I H C QU CăGIAăHÀăN I TR NGă I H C KHOA H C T NHIểN ======= NGUY N TH NHUNG XỄCă NHă NG TH I M T S CT GỂYăLI TăC TRONG NHUY N TH HAI M NH V PH NGăPHỄPăS CăKụăL NG KH I PH B NG LC-MS/MS Chuyên ngƠnh: Hóa phơn tích Mƣ s : 60440118 LU NăV NăTH CăS ăKHOAăH C Ng iăh ng d n khoa h c: PGS.TS.ăLêăTh H ng H o HÀăN I - 2016 L I C Mă N B n khóa lu n nƠy đ c th c hi n vƠ hoƠn thƠnh t i Vi n Ki m nghi m An toƠn v sinh th c ph m Qu c Gia v i s h ng d n c a PGS.TS LêăTh ă H ngăH o V i lòng kính tr ng vƠ bi t n sơu s c, xin chơn thƠnh c m n PGS TSăLêăTh ăH ngăH o đƣ đ nh h ng nghiên c u, h ng d n vƠ góp ý giúp em hoƠn thƠnh khóa lu n nƠy Tôi xin g i l i c m n t i ThS.ăNguy năTh ă HƠăBình đƣ h ng d n vƠ giúp đ hoƠn thƠnh khóa lu n nƠy Tôi xin bƠy t lòng bi t n t i Ban lƣnh đ o Vi n Ki m nghi m An toƠn v sinh th c ph m Qu c gia, TS Tr năCaoăS n vƠ cán b khoa c h c d nguyên, Vi n Ki m nghi m an toƠn v sinh th c ph m Qu c gia đƣ t o u ki n giúp hoƠn thƠnh đ tƠi Tôi xin bƠy t lòng bi t n t i th y cô giáo gi ng d y t i khoa Hoá, đ c bi t lƠ th y cô b môn Hoá Phơn tích, đƣ cho nh ng ki n th c quý giá trình h c t p vƠ th c hi n đ tƠi nƠy Tôi c ng xin g i l i c m n anh ch , b n bè c a t p th l p cao h c hoá K24, đ c bi t lƠ nh ng ng i b n nhóm hoá phơn tích K24 đƣ giúp đ , chia s nh ng khó kh n su t trình h c t p vƠ th c hi n đ tƠi nƠy Cu i cùng, xin g i l i bi t n sơu s c t i gia đình, b n bè đƣ bên tôi, chia s khó kh n, đ ng viên vƠ giúp đ h c t p vƠ cu c s ng Do th i gian th c hi n đ tƠi có h n nên không tránh nh ng thi u sót Tôi r t mong nh n đ c ý ki n đóng góp c a th y cô vƠ b n sinh viên Hà N i, ngày 07 tháng 11 n m 2016 Nguy n Th Nhung Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên M CL C TV N CH NG I: T NG QUAN 1.1 Gi i thi u v đ c t nhuy n th gơy li t c 1.1.1 Gi i thi u v STX 1.1.2 Gi i thi u v NEO 1.1.3 Gi i thi u v GTX-1 1.1.4 Gi i h n t i đa cho phép (ML) .6 1.1.5 Nh ng tác h i c a đ c t nhuy n th gơy li t c 1.2 Các ph ng pháp xác đ nh đ c t gơy li t c nhuy n th hai m nh v 1.2.1 Các ph ng pháp th sinh h c .9 1.2.2 Ph ng pháp xét nghi m mi n d ch ELISA 10 1.2.3 Ph ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) 11 1.2.4 K thu t n di .13 1.2.5 Ph CH ng pháp s c ký l ng kh i ph (LC-MS), (LC-MS/MS) .13 NG 2: 2.1 it IT NG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 16 ng vƠ n i dung nghiên c u 16 2.1.1 it ng nghiên c u 16 2.1.2 N i dung nghiên c u 16 2.2 Ph ng pháp nghiên c u .16 2.2.1 Ph ng pháp chu n b m u 16 2.2.2 Ph ng pháps c ký l ng kh i ph (LC-MS/MS) 17 2.2.3 Th m đ nh ph Nguy n Th Nhung ng pháp 23 Tr ng HKH T Nhiên 2.2.4 Ph 2.3 Ph ng pháp x lý s li u 26 ng ti n nghiên c u 26 2.3.1 Thi t b , d ng c 26 2.3.2 Dung môi, hóa ch t 27 CH NG 3: K T QU VÀ TH O LU N Error! Bookmark not defined 3.1 T i u hóa u ki n ch y thi t b LC-MS/MS Error! Bookmark not defined 3.1.1 T i u hóa u ki n ch y c a thi t b kh i ph MS/MS Error! Bookmark not d 3.1.2 T i u hóa u ki n ch y s c ký l ng hi u n ng cao (HPLC) Error! Bookmark 3.2 Kh o sát quy trình x lý m u Error! Bookmark not defined 3.2.1 Ch n qui trình x lí m u Error! Bookmark not defined 3.2.2 Kh o sát nh h ng c a nhi t đ lên trình chi t m u Error! Bookmark not def 3.2.3 Kh o sát trình pha loƣng d ch chi t