiện môi trường đến khả sinh tổng hợp CoQ10 74 3.3.2 Ảnh hưởng pH đầu môi trường 78 3.3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ giống 78 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 79 3.3.5 Ảnh hưởng thời gian 80 3.4 TỐI ƢU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP COENZYME Q10 TỪ A TUMEFACIENS 81 3.4.1 Chọn miền khảo sát 81 3.4.2 Thiết lập mô hình 82 3.4.3 Tối ưu hóa trình sinh tổng hợp Coenzyme Q10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 84 3.5 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH COENZYME Q10 TỪ CHỦNG A TUMEFACIENSTÁI TỔ HỢP 85 3.5.1 Đánh giá phương pháp phá vỡ tế bào 85 3.5.2 Xác định điều kiện xử lý tế bào ethanol 86 3.5.3 Nghiên cứu tinh Coenzyme Q10 88 3.5.4 Quy trình thu nhận Coenzyme Q10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 93 3.6 KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH HÓA LÝ CỦA COENZYME Q10 95 3.6.1 Ảnh hưởng nhiệt độ tới độ bền Coenzyme Q10 95 3.6.2 Ảnh hưởng pH tới độ bền Coenzyme Q10 96 3.6.3 Ảnh hưởng ánh sáng tới độ bền Coenzyme Q10 97 3.7 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA COENZYME Q10 98 3.7.1 Hoạt tính chống oxy hóa Coenzyme Q10 98 3.7.2 Khả ức chế tế bào ung thư Coenzyme Q10 99 3.8 ỨNG DỤNG CỦA COENZYME Q10 TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG DƢỚI DẠNG VIÊN NANG 101 3.8.1 Nghiên cứu tạo phức hợp Coenzyme Q10 với β-Cyclodextrin 101 3.8.2 Khảo sát số đặc tính phức CoQ10- β- Cyclodextrin 102 3.8.3 Xây dựng quy trình điều chế viên nang cứng chứa Coenzyme Q10 105 3.8.4 Phân tích, đánh giá viên nang chứa Coenzyme Q10 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO 115 PHỤ LỤC 124 Footer Page of 148 Header Page of 148 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT Kí hiệu Tên Amp Ampicilline ATP Adenosine triphosphate Bp Cặp base Cfu Colony forming unit CoQ Coenzyme Q CoQ10 Coenzyme Q10 CoQ10H2 Coenzyme Q10 quinol CSL Corn steep Liquor CSP Corn steep Powder DO Dissolved oxygen DNA Deoxyribonucleic acid DPS Decaprenyl diphosphate synthase DXS 1- deoxy-D- xylulose 5- phosphate synthase DMAPP Dimethylallyl diphosphate EtBr Ethidium bromide FPP Farnesyl phosphate HPLC High-performance liquid chromatography IPP Isopentenyl diphosphate Kan Kannamycine kDa Killo Dalton LB Luria-Bertani MEP 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate MVA Mevalonate OD Mật độ quang (độ hấp thụ) PCR Phản ứng chuỗi polymerase Phba p-hudroxybenzoic acid v/w Thể tích/khối lượng v/v Thể tích/thể tích Footer Page of 148 Header Page of 148 DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1 Các trạng thái khác CoQ10 Hình Vị trí CoQ10 lớp kép lipid Hình 1.3 Quá trình tổng hợp hợp chất trung gian quan trọng: để tổng hợp CoQ10 Hình 1.4 Con đường trao đổi chất tổng hợp CoQ10 Hình 1.5 Cấu tạo β – cyclodextrin 19 Hình 1.6 Chuỗi vận chuyển điện tử 30 Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu mang gene dps…………………………….…43 Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu mang gene dxs 44 Hình 2.3 Sơ đồ thiết kế plasmid biểu mang đồng thời hai gene dps dxs 45 Hình 2.4 Phản ứng ethyl cyanoacetate CoQ10 48 Hình 2.5 Phương trình phản ứng trung hòa gốc DPPH chất chống oxy hóa 50 Hình 3.1 Hình ảnh nhuộm Gram số chủng phân lập (TT4, ML5), chủng chuẩn A tumefaciens ứng EHA AA2 .