Nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn staphylococcus aureus phân lập được từ bò sữa

63 912 2
  • Loading ...
    Loading ...
    Loading ...

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

Tài liệu liên quan

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 17/02/2017, 10:35

MỤC LỤC Lời cam đoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mụch chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình chăn nuôi bò sữa giới Việt Nam 1.2 Một số hiểu biết vi khuẩn Staphylococcus aureus 1.2.1 Hình thái 1.2.2 Tính chất nuôi cấy 1.2.3 Các yếu tố độc lực 1.3 Hiểu biết bệnh viêm vú bò sữa 15 1.4 Hiểu biết màng sinh học vi khuẩn 16 1.4.1 Định nghĩa màng sinh học (biofilm) 16 1.4.2 Sự hình thành màng sinh học 16 1.4.3 Vai trò màng sinh học chế gây bệnh vi khuẩn 18 1.4.4 Các phương pháp xác định hình thành màng sinh học 19 1.4.5 Tác hại màng sinh học 24 1.4.6 Một số biện pháp kiểm soát hình thành màng sinh học 24 1.4.7 Ứng dụng có lợi màng sinh học 24 Chương NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1 Đối tượng nghiên cứu 26 2.2 Địa điểm nghiên cứu 26 2.3 Nội dung nghiên cứu 26 2.4 Nguyên liệu, thiết bị 26 2.4.1 Mẫu sữa 26 2.4.2 Môi trường dùng phân lập, khiết, tăng sinh vi khuẩn 26 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.4.3 Hóa chất thực phản ứng catalase 27 2.4.4 Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số 27 2.4.5 Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng PCR 27 2.4.6 Môi trường, hóa chất nghiên cứu khả sản sinh biofilm 28 2.4.7 Nguyên liệu tiêu hao 29 2.4.8 Thiết bị phục vụ nghiên cứu 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 29 2.5.1 Phương pháp lấy mẫu sữa 29 2.5.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu sữa 30 2.5.3 Phương pháp khiết S aureus từ mẫu sữa 30 2.5.4 Phương pháp tách tinh ADN tổng số 31 2.5.5 Phương pháp PCR giám định loài 32 2.5.6 Phương pháp xác định khả sinh trưởng vi khuẩn 32 2.5.7 Phương pháp xác định khả hình thành biofilm 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1 Kết thu thập mẫu sữa bò Phù Đổng Cầu Diễn 36 3.2 Kết phân lập vi khuẩn Staphylococcus spp từ mẫu sữa 36 3.2 Kết giám định vi khuẩn phân lập 39 3.3 Kết xác định khả sinh trưởng vi khuẩn S.aureus 46 3.4 Kết nghiên cứu khả sản sinh biofilm Staphylococcus spp 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55 KẾT LUẬN 55 ĐỀ NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤCH CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay HA : Hemagglutinin HPAI : Highly Pathogenic Avian Influenza IP : ImmunoPeroxidase LL : Lymphoid Leukosis NA : Neurominidas OIE : World Organisation for Animal Health PCR : Polymerase Chain Reaction RT – PCR : Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction TBP : Tryptose phosphate broth Y: : Yeast extract Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 1.1: Lượng sữa sản xuất giới (triệu tấn) 2.1 Trình tự mồi dùng giám định loài Staphylococcus spp Streptococcus spp 28 2.2 Chu trình nhiệt PCR dùng giám định loài Staphylococcus spp Sterptococcus spp 32 3.1 Tình hình thu thập mẫu sữa bò Phù Đổng Cầu Diễn 36 3.