Error! Bookmark not defined 3.2.4 Kh o sát th tích dung môi chi t Error! Bookmark not defined 3.3 Th m đ nh ph ng pháp phơn tích Error! Bookmark not defined 3.3.1 Tính đ c hi u / ch n l c Error! Bookmark not defined 3.3.2 Gi i h n phát hi n (LOD), gi i h n đ nh l ng (LOQ) Error! Bookmark not define 3.3.3 Xác đ nh kho ng n tính Error! Bookmark not defined 3.3.4 xác (accuracy) c a ph ng pháp phơn tích (đ vƠ đ ch m) Error! Bookmark not defined 3.4 Áp d ng phơn tích m u th c t Error! Bookmark not defined K T LU N VÀ KI N NGH Error! Bookmark not defined TÀI LI U THAM KH O Error! Bookmark not defined PH L C Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên DANHăSACHăBANGăBIểU B ng 1.1: C uătrúcăhóaăh căvƠăđ cătínhăc a m tăvƠiăđ c t PSP B ng 1.2: M t s n PSP căđƣăđ aăraăquiăđ nh gi i h n t iăđaăchoăphépă(ML)ăc a B ng 1.3: M t s nghiênăc u s d ng ph ngăphápăHPLC-FLDăđ xácăđ nh PSP 11 B ng 2.1: B ng pha dung d ch chu nălamăviêc Error! Bookmark not defined B ng 3.1: Ion m c a t ng ch t Error! Bookmark not defined B ngă3.2:ă i u ki n t i u cho ESI-MS/MS Error! Bookmark not defined B ngă3.3:ăCácăthôngăs t i u MS/MS Error! Bookmark not defined B ng 3.4: Ch ngătrìnhăgradient Error! Bookmark not defined B ng 3.5: L a ch năquyătrìnhăchi t m u B ng 3.6: Kh oă sátă nh h Error! Bookmark not defined ng c a nhi tă đ lênă quáă trìnhă chi t m u Error! Bookmark not defined B ng 3.7: Kh oăsátăquáătrìnhăphaăloƣngăd ch chi t Error! Bookmark not defined B ng 3.8: Kh oăsátăth tíchădungămôiăchi t Error! Bookmark not defined B ng 3.9: Ion m vƠăionăconăc a STX, GTX-1, NEO Error! Bookmark not Bookmark not defined B ng 3.10:ăLODăvƠăLOQăc a STX, GTX-1, NEO Error! defined Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên B ng 3.11: S ph thu c c a di nă tíchă pică vƠoă n ngă đ c aă cácă PSP Error! Bookmark not defined B ng 3.12: l p l iă vƠă đ thu h i c a STX, GTX-1,ă NEOă trênă n n m u Ngao Error! Bookmark not defined B ngă 3.13:ă l p l iă vƠă đ thu h i c a STX, GTX-1,ă NEOă trênă n n m u HƠu Error! Bookmark not defined B ng 3.14: K t qu phơnătíchăm u th c t trênăđ aăbƠnăHƠăN i Error! Bookmark not defined Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên DANHăSACHăHINH Hìnhă1.1:ăCôngăth c c u t o t ngăquátăc aăcácăđ c t PSP Hìnhă1.2:ăCôngăth c c u t o c a STX Hìnhă1.3:ăCôngăth c c u t o c a Neo Hìnhă1.4:ăCôngăth c c u t o c a GTX-1 Hìnhă2.1:ăS đ đ n gi n c a h th ng s căkýăl ng 18 Hìnhă2.2:ăB k t n iăphunăđi n t Hìnhă2.3:ăB phơnătíchăt c c 20 22 Hìnhă2.4:ăB phơnătíchăkh i ba t c c 22 Hìnhă3.1:ăS căkíăđ mix PSP chu n 100 ng/mL ch y ch ngătrìnhăgradientă4 Error! Bookmark not defined Hìnhă3.2:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u 1Ti năhƠnhăx lýăm uătheoăquyătrìnhă2 theoătácăgi Van De Riet Error! Bookmark not defined Hìnhă3.3:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u Error! Bookmark not defined Hìnhă3.4:ăS đ quyătrìnhăx lýăm u Error! Bookmark not defined Hìnhă3.5:S căkíăđ cácăPSPă100 ng/mL trongăquyătrìnhă3 Error! Bookmark not defined Hìnhă3.6:ăS căkíăđ quyătrìnhăkhôngăgiaănhi tăkhiăthêmăchu n mix PSP 100 ng/mL Error! Bookmark not defined Hìnhă3.7:ăS căkíăđ quyătrìnhăgiaănhi tăkhiăthêmăchu n mix PSP 100 ng/mL Error! Bookmark not defined Hìnhă3.8:ă th