……………………………………………………….55 Hình 3.2 Khả sinh 3-ketolactose chủng lựa chọn A: Màu khuẩn lạc thêm thuốc thử Benedict B: Màu khuẩn lạc thêm thuốc thử Benedict sau 75 phút 56 Hình 3.3 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) sản phẩm cắt DNA enzyme hạn chế cho gene dps (B) Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dps từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước sau cắt PstI chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) 58 Hình Phổ điện di sản phẩm PCR (A) sản phẩm cắt DNA enzyme hạn chế cho gene dxs (B) Đường chạy 1-12 (A), sản phẩm PCR gene dxs từ DNA tổng số chủng TT1, TT2.1, TT2.2, TT3, TT4, ML1-ML7, tương ứng Đường chạy 1-8 (B), sản phẩm PCR trước sau cắt NdeI chủng TT1, TT2-1, TT2-2, TT4, tương ứng M, thang DNA chuẩn 100 bp (Fermentas) 58 Hình 3.5 Khả sinh tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens phân lập 59 Hình 3.6 Phổ điện di DNA tổng số tách chiết từ A tumefaciens TT4 61 Hình 3.7 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) dxs (B) từ DNA tổng số A tumefaciensTT4 M, thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scientific, Mỹ) 62 Hình Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) dxs (B) từ DNA plasmid dòng tái tổ hợp C3, C6 khuôn DNA plasmid tách chiết từ clone số số TT4 khuôn DNA tổng số tách chiết từ chủng A tumefaciens TT4 Đường chạy M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 63 Hình Phổ điện di sản phẩm cắt DNA plasmid enzyme hạn chế dòng số mang gen dps (A) dòng mang gen dxs (B) Đường chạy 1, DNA plasmid chưa cắt; đường chạy 2, DNA plamid cắt cặp enzyme SacI/BamHI BamHI/SalI tương ứng với clone Đường chạy M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 63 Hình 3.10 Trình tự nucleotide axit amin suy diễn gen dps tách dòng 64 Hình 3.11 Trình tự nucleotide axit amin suy diễn gen dxs tách dòng 66 Hình 12 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) cắt enzyme hạn chế (B) dòng lựa chọn gen dps Đường chạy 1-8 tương ứng với dòng lựa chọn ĐC sản phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen Đường chạy (+) sản phẩm PCR từ khuôn gốc Đường chay (-) sản phẩm cắt plasmid đối chứng M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 67 Hình 3.13 Phổ điện di sản phẩm PCR (A) cắt enzyme hạn chế (B) dòng lựa chọn gen dxs Đường chạy 1-2 tương ứng với dòng lựa chọn ĐC sản Footer Page of 148 Header Page of 148 phâm PCR từ khuôn plasmid pCAMBIA1301 đối chứng không mang gen M thang DNA chuẩn 100bp (Thermo Scienctific, Mỹ) 68 Hình 3.14 Phổ điện di sản phẩm PCR từ khuôn plasmid 10 dòng sử dụng cặp mồi DpsF/R (A) sản phẩm cắt enzyme hạn chế (B) Đường chạy 1-10, sản phẩm PCR từ khuôn plasmid 10 dòng tương ứng; mẫu đối chứng sử dụng khuôn pCAM-dxs (ĐC); RE/9, dòng số xử lý SacI/BamHI thang DNA chuẩn 100 bp (M1) 1kb (M2) 69 Hình 3.15 Phổ sắc ký HPLC CoQ10 chuẩn (A) 70 Hình 3.16 Khả sinh tổng hợp CoQ10 chủng A tumefaciens tái tổ hợp Chủng tái tổ hợp chứa vector tái tổ hợp mang đơn gen pCAM-pds pCAM-dxs đồng thời hai gen pCAM-dps-dxs Chủng đối chứng mang vector pCAMBIA1301 71 Hình 3.17 Khả sinh tổng hợp CoQ10 dòng A tumefaciens tái tổ hợp mang cấu trúc pCAM-dps-dxs 72 Hình 3.18 Phổ điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen dps (A) dxs (B), sản phẩm cắt enzyme hạn chế SacI/BamHI từ DNA plasmid A tumefaciens DPSX12 73 Hình 3.19 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 74 Hình 3.20 