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn từ mẫu sữa Phù Đổng Cầu Diễn 37 3.3 Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu sữa bò bị viêm/không viêm vú 38 3.4 Kết giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn E coli 40 3.5 Kết giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn Streptoccocus spp Staphylococcus spp 40 3.6 Kết xác định vi khuẩn Staphylococcus spp Streptococcus spp phản ứng PCR 43 3.7 Kết phân lập vi khuẩn Staphylococccus spp từ sữa bò bị viêm vú không viêm vú 45 3.8 Kết xác định khả sản sinh biofilm Staphylococcus spp 52 3.9 Kết xác định mức độ sản sinh biofilm Staphylococcus spp 52 3.10 Kết xác định mức độ sản sinh biofilm Staphylococcus aureus 53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Quá trình hình thành màng sinh học (biofilm) 16 1.2 Quá trình giải phóng vi khuẩn khỏi màng sinh học 17 1.3 Vai trò màng sinh học chế sinh bệnh vi khuẩn 18 1.4 Sự sản sinh màng sinh học Staphylococcus epidemidis xác định phương pháp ống nghiệm 20 1.5 Sự sản sinh màng sinh học coagulase negative Staphylococci xác định thạch bổ sung đỏ Congo 21 1.6 Mức độ hình thành biofilm thạch bổ sung đỏ Congo dựa theo màu khuẩn lạc 22 1.7 Dụng cụ cải tiến dùng nghiên cứu biofilm 23 1.8 Phương pháp slide- band xác định hình thành biofilm 23 2.1 Tóm tắt bước phân lập, khiết S aureus 30 2.2 Sơ đồ xác định khả sinh trưởng vi khuẩn 33 2.3 Các bước nghiên cứu khả hình thành biofilm Staphylococcus 35 3.1 Phân lập vi khuẩn Streptococcus spp Staphylococcus spp từ mẫu sữa 41 3.2 Thuần khiết chủng vi khuẩn Streptococcus spp Staphylococcus spp phân lập từ mẫu sữa 42 3.3 Kết PCR giám định Staphylococcus aureus 46 3.4: Khả sinh trưởng S aureus môi trường TPB TPB+Y 47 3.5: So sánh khả sinh trưởng S aureus môi trường TPB TPB+Y 48 3.6 Biểu đồ đường cong sinh trưởng S.aureus 49 3.7 Kết kiểm tra khả tạo màng sinh học Staphylococcus 50 3.8 Màng sinh học nhuộm tím kết tinh 1% (200X) 51 3.9 Mức độ tạo màng sinh học chủng Staphylococcus spp 53 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii MỞ ĐẦU Theo chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020, đàn bò sữa nước ta tăng bình quân 11% năm, đạt khoảng 500 ngàn (Quyết định 10/2008/QĐTTg), tỷ lệ sữa tươi sản xuất nước đáp ứng nhu cầu tiêu dùng tăng lên 35% năm 2015 40% năm 2020 (Đỗ Kim Tuyên, 2007) Bên cạnh thuận lợi cho phát triển, ngành chăn nuôi bò sữa nước ta đối mặt với nhiều thách thức, có vấn đề dịch bệnh Một bệnh thường gặp, gây nhiều thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi bò sữa bệnh viêm vú Ngay nước có trình độ chăn nuôi phát triển Canada, Mỹ, Hà Lan, v.v bệnh viêm vú bò sữa thách thức lớn, gây thiệt hại kinh tế hàng năm khoảng 300 triệu USD (Boldyreva E.M., 2014) Về nguyên nhân vi khuẩn gây bệnh viêm vú, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli Klebsiella xác định loại mầm bệnh thường gặp (Bradley A.J., 2002, Olde Riekerink cs., 2008) Đáng ý, vi khuẩn kể có khả hình thành màng sinh học (biofilm) (Hassan A et al, 2011) nên giúp vi khuẩn bám dính, tồn lâu dài bề mặt