kh oăsátăs Nguy n Th Nhung nh h ng c aăquáătrìnhăphaăloƣngăđ n hi u su t Tr ng HKH T Nhiên thu h i Hìnhă3.9:ă h i Error! Bookmark not defined th kh oăsátăs nh h ng c a th tíchăchi tăđ n hi u su t thu Error! Bookmark not defined Hìnhă3.10:ăQuyătrìnhăx líăm u t i u Error! Bookmark not defined Hìnhă3.11:ăPh kh i c aăcácăPSP Error! Bookmark not defined Hìnhă3.12: S căđ m u tr ngăkhôngăcoătốnăhiêuăchơtăphơnătốch Error! Bookmark not defined Hìnhă3.13: S căđ m u chu n m c 200 ng/mL Error! Bookmark not defined Hìnhă3.14: S căđ m u tr ngăthêmăchu n m c 200 ng/mL Error! Bookmark not defined Hìnhă3.15:ăS căkíăđ STX t i LOD 10 ng/mL (t ngăđ ngă100ăµg/kgătrênă ngăđ ngă150ăµg/kgătrênă ngăđ ngă150ăµg/kgătrênă m u) Error! Bookmark not defined Hìnhă3.16:ăS căkíăđ NEO t i LOD 15 ng/mL (t m u) Error! Bookmark not defined Hìnhă3.17:ăS căkíăđ GTX-1 t i LOD 15 ng/mL (t m u) Error! Bookmark not defined Hìnhă3.18:ă ngăchuơnăSTXătheoădiênătốchăpic Error! Bookmark not ngăchuơnăGTX-1 theoădiênătốchăpic Error! Bookmark not defined Hìnhă3.19:ă defined Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên Hìnhă3.20:ă ng chu năNEOătheoădiênătốchăpic Error! Bookmark defined Nguy n Th Nhung Tr ng HKH T Nhiên not DANH M CăCỄCăCH Kýăhi u CAN AOAC VI T T T Ti ng Anh Acetonitrile Association of Official Analytical Communities Ti ng Vi t Acetonitril Hi p h i nhƠ phơn tích c t nhuy n th gơy m t trí ASP Amnesic Shellfish Poisoning CAD Collision Gas Pressure Áp su t khí va ch m CE Collision Energy N ng l CUR Curtain Gas Khí mƠng CXP Collision Cell Exit Potential Th đ u DP Declustering Potential Th phơn m nh DSP Diarrhetic Shellfish Poisoning d-SPE Dispersive solid phase extraction nh ng va ch m c t nhuy n th gơy tiêu ch y Chi t phơn tán pha r n Eq Equivalents T ESI Electronspray ionization Ion hóa phun n t FLD Fluoroscence detector Detector hu nh quang GCB Graphitized carbon black Than ho t tính GS1 Ion Source Gas Khí ngu n ion GS2 Ion Source Gas Khí ngu n ion GTX-1 Gonyautoxins-1 HPLC High performance liquid chromatography Nguy n Th Nhung ng đ ng c t gonyautoxins-1 S c ký l ng hi u n ng cao Tr ng HKH T Nhiên Hình 2.1: S đ đ n gi n c a h th ng s c ký l ng Trong HPLC, pha t nh lƠ ch t nh i c t lƠm nhi m v tách h n h p ch t phơn tích ó lƠ nh ng ch t r n, x p vƠ kích th Tu theo b n ch t c a pha t nh, ph th ng chia lƠm lo i: s c ký pha th c h t r t nh , t ậ 7mm ng pháp s c ký l ng pha liên k t ng (NP-HPLC) vƠ s c ký pha ng c (RP- HPLC) [2], [4]  S c ký pha th silica tr n ho c silica đ ng: pha t nh có b m t lƠ ch t phơn c c (đó lƠcác c g n nhóm ankyl có cacbon mang nhóm ch c phơn c c: -NH2, -CN ), pha đ ng lƠ dung môi h u c không phơn c c nh : n-hexan, toluene H nƠy có th tách đa d ng ch t không phơn c c hay phơn c c  S c ký pha ng c: pha t nh th ng lƠ silica đƣ đ c ankyl hoá, không phơn c c, lo i thông d ng nh t lƠ ậC18H37, pha đ ng phơn c c: n methanol, axetonitril Trong r t nhi u tr đ ng l i lƠ n c, ng h p thƠnh ph n c a pha c nên r t kinh t H nƠy đ c s d ng đ tách ch t có đ phơn c c r t đa d ng: t r t phơn c c, phơn c c t i không phơn c c Pha đ ng HPLC đóng góp m t ph n r t quan tr ng vi c tách ch t phơn tích trình s c ký nh t đ nh M i lo i s c ký đ u có pha đ ng r a gi i riêng cho đ có đ Nguy n