Ảnh hưởng nồng độ sucrose đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 75 Hình 21 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 76 Hình 22 Ảnh hưởng nồng độ cao ngô đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 77 Hình 23 Ảnh hưởng pH đầu đến khả tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 78 Hình 3.24 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 79 Hình 3.25 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 80 Hình 26 Ảnh hưởng thời gian đến lên men sinh tổng hợp CoQ10 từ A tumefaciens 81 Hình 3.27 Bề mặt đáp ứng hàm lượng CoQ10 84 Hình 3.28 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ưu nuôi cấy chủng A tumefacienstái tổ hợp 84 Hình 3.29 Các phương pháp xử lý phá vỡ tế bào tách thu CoQ10 85 Hình 3.30 Ảnh hưởng tỷ lệ ethanol/sinh khối đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ 86 Hình 3.31 Ảnh hưởng thời gian đồng hóa đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp 87 Hình 3.32 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng CoQ10 tách chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp 88 Hình 3.33 Phổ sắc ký HPLC CoQ10 chuẩn (A) dịch chiết từ A tumefaciens tái tổ hợp (B) 89 Hình 3.34 So sánh độ dịch chiết CoQ10 CoQ10 chuẩn L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn, S dịch CoQ10 chuẩn 90 Hình 3.35 Phổ hấp thụ dịch chiết CoQ10 theo số lần chiết khác 91 Hình 3.36 So sánh độ dịch tinh CoQ10 CoQ10 chuẩn L1 dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau lần chiết, L3, dịch chiết CoQ10 sau lần chiết, S dịch CoQ10 chuẩn 92 Hình 3.37 So sánh độ dịch tinh CoQ10 CoQ10 chuẩn L3, dịch chiết CoQ10 từ sinh khối vi khuẩn sau lần chiết; E1, dịch CoQ10 sau tinh sắc ký cột silica gel; S, dịch CoQ10 chuẩn 93 Footer Page of 148 Header Page of 148 Hình 3.38 Quy trình thu nhận CoQ10 từ A tumefaciens tái tổ hợp 94 Hình 3.39 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền CoQ10 tách chiết từ tế bào A tumefaciens 96 Hình 3.40 Ảnh hưởng pH đến độ bền CoQ10 tách chiết từ tế bào A tumefaciens 97 Hình 3.41 Ảnh hưởng ánh sáng đến độ bền CoQ10 tách chiết từ tế bào A tumefaciens 97 Hình 3.42 Khả chống oxi hóa CoQ10 98 Hình 3.43 Phản ứng CoQ10 nồng độ khác với DPPH (T-mẫu trắng) 99 Hình 3.44 Ảnh hưởng CoQ10 lên dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-2C (A), FL (B) tế bào thận thỏ bình thường RK13 (C) Một số hình ảnh tế bào đại diện nồng độ 0, 20 80 µM CoQ10 100 Hình 3.45 Hiệu suất thu hồi CoQ10 theo tỷ lệ phối trộn CoQ10 với β-cyclodextrin 102 Hình 3.46 Khả hòa tan phức β-CDQ10 nước CoQ10 tạo phức với Cyclodextrin theo tỷ lệ khác 103 Hình 3.47 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền CoQ10 phức β- CDQ10 104 Hình 3.48 Ảnh hưởng ánh sáng đến độ bền CoQ10 phức β- CDQ10 105 Hình 3.49 Quy trình công nghệ sản xuất viên nang thực phẩm chức chứa CoQ10 106 Hình 3.50 Viên nang thực phẩm chức bổ sung chứa CoQ10 107 Footer Page of 148 Header Page of 148 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các gen mã hóa cho enzyme xúc tác tới trình tổng hợp CoQ10 Bảng 1.2 Chủng chủ hệ biểu vi khuẩn dùng để sinh tổng hợp CoQ10 26 Bảng 2.1 Các plasmid sử dụng……………………………………………………………35 Bảng 2.2 Máy thiết bị 36 Bảng 2.3 Chương trình thực phản ứng PCR nhân gen dps 40 Bảng 2.4 Chương trình thực phản ứng PCR nhân gen dxs 40 Bảng 2.5 Các biến số khoảng chạy chúng 52 Bảng 2.6 Ma trận thực nghiệm 53 Bảng 3.