Th Nhung c hi u qu tách t t 18 Tr ng HKH T Nhiên Detector lƠ b ph n quan tr ng quy t đ nh đ nh y c a ph ng pháp Tu thu c b n ch t lí hoá c a ch t phơn tích mƠ l a ch n detector cho phù h p M t s lo i Detector dùng HPLC nh : Detector quang ph h p th phơn t UVVIS, Detector hu nh quang RF, Detector đ d n Kh i ph (MS) c ng đóng vai trò nh m t detector đ c bi t c a HPLC 2.2.2.2 Máy kh i ph (Mass Spectrometry) Kh i ph lƠ thi t b phơn tích d a c s xác đ nh kh i l ng phơn t c a h p ch t hóa h c b ng vi c phơn tách ion phơn t theo t s gi a kh i l ng vƠ n tích (m/z) c a chúng Các ion có th t o b ng cách thêm hay b t n tích c a chúng nh lo i b electron, proton hóa, Các ion t o thƠnh nƠy đ c tách theo t s m/z vƠ phát hi n, t có th cho thông tin v kh i l ng ho c c u trúc phơn t c a h p ch t [4] C u t o c a m t thi t b kh i ph bao g m ph n chính: ngu n ion, thi t b phơn tích vƠ b ph n phát hi n  Ngu năion Ch t phơn tích sau kh i c t tách s đ chuy n thƠnh d ng h i vƠ đ th ng đ c d n t i ngu n ion đ c ion hóa nguyên t M t s k thu t ion hóa c s d ng s c ký l ng kh i ph nh : ion hóa phun n t (electrospray ionization ậ ESI), ion hóa hóa h c áp su t khí quy n (atmospheric pressure chemical ionization ậ APCI) a) Ion hóa phun n t (ESI) K thu t ion hóa phun n t bao g m ba trình c b n sau: + T o thƠnh gi t mang n tích + LƠm gi m kích th c c a h t, vƠ phơn nh h t + Quá trình hình thƠnh pha h i ion Nguy n Th Nhung 19 Tr ng HKH T Nhiên Hình 2.2: B k t n i phun n t Có ch đ b n phá: b n phá v i ch đ ion d  Lo i hình thƠnh ion d ng vƠ ion ơm ng o Phù h p nh t cho phơn tích lo i thu c có tính bazo o Th ng hình thƠnh nên ion [M+H]+ o C ng có th hình thƠnh ion [M+nH]n+ , [M+Na+]+  Lo i hình thƠnh ion ơm o Thích h p nh t cho s phơn tích lo i thu c có tính axit o [M-H]- , [M-nH]nơy lƠ k thu t ion hóa m m, có đ nh y cao K thu t nƠy ng d ng phơn tích ch t không phơn c c nh : protein, peptit, cacbonhydrat, nucleotit, polyetilen glycocol, vƠ ch t phơn c c có kh i l b) Ion hoá hoá h c ng phơn t nh áp su t khí quy n (Atmospheric Pressure Chemical Ionization: APCI) H n h p khí nƠy đ n m t vùng có áp su t khí quy n, vƠ x y s ion hoá hoá h c va ch m v i dòng ion d ng (H2, CH4, H2O ) ho c ơm đ bi n phơn t trung hòa thƠnh ion phơn t hay m nh ion qua s b n phá b i dòng electron mang n ng l ng M i phơn t khí có th t o ion d ng khác lƠm tác nhơn cho ion hóa hóa h c Ch t phơn tích vƠ dung môi r i hóa h i d ng l ng đ c chuy n thƠnh gi t nh nhi t đ cao kho ng 500C M t n th cao t ậ 5kV t o Nguy n Th Nhung 20 Tr ng HKH T Nhiên electrron vƠ ion hóa ch t phơn tích ơy c ng lƠ m t k thu t ion hóa m m APCI đ ch t có kh i l đ : ion ơm vƠ ion d c s d ng đ phơn tích ng phơn t trung bình K thu t nƠy có th b n phá ch ng  B ăph năphơnătíchăkh iă LƠ trái tim c a máy kh i ph , có nhi m v phơn tách ion có tr s m/z khác thƠnh t ng ph n ri ng bi t, có nhi u b phơn tích kh i khác nh : B phơn tích t c c, phơn tích t c c ch p ba, phơn tích b y ion, phơn tích th i gian bay Hi n nay, có hai lo i phơn tích kh i th  ng đ c s d ng nh t, lƠ: B phơn tích t c c b y ion (Quadrupole Ion-Trap Mass Analyser) B y t c c ho t đ ng theo nguyên lý b phơn tích kh i t c c, ch có m t m khác lƠ ion đ c l u gi vƠ đ a d n kh i b y B ng cách thay đ i th xoay chi u áp vƠo c c ion có t s m/z khác có th v t qua kho ng không đ đ n Detector  B phơn tích t c c ch p ba (triple Quadrupole Analyser) G m ba t c c ghép n i v i Máy t c c g m c c ghép song song n i v i t ng đôi m t đ i di n nhau, t o thƠnh hai c p, sau chúng n i v i n áp m t chi u t o thƠnh c p d hai c p n c c đ ng vƠ ơm NgoƠi n áp m t chi u, c n i v i n áp xoay chi u T h p n áp nƠy đ c bi t lƠ n áp xoay chi u s thay đ i theo chu k đ quét kh i l Nguy n Th Nhung 21 Tr ng ion ng HKH T Nhiên Hình 2.3: B phơn tích t c c M t s ion có t s m/z xác đ nh c ng h ng v i th xoay chi u xác đ nh có th th ng qua kho ng không đ n detector Trong ion khác không s có qu đ o không n đ nh va ch m v i c c vƠ b gi l i đ thu đ Tuy nhiên c t t c ion ta quét n áp theo chu k t zero đ n m t n áp nh t đ nh t ng d n sau l i tr l i zero, l n l c c c ng có kh i l t ion s v t qua đ ct ng t nh đ n l n đ đ n detector Máy t c c ch p ba: Q0 Q1 Q2 Q3 Hình 2.4: B phơn tích kh i ba t c c Trong đó: Q0: Ngu n ion m Q1: B t c c th nh t, có nhi m v tách ion L a ch n ion m v i m/z nh t đ nh t ngu n ion chuy n đ n đ chuy n đ n Q2 Q2: B t c c th hai, u ki n áp su t cao, ion m b phơn li va ch m v i khí tr có m t nh khí N2, Ar, He B Q2 t o phơn ly ion m Nguy n Th Nhung 22 Tr ng HKH T Nhiên b phơn m nh ti p theo t o ion nh h n, ion (daughter ions) Q2 không đóng vai trò lƠ b l c ion mƠ ch p nh n t t c ion Q1 chuy n đ n Sau t t c ion đ c chuy n qua b tách Q3 Q3: B t c c th ba lƠm nhi m v tách ion đ c chuy n t Q2 đ t i b ph n phát hi n  B ăph năphátăhi n Sau kh i thi t b phơn tích kh i l ng, ion đ c đ a t i ph n cu i c a thi t b kh i ph lƠ b ph n phát hi n ion Có hai lo i b ph n phát hi n ph bi n: b ph n phát hi n nhơn electron (electron multipler) vƠ b ph n phát hi n nhơn quang (photo multipler) B ph n phát hi n nhơn electron lƠ m t nh ng detector ph bi n nh t, có đ nh y cao M t ion đ p vƠo b m t dinod lƠm b t electron Các electron th c p sau đ c d n t i dinod ti p theo vƠ s t o electron th c p nhi u h n n a, t o thƠnh dòng electron (1-106) B ph n phát hi n nhơn quang c ng gi ng nh thi t b nhơn electron, ion ban đ u đ p vƠo m t dinot t o dòng electron Các photon nƠy đ c phát hi n b i m t b nhơn quang ho t đ ng nh thi t b nhơn electron S l ng photon t l v i c ng đ tín hi u 2.2.3 Th măđ nhăph ngăpháp 2.2.3.1 Tính đ c hi u/ ch n l c - Khái ni m [5], [6] Tính đ c hi u: lƠ kh n ng phát hi n ch t phơn tích có m t t p ch t khác nh : ti n ch t, ch t chuy n hóa, t p ch t Tính ch n l c: lƠ khái ni m r ng h n tính đ c hi u, liên quan đ n vi c phơn tích m t s ho c nhi u ch t trình - Xác đ nh: Ph Nguy n Th Nhung ng pháp s c kí l ng kh i ph 23 Tr ng HKH T Nhiên S d ng ph ng pháp xác nh n (confirmation method) lƠ m t cách r t t t đ đ m b o tính đ c hi u c a ph ng pháp H i đ ng chơu Âu quy đ nh cách tính m IP (đi m nh n d ng ậ indenfication point) đ i v i ph ng pháp khác đ kh ng đ nh ch c ch n s có m t c a m t ch t 2.2.3.2 Gi i h n phát hi n (LOD), Gi i h n đ nh l - ng (LOQ) Khái ni m [5], [6] Gi i h n phát hi n (LOD): lƠ n ng đ ho c kh i l đ ng nh nh t có th c phát hi n v i m c tin c y xác đ nh Gi i h n đ nh l ng (LOQ): lƠ n ng đ t i thi u c a m t ch t có m u th mƠ ta có th đ nh l ng b ng ph ng pháp kh o sát vƠ cho