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng phân lập…………………………….57 Bảng 3.2 Mã số trình tự số chủng A tumfaciens ngân hàng gen 60 Bảng 3.3 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố hàm lượng CoQ10 thu 82 Bảng 3.4 Phân tích phương sai ANOVA mô hình 83 Bảng Khả hòa tan phức β-CDQ10 nước 102 Bảng 3.6 Ảnh hưởng pH đến độ hòa tan phức β-CDQ10 103 Bảng 3.7 Kết kiểm nghiệm độ đồng khối lượng 107 Bảng 3.8 Kết đo độ rã 108 Bảng 3.9 Kết định lượng CoQ10 viên nang 109 Bảng 3.10 Kết phân tích viên nang thực phẩm chức CoQ10 110 Bảng 3.11 Bảng theo dõi trọng lượng chuột………………………………… .110 Footer Page of 148 Header Page 10 of 148 MỞ ĐẦU Ubiquinone-10 hay Coenzyme Q10 (CoQ10), coenzyme tham gia vào chuỗi vận chuyển điện tử bám màng prokaryote eukaryote, cấu tạo vòng benzoquinone chuỗi isoprenoid kị nước CoQ10 có vai trò quan trọng việc sản xuất ATP - nguồn lượng sinh học thể Do có tính chất chống oxy hóa mạnh, trung hòa gốc tự nên CoQ10 ngày sử dụng nhiều làm nguồn thực phẩm chức năng, giúp cải thiện sức khỏe đưa vào mỹ phẩm làm đẹp chất chống oxy hóa, chống lão hóa để giúp thể trẻ hóa; ứng dụng y tế nhằm ngăn ngừa ung thư, điều trị nhiều bệnh tim mạch, tiểu đường, Parkinson, tăng hệ thống miễn dịch, giảm huyết áp [5, 71, 72, 74] Với nhiều ứng dụng có lợi nên nhu cầu CoQ10 ngày tăng lên Để đáp ứng nhu cầu có nhiều giải pháp đưa tổng hợp hóa học, bán tổng hợp công nghệ sinh học Do CoQ10 có cấu trúc phức tạp nên CoQ10 sản xuất chủ yếu đường lên men nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Sporobolomyces salmonicolor, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans [34, 36, 43, 54, 67, 91, 102] Để nâng cao hiệu sản xuất CoQ10, từ năm 1993 nhiều nghiên cứu giới tập trung vào tối ưu hóa trình lên men chủng tự nhiên cải biến chủng Việc cải biến chủng thực cách gây đột biến ngẫu nhiên tạo chủng tái tổ hợp Mặc dù chủng đột biến có khả tổng hợp CoQ10 cao so với chủng gốc, nhiên hàm lượng CoQ10 từ chủng chưa mong đợi Hiện nhiều nghiên cứu tập trung vào việc tạo chủng E coli tái tổ hợp mang gen mã hóa số enzyme quan trọng đường sinh tổng hợp CoQ10 dxs dps, song khả tổng hợp CoQ10 thấp so với chủng đột biến Ngoài ra, chủng E coli tái tổ hợp không tổng hợp CoQ10 mà tổng hợp CoQ8 CoQ9 Đây điều bất lợi cho việc tách tinh thu CoQ10 đặc biệt sản xuất quy mô công nghiệp A tumefaciens vi khuẩn sử dụng để sản xuất CoQ10 chúng có nhiều ưu điểm có hàm lượng CoQ10 tương đối cao so với vi sinh vật khác, tổng hợp CoQ10, môi trường nuôi đơn giản, rẻ tiền, phù hợp sản xuất quy mô công nghiệp [16, 33, 34, 101] Chiến lược sử dụng vi khuẩn A tumefaciens làm chủng chủ để cải biến gen tạo chủng tái tổ hợp có khả tổng hợp CoQ10 tăng lên Footer Page 10 of 148 Header Page 128 of 148 52 Liu.X, Wu.H, Ye.J, Yuan.Q, Zhang.H (2006) Cloning and characterization of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Rhodobacter capsulatus B10 Can J Microbiol 52, pp 1141–1147 53 Mancini.A, De.M L, Oradei.A (1994) Coenzyme Q10 concentrations in normal and pathological human seminal fluid J Androl, 15(591-594) 54 Matsumura.M, Kobayashi.T, Aiba.S (1983) Anaerobic production of ubiquinone10 by Paracoccus dentrificans Eur J ApplMicrobiol Biotechnol 17, pp 85–89 55 Matthysse.A G (2006) The genus Agrobacterium Prokaryotes, 5(91-114) 56 McLennan.H, Degli.E M (2000) The contribution of mitochondrial respiratory complexes to the production of reactive oxygen species J Bioenerg Biomemb, 32, pp 153–162 57 Mcneil.B, Harvey.L M (2008) Practical Fermentation Technology, Strathclyde Fermentation Centre Strathclyde University, UK 58 Meganathan.R (2001) Ubiquinone biosynthesis in microorganisms FEMS Microbiol Lett 203, pp 131–139 59 Melzer.M, Heide.L (1994) Characterization of polyprenyldiphosphate: 4hydroxybenzoate polyprenyltransferase from Escherichia coli Biochim Biophys Acta 1212, pp 93–102 60 Michael.R S (2010) Coenzyme Q10 Biosynthesis in Plants A dissertation submitted to the Graduate Faculty of North Carolina State University in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy 61 Min.J H, Lee.J S, Yang,J D, Koo.S (2003) The Friedel-Crafts alkylation of a prenyl group stabilized by a sulfone moiety: Expeditious synthesis of ubiquinones and menaquinones J Org Chem, 68, pp 7925-7927 62 Miyake.Y, Shouzu.A, Nishikawa.M (1999) Effect of treatment with 3-hydroxy-3methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors on serum coenzyme Q10 in diabetic patients Arzneimittelforschung, 49(324-329) 63 Molyneux.S L (2006) Development of assays for Coenzyme Q10 and their application in clinical trials A thesis submitted in partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Chemistry in the University of Canterbury 64 Mu.F S, Luo.M, Fu.Y J, Zhang.X, Yu.P (2011) Synthesis of the Key Intermediate of Coenzyme Q10 Molecules 2011, 16, pp 4097-4103 119 Footer Page 128 of 148 Header Page 129 of 148 65 Munkholm.H, Hansen.H, Rasmussen.K (1999) Coenzyme Q10 treatment in serious heart failure Biofactors 9, pp 285–9 66 Narendra.K S, Puspha.A, Sujata.A S, Bhavana.B K (2012) Fermentation, media optimization studies for Coenzyme Q10 production by Saccharomyces cerevisiae International research journal of pharmacy ISSN pp 2230 – 8407 67 Nguyen Ba Kien, K.I S, Lee.M G, Kim.J K (2010) Coenzyme Q10production in a 150-l reactor by a mutant strain of Rhodobacter sphaeroides J Ind Microbiol Biotechnol 37, pp 521–529 68 Okada.K, Kainou T, Tanaka.K, Nakagawa.T, Matsuda.H, Kawamukai.M (1998b) Molecular cloning and mutational analysis of the ddsA gene encoding decaprenyl diphosphate synthase from Gluconobacter suboxydans Eur J Biochem 255, pp 52– 59 69 Okada.K, Suzuki.K, Kamiya.Y, Zhu.X, Fujisaki.S, Nishimura.Y, Nishino.T, Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H (1996) Polyprenyl diphosphate synthase essentially defines the length of the side chain of ubiquinone Biochim Biophys Acta 1302, pp 217–223 70 Onoue.S, Uchida.A, Kuriyama.K (2012) Novel solid self-emulsifying drug delivery system of coenzyme Q10 with improved photochemical and pharmacokinetic behaviors European Journal of Pharmaceutical Sciences, 46, pp 492-499 71 Overvad.K, Diamant.B, Holm.L, Holmer.G, Mortensen.S A, Stender.S (1999) Q10 in health and disease Europ J Clin Nutr, 53, pp 764–70 72 Papas.A M (1999) Other antioxidants” Antioxidant status, diet, nutrition, and health New York: CRC Press LLC, pp 231–48 73 Park.Y C, Kim.S J, Choi.J H, Lee.W H, Park.K M, Kawamukai.M, Ryu.Y W,, Seo.J H (2005) Batch and fed-batch production of coenzyme Q10 in recombinant Escherichia coli containing the decaprenyl diphosphate synthase gene from Gluconobacter suboxydans Appl Microbiol Biotechnol, 