k t qu có đ xác mong mu n - Xác đ nh: D a t l tín hi u nhi u (S/N) Phơn tích m u n ng đ th p có th xu t hi n tín hi u c a ch t phơn tích Xác đ nh t l tín hi u chia cho nhi u (S/N) Trong đó: S: Chi u cao tín hi u c a ch t phơn tích N: Nhi u đ LOD đ đ c ch p nh n t i n ng đ mƠ t i tín hi u l n g p 2-3 l n nhi u ng n n, thông th LOQ đ nhi u đ ng l y S/N=3 c ch p nh n t i n ng đ mƠ t i tín hi u l n g p 10-20 l n ng n n, thông th 2.2.3.3 Xây d ng đ - - ng l y S/N=10 ng chu n Khái ni m [5] ng chu n: lƠ đ đo đ ng n n ng bi u di n s ph thu c n tính gi a đ i l ng c vƠ n ng đ ch t phơn tích Xác đ nh: Nguy n Th Nhung 24 Tr ng HKH T Nhiên o dung d ch chu n có n ng đ thay đ i vƠ kh o sát s ph thu c c a tín hi u vƠ n ng đ V đ ng th ng n tính bi u di n s ph thu c gi a tín hi u vƠ n ng đ ch t phơn tích 2.2.3.4 l p l i đ thu h i l p l i (đ ch m): lƠ m c đ g n c a giá tr riêng l c a phép đo l p l i vƠ đ c bi u di n b ng đ l ch chu n S hay đ l ch chu n t ng đ i RSD (%) [6] % = 100 )2 =1( = Trong đó: - xi : N ng đ tính đ - c c a l n th nghi m th i : N ng đ trung bình tính đ c c a N l n th nghi m - N: S l n th nghi m c a ph ng pháp: lƠ khái ni m ch m c đ g n gi a giá tr trung bình c a k t qu th nghi m vƠ giá tr th c ho c giá tr đ c ch p nh n lƠ thu h i (đánh giá đ đúng): lƠ t l ph n tr m gi a giá tr thu đ c so v i giá tr lý thuy t % = 100 % Trong đó: - R: đ thu h i (%) - C: N ng đ ch t phơn tích m u tr ng thêm chu n (ng/mL) Nguy n Th Nhung 25 Tr ng HKH T Nhiên - Cc: N ng đ chu n thêm (lý thuy t) (ng/mL) 2.2.4.ăPh ngăphápăx lýăs li u Các k t qu đ c tính toán t đ ng theo ph n m m phơn tích c a thi t b (ph n m m Analyst 1.5.1, ABSciex) X lý k t qu b ng ph n m m Minitab 14 2.3.ăPh ngăti nănghiênăc u 2.3.1 Thi t b , d ng c 2.3.1.1 Thi t b  H th ng s c ký l ng kh i ph kh i ph LC/MS/MS c a Shimadzu bao g m: + Thi t b s c ký l ng c a Shimadzu Mode 20 AD-UFLC u dò kh i ph : Triplequard 5500 c a AB Sciex (M ) +  C t s c ký: Acclaim 120- c t C18 m (150mm × 2.1mm × m)  Máy l c vortex  Máy đ ng nh t m u  Máy li tơm MIKRO 22R  Cơn phơn tích (có đ xác 0,1mg vƠ 0,01mg)  Cơn k thu t (có đ xác 0,01g)  Máy c t quay chơn không Eyela 2.3.1.2 D ng c  Pipet: 1, 2, 5, 10, 20 mL  Bình đ nh m c: 5, 10, 50, 100 mL  ng li tơm 50 mL  Bình cô quay 50 mL, 100 mL  Vial lo i 1,8 mL  ng đong, ph u, gi y l c Nguy n Th Nhung 26 Tr ng HKH T Nhiên Micropipet lo i 200 µL, 1000 µL, 5000 µL thay đ i th tích đ  vƠ đ u côn t c ng ng 2.3.2.ăDungămôi,ăhóaăch t Các lo i hoá ch t s d ng đ u thu c lo i tinh t phơn tích - Methanol, acetonitril (Merck) - Acid formic, acid acetic, natri hydroxyd, acid trichloracetic (TCA) (Merck) - N - Ch t h p ph C18, GCB đ - T t c dung d ch (tr tr c c t l n tinh t s c ký) đ u đ c cung c p b i công ty Agilent, M ng h p s d ng nguyên tr ng dung môi lo i c l c qua mƠng l c 0,45 µm tr c đ a vƠo h th ng s c kí * Chu n b dung d ch chu n - Chu n STX, NEO, GTX-1 lƠ v t li u chu n đ c ch ng nh n c a NCR, Canada - Các chu n PSP đ c s d ng c a Canada lƠ chu n v t li u ch ng nhơn - Chuơn STX dang Saxitoxin Dih ydrochloride nông đô 66,3 µmol/L, khôi l - ng phơn t 372,2g/mol, t ng v i ham l Chuơn Neo nông đô 65,6 µmol/L, khôi l đ - ng đ ng v i ham l ng phơn t ng đ 315,1g/mol, t ng ng 20,5 µg/mL Chuơn GTX -1 nông đô 60,4 µmol/L, khôi l t ng 24,7 µg/mL ng v i ham l ng phơn t 411,4g/mol, ng 24,8 µg/mL Dung d ch chu n trung gian 1000 ng/mL: Lơy chốnh xac môt thê tốch cac chuơn STX, NEO, GTX-1lơn l t la 40,5; 48,8; 40,3 µL va thêm 870 µL TÀIă LI UăTHAMăKH O Nguy n Th Nhung 27 Tr ng HKH T Nhiên TI NG VI T Ơo Vi t HƠ ậ Vi n H i D ng H c Nha Trang (2000), Hàm l ng đ c t vi t o paralytic shellfish poisoning (PSP toxin) nghêu Meretrix lyrata t i m t s vùng nuôi tr ng m khu v c C n Gi Tr n T Hi u, T V ng Nghi, Nguy n V n Ri, Nguy n Xuơn Trung (2007), Hóa h c phân tích, ph n 2: Các ph ng pháp phân tích công c , NXB Khoa h c vƠ k thu t T V ng Nghi (2007), Hóa h c phân tích, ph n 1: C s lý thuy t ph ng pháp hóa h c phân tích, NXB Khoa h c vƠ k thu t Nguy n V n Ri (2009), Các ph ng pháp tách, BƠi gi ng i h c Khoa h c T Nhiên ậ HQGHN Tr n Cao S n, Ph m Xuơn (2010), Th m đ nh ph Ơ, Lê T H ng H o, Nguy n ThƠnh Trung ng pháp phân tích hóa h c & vi sinh v t, NXB Khoa h c vƠ k thu t HƠ N i T Th Th o (2006), Bài gi ng chuyên đ th ng kê hoá phân tích, BƠi gi ng Nguy n i h c Khoa h c T Nhiên ậ HQGHN ình Tri u, Nguy n ình ThƠnh (2001),Các ph ng pháp phân tích v t lý hóa lý, NXB Khoa h c vƠ k thu t TI NG ANH Cusick K D., Sayler G S (2013), "An overview on the marine neurotoxin, saxitoxin: Genetics, molecular targets, methods of detection and ecological functions", Marine Drugs, 11(4), pp 991-1018 Deeds J R., Landsberg J H., Etheridge S M., et al (2008), "Nontraditional vectors for paralytic shellfish poisoning", Marine Drugs, 6(2), pp 308-348 10 Dell’aversano C., Hess P., Quilliam M A (2005), "Hydrophilic interaction liquid chromatographyậmass spectrometry for the analysis of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins", Journal of chromatography A, 1081(2), pp 190-201 Nguy n Th Nhung 28 Tr ng HKH T Nhiên 11 Diener M., Erler K., Hiller S., et al (2006), "Determination of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in dietary supplements by application of a new HPLC/FD method", European Food Research and Technology, 224(2), pp 147-151 12 Etheridge S M (2010), "Paralytic shellfish poisoning: seafood safety and human health perspectives", Toxicon, 56(2), pp 108-122 13 European Commission, (2004), “Commission Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April 2004 laying down specific hygiene rules for food of animal origin”, Official Journal of the European Union, L226, 22 - 82 14 Faber S (2012), "Saxitoxin and the induction of paralytic shellfish poisoning", Journal of Young Investigators, 23(1), pp 1-7 15 FAO (2004), Marine biotoxins, pp 5-49, Rome 16 Gerssen A (2009), The analysis of lipophilic marine toxins, Wageningen University, pp.2-5 17 Gerssen A., Pol-Hofstad I E., Poelman M., et al (2010), "Marine toxins: Chemistry, toxicity, occurrence and detection, with special reference to the Dutch situation", Toxins, 2(4), pp 878-904 18 Harju K., Rapinoja M L., Avondet M.