67, pp 192–196 74 Quinn.P J, Fabisiak J (1999) Expansion of antioxidant function of vitamin E by coenzyme Q Biofactors, 9(2–4), pp 149–54 75 Ranadive.P, Mehta A, George.S (2011) Strain improvement of Sporidiobolus johnsonii-ATCC International Journal of Chemical Engineering and Applications, 76 Ravada.S R, Emani.L R, Garaga.M R, Meka B, Golakoti T (2209) Synthesis of coenzyme Q10 Am J Infect Dis, 2, pp 83-89 120 Footer Page 129 of 148 Header Page 130 of 148 77 Redalieu.E, Nilsson.I M, Farley.T M., Folkers.K (1968) Determination and levels of Coenzyme Q10 in Human Blood Analytical biochemistry 23 23 pp 1132 - 1140 78 Rodriguez.A R, Brenne.E, Lacoste.F (2008) Determination of Coenzyme Q10 and Q9 in vegetable oils Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56, pp 62416245 79 Rohmer.M, Knani.M, Simonin.P, Sutter.B, Sahm.H (1993) Isoprenoid biosynthesis in bacteria: a novel pathway for the early steps leading to isopentenyl diphosphate Biochem J 295(Pt 2), pp 517–524 80 Rüegg.R, Gloor.U, Goel.R.N, Ryser.G, Wiss.O, Isler.O (1959) Synthesis of bichinon and ubichinon Helv Chim Acta, 42, pp 2616-2621 81 Sauchet.N, Laplante.S (2006) Seasonal variation of Co-enzyme Q10 content in pelagic fish tissues from Eastern Quebec Journal of Food Composition and Analysis 20, pp 403-410 82 Scaglione.F, Barbieri.B, Lundstrom.B, Lund.B (1999) Coenzyme Q10 administration increases antibody titer in hepatitis B vaccinated volunteers–A single blind placebo–controlled and randomized clinical study Biofactors, 9, pp 351–7 83 Seo.J M, Im.E M, Nam.J Y, Kim.S.O (2007) Increase of CoQ10 Production Level by the Coexpression of Decaprenyl Diphosphate Synthase and 1-Deoxy-Dxylulose 5-Phosphate Synthase Isolated from Rhizobium radiobacter ATCC 4718 in Recombinant Escherichia coli J Microbiol Biotechnol, 17(6), pp 1045–1048 84 Seo.M J, Kim.S O (2010) Effect of Limited Oxygen Supply on Coenzyme Q10 Production and Its Relation to Limited Electron Transfer and Oxidative Stress in Rhizobium radiobacter T6102 J Microbiol Biotechnol, 20(2), pp 346–349 85 Serge.L, Nathalie.S, Piotr.B, (2009) Comparison of low-temperature processes for oil and coenzyme Q10 extraction from mackerel and herring Eur J Lipid Sci Technol, 111, pp 135–141 86 Suzuki.K, Okada.K., Kamiya.Y, Zhu.X F, Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H (1997) Analysis of the decaprenyl diphosphate synthase (dps) gene in fission yeast suggests a role of ubiquinone as an antioxidant J Biochem 121, pp 496–505 87 Takahashi.S, Nishino.T, Koyama.T (2003) Isolation and expression of Paracoccus denitrificans decaprenyl diphosphate synthase gene for production of ubiquinone10 in Escherichia coli Biochem Eng J, 16, pp 183–190 121 Footer Page 130 of 148 Header Page 131 of 148 88 Terao.S, Kato.K, Shiraishi.M, Morimoto.H (1979) Synthesis of ubiquinones An efficient preparation of ubiquinone-10 J Org Chem, 44, pp 868-869 89 Tian.Y (2010a) Improvement of cultivation medium for enhanced production of coenzyme Q10 by photosynthetic Rhodospirillum rubrum Biochemical Engineering Journal, 51, pp 160–166 90 Tian.Y (2010b) Effects of Cell Lysis Treatments on the Yield of Coenzyme Q10 Following Agrobacterium tumefaciens Fermentation Food Sci Tech Int, 16(2), pp 0195–9 91 Urakami.T, Yoshida.T (1993) Production of ubiquinone and bacteriochlorophyll a by Rhodobacter sphaeroides and Rhodobacter sulfidophilus J Ferment Bioeng 76(3), pp 191-194 92 Valle.D, E.M M (2004) Cyclodextrins and their uses Process Biochemistry, 39, pp 1033-1046 93 Watts.G F, Playford.D.A, Croft.K D (2002) Coenzyme Q10 improves endothelial dysfunction of the brachial artery in Type II diabetes mellitus Diabetologia, 45(420-426) 94 Weber C (2001) “Dietary intake and absorption of coenzyme Q10”, Coenzyme Q: molecular mechanisms in health and disease New York: CRC Press LLC, pp 209–26 95 Weber.C, Bysted.A, Holmer.G (1997) The coenzyme Q10 content of the average Danish diet Int J Vit Nutr Res 67, pp 123–9 96 Xia.Q, Wang.H (2011) Study on stability of Coenzyme Q10-loaded nanostructured lipid carriers Integrated Ferroelectrics: An international Journal 129(1) pp 208214 97 Yalcin.A, Kilinc.E, Sagcan.A, Kultursay.H (2004) Coenzyme Q10 concentrations in coronary artery disease Clin Biochem 37, pp 706–9 98 Yang.H Y, Song.J F (2006) High-sensitive determination of coenzyme Q10 in iodinate β – cylodextrin medium by inclusion reaction and catalytic polarography Analytical Biochemistry, 348 99 Yoshida.H, Kotani Y (1998) Production of ubiquinone-10 using bacteria J Gen Appl Microbiol, 44, pp 19–26 100 Yoshizawa.T, Toyofuka.H, Tachibana.K.,Kuroda.T (1982) Regioselective polyprenyl rearrangement of polyprenyl 2,3,4,5-tetrasubstituted phenyl ethers promoted by boron trifluoride Chem Lett, 8, pp 1131-1134 122 Footer Page 131 of 148 Header Page 132 of 148 101 Yuan.Y, Tian.Y, Yue.T (2012) Improvement of Coenzyme Q10 Production: Mutagenesis Induced by High Hydrostatic Pressure Treatment and Optimization of Fermentation Conditions Journal of Biomedicine and Biotechnology, 102 Zahiria.H S (2006) Coenzyme Q10 production in recombinant Escherichia coli strains engineered with a heterologous decaprenyl diphosphate synthase gene and foreign mevalonate pathway Metabolic Engineering 8, pp 406–416 103 Zahiria.H S (2009) Effect of concomitant lycopene biosynthesis on CoQ10 accumulation in transformed Escherichia colistrains 104 Zhang.D, Shrestha.B, Li.Z, Tan.T (2007) Ubiquinone-10 production using Agrobacterium tumefaciens dps gene in Escherichia coli by coexpression system Mol Biotechnol, 35(1), pp 1-14 105 Zhang.Z, Inserra.P.F, Watson.R R (1997) “Antioxidants and AIDS” Antioxidants and disease prevention New York: CRC Press LLC, pp 31–43 106 Zhong.W, Fang.J, Liu.H, Wang.X (2009) Enhanced production of CoQ10 by newly isolated Sphingomonas sp ZUTEO3 with a coupled fermentation–extraction process J Ind Microbiol Biotechnol 36, pp 687–693 107 Zhu X., Yuasa.M, Okada.K, Suzuki.K., Nakagawa.T, Kawamukai.M, Matsuda.H (1995) Production of ubiquinone in Escherichia coli by expression of various genes responsible for ubiquinone biosynthesis J Ferment Bioeng 79, pp 493 – 495 123 Footer Page 132 of 148 Header Page 133 of 148 PHỤ LỤC Phụ lục Trình tự đặc điểm gen 16S A tumefaciens TT4 LOCUS OCT-2015 DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL in KR261089 1322 bp DNA linear BCT 10- Agrobacterium tumefaciens strain TT4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence KR261089 KR261089.1 GI:936294395 Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex (bases to 1322) Truong,P.Q., Nguyen,P.V and Dang,T.T Isolation and screening of the coq10 producing Agrobacterium tumefaciens strains