-A., et al (2015), "Optimization of Sample Preparation for the Identification and Quantification of Saxitoxin in Proficiency Test Mussel Sample using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry", Toxins, 7(12), pp 4868-4880 19 Lawrence J F., Niedzwiadek B (2001), "Quantitative determination of paralytic shellfish poisoning toxins in shellfish by using prechromatographic oxidation and liquid chromatography with fluorescence detection", Journal of AOAC International, 84(4), pp 1099-1108 20 Llewellyn L., Dodd M., Robertson A., et al (2002), "Post-mortem analysis of samples from a human victim of a fatal poisoning caused by the xanthid crab, Zosimus aeneus", Toxicon, 40(10), pp 1463-1469 Nguy n Th Nhung 29 Tr ng HKH T Nhiên 21 Mattarozzi M., Milioli M., Bianchi F., et al (2016), "Optimization of a rapid QuEChERS sample treatment method for HILIC-MS analysis of paralytic shellfish poisoning (PSP) toxins in mussels", Food Control, 60, pp 138-145 22 Mons M., Van Egmond H., Speijers G (1998), Paralytic shellfish poisoning: A Review RIVM Report No 388802 005 23 Oikawa H., Fujita T., Satomi M., et al (2002), "Accumulation of paralytic shellfish poisoning toxins in the edible shore crab Telmessus acutidens",Toxicon, 40(11), pp 1593-1599 24 Oshima Y (1995), "Post-column derivatization liquid chromatographic method for paralytic shellfish toxins", Journal of AOAC International, 78(2), pp 528-532 25 Usleber E., Schneider E., Terplan G (1991), "Direct enzyme immunoassay in microtitration plate and test strip format for the detection of saxitoxin in shellfish", Letters in applied microbiology, 13(6), pp 275-277 26 Van De Riet J M., Gibbs R S., Chou F W., et al (2009), "Liquid chromatographic post-column oxidation method for analysis of paralytic shellfish toxins in mussels, clams, scallops, and oysters: single-laboratory validation", Journal of AOAC International, 92(6), pp 1690-1704 27 Wiberg G., Stephenson N (1960), "Toxicologic studies on paralytic shellfish poison", Toxicology and applied pharmacology, 2(6), pp 607 615 28 Wiese M., D’agostino P M., Mihali T K., et al (2010), "Neurotoxic alkaloids: saxitoxin and its analogs", Marine Drugs, 8(7), pp 2185-2211 29 Windust A.J, J L C Wright, and J L McLachlan, “The effects of the diarrhetic shellfish poisoning toxins, okadaic acid and dinophysistoxin-1, on the growth of microalgae,” Mar Biol., vol 126, no 1, pp 19ậ25, 1996 30 Yu H., Lim K S., Song K C., et al (2013), "Comparison of MBA and HPLC Post column Oxidation Methods for the Quantification of Paralytic Nguy n Th Nhung 30 Tr ng HKH T Nhiên Shellfish Poisoning Toxins", Fisheries and aquatic sciences, 16(3), pp 159164 31 Zhuo L., Yin Y., Fu W., et al (2013), "Determination of paralytic shellfish poisoning toxins by HILICậMS/MS coupled with dispersive solid phase extraction", Nguy n Th Nhung Food chemistry, 31 137(1), Tr pp 115-121 ng HKH T Nhiên 32 ... s đ c t gây li t c nhuy n th hai m nh v b ng s c ký l ng kh i ph LC -MS/ MS Ph ng pháp hi n đ i, có đ tin c y vƠ xác cao M c tiêu c a th c hi n đ tƠi lu n v n lƠ: - Xơy d ng ph ng pháp xác đ nh... 1.2.5ăPh ngăphápăs c ký l ng kh i ph (LC -MS) , (LC -MS/ MS) G n đơy ph ng pháp s c kí l ng t ng tác a n c k t h p v i detector l n kh i ph cho đ nh y, đ đ c hi u cao phơn tích PSP (HILICMS /MS) Liyang Zuo... o qu n 2.2.2ăPh t l nh sơu -20oC th i gian th c nghi m ngăpháps c ký l ng kh i ph (LC -MS/ MS) C u trúc c a h th ng LC -MS/ MS S c ký l ng R t quan tr ng Ionăhóa ESI B phơnă Detector/ tíchăkh i L