from nodules of rose trees in vietnam Unpublished (bases to 1322) Truong,P.Q., Nguyen,P.V and Dang,T.T Direct Submission Submitted (23-APR-2015) Center for Research and Development Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1322 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." rRNA 1322 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN acgccccgca aggggagtgg cagacgggtg agtaacgcgt gggaacatac 61 ggaatagctc cgggaaactg gaattaatac cgcatacgcc ctacggggga 121 ggggaaggat tggcccgcgt tggattagct agttggtggg gtaaaggcct 181 cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca 241 tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 301 ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt aaagctcttt caccgatgaa 361 gtagtcggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 421 ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggatattt 124 Footer Page 133 of 148 cctttcctgc aagatttatc accaaggcga cggcccaaac tccagccatg gataatgacg acgaaggggg aagtcagggg Header Page 134 of 148 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 tgaaatcccg aggtaagtgg gcgaaggcgg ggattagata ctgttcggtg aaaactcaaa gcaacgcgca cttcagttag atgttgggtt ggcactctaa tcatggccct gacagcgatg gagtgcatga ccgggccttg gc cagctcaact aattccgagt cttactggtc ccctggtagt gcgcagctaa ggaattgacg gaaccttacc gctggcccca aagtcccgca ggggactgcc tacgggctgg tcgagctaat agttggaatc tacacaccgc gcggaactgc gtagaggtga cattactgac ccacgccgta cgcattaaac ggggcccgca agctcttgac gaacaggtgc acgagcgcaa ggtgataagc gctacacacg ctccaaaagc gctagtaatc ccgtcacacc ctttgatact aattcgtaga gctgaggtgc aacgatgaat attccgcctg caagcggtgg attcggggta tgcatggctg ccctcgccct cgagaggaag tgctacaatg catctcagtt gcagatcagc atgggagttg gggtatcttg tattcggagg gaaagcgtgg gttagccgtc gggagtacgg agcatgtggt tgggcattgg tcgtcagctc tagttgccag gtggggatga gtggtgacag cggattgcac atgctgcggt gttttacccg agtatggaag aacaccagtg ggagcaaaca gggcagtata tcgcaagatt ttaattcgaa agacgatgtc gtgtcgtgag catttagttg cgtcaagtcc tgggcagcga tctgcaactc gaatacgttc aaggtagtgc Phụ lục Trình tự đặc điểm gene dps LOCUS JUN-2014 DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM REFERENCE AUTHORS TITLE enhancing JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL in KJ619965 1077 bp DNA linear BCT 11- Agrobacterium tumefaciens strain TT4 decaprenyl diphosphate synthase (dps) gene, partial cds KJ619965 KJ619965.1 GI:647841698 Agrobacterium tumefaciens (Rhizobium radiobacter) Agrobacterium tumefaciens Bacteria; Proteobacteria; Alphaproteobacteria; Rhizobiales; Rhizobiaceae; Rhizobium/Agrobacterium group; Agrobacterium; Agrobacterium tumefaciens complex (bases to 1077) Truong,P.Q., Nguyen,P.V and Dang,T.T Reconstruction of Agrobacterium tumefaciens strain for coq10 producibility Unpublished (bases to 1077) Truong,P.Q., Nguyen,P.V and Dang,T.T Direct Submission Submitted (25-MAR-2014) Center for Research and Development Biotechnology, Hanoi University of Science and Technology, No1 Dai Co Viet, Hai Ba Trung, Hanoi 00000, Vietnam ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1077 /organism="Agrobacterium tumefaciens" /mol_type="genomic DNA" /strain="TT4" /isolation_source="rose nodule" /specimen_voucher="TT4" COMMENT 125 Footer Page 134 of 148 Header Page 135 of 148 /db_xref="taxon:358" /country="Viet Nam" /lat_lon="21.5 N 105.44 E" /collection_date="10-Feb-2012" /collected_by="Phong T.Q." gene