biểu mô, đề kháng tốt với tượng thực bào tác động kháng sinh (Costerton, J.W cs., 1999) Ở Việt Nam, nghiên cứu bệnh viêm vú bò sữa xác định loại vi khuẩn gây bệnh Streptococcus spp., Staphylococcus spp Escherichia coli (Phạm Bảo Ngọc, 2003, Trương Quang cs., 2008) Tuy nhiên, chưa có công bố đặt vấn đề nghiên cứu khả hình thành biofilm chúng Trong nghiên cứu lựa chọn vi khuẩn Staphylococcus aureus vi khuẩn thường gặp sữa bò làm đối tượng để thực đề tài "Nghiên cứu khả hình thành màng sinh học (biofilm) vi khuẩn Staphylococcus aureus phân lập từ bò sữa" nhằm làm sáng tỏ khả sản sinh biofilm chủng vi khuẩn phân lập Ý nghĩa khoa học đề tài: (1) Ở Việt Nam, đề tài đặt vấn đề nghiên cứu khả sản sinh biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page (2) Kết nghiên cứu khả sản sinh biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò cung cấp sở khoa học cho hướng nghiên cứu (i) vai trò vi khuẩn sản sinh biofilm bệnh viêm vú bò sữa Việt Nam, (ii) khả đề kháng kháng sinh vi khuẩn sản sinh biofilm số loại kháng sinh thường dùng điều trị bệnh viêm vú bò sữa nước ta Ý nghĩa thực tiễn đề tài: - Kết nghiên cứu đề tài giúp người chăn nuôi bò sữa nhận thấy tính chất nguy hiểm vi khuẩn có khả sản sinh biofilm, từ nâng cao ý thức người chăn nuôi công tác vệ sinh phòng bệnh - Từ kết nghiên cứu đề tài giúp cho cán thú y sở quan thấy tính chất nguy hiểm vi khuẩn bệnh viêm vú bò sữa, từ đưa biện pháp phòng bệnh xử lý bệnh hiệu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình chăn nuôi bò sữa giới Việt Nam Phương thức chăn nuôi bò sữa thay đổi tuỳ theo điều kiện tập quán nước Các nước châu Âu Bắc Mỹ có ngành chăn nuôi bò sữa theo hướng chuyên dụng Phần lớn ngành chăn nuôi bò sữa nước phát triển thuộc hộ chăn nuôi quy mô nhỏ Số trang trại nuôi bò sữa nước phát triển có xu hướng giảm xuống, số hộ chăn nuôi bò sữa nước phát triển có xu hướng ổn định Hệ thống chủ yếu bãi chăn-chuồng nuôi với việc sử dụng rộng rãi đồng cỏ lâu năm, mùa hè chủ yếu dựa vào chăn thả đồng cỏ, mùa đông dùng nhiều thức ăn bổ sung chuồng (cỏ ủ xanh, cỏ khô, thức ăn tinh) Tổng sản lượng sữa tiêu thụ toàn giới không ngừng tăng lên thập kỷ gần Các nước phát triển châu Âu, Bắc Mỹ châu Đại Dương sản xuất tới 68% sản lượng sữa giới với suất sữa bình quân cao nhiều so với nước phát triển Các nước phát triển có tống lượng sữa tiêu thụ lượng sữa tiêu thụ bình quân ổn định Trong tổng lượng sữa tiêu thụ mức tiêu thụ sữa/người nước phát triển không ngừng tăng lên Sản lượng sữa sản xuất toàn giới tăng bình quân hàng năm 1,4%, riêng nước phát triển châu Á 6,6% Một số nước Trung quốc, Thái Lan, Hàn Quốc có tốc độ tăng sản lượng sữa hàng năm tới 10% năm gần Tuy nhiên nước châu Á chưa sản xuất đủ sữa cho nhu cầu tiêu thụ nước Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Bảng 1.1: Lượng sữa sản xuất giới (triệu tấn) Năm 1965 1975 1985 1995 2000 2003 Châu Phi 11,5 14,1 18,5 22,2 27,2 28,7 Châu Á 45,0 58,1 89,1 128,5 159,2 172,4 Châu Âu 136,5 156,7 181,7 159,9 161,9 160,7 Bắc Mỹ 69,2 69,4 83,2 90,0 97,4 99,3 Nam Mỹ 16,8 22,6 27,4 40,4 44,9 46,5 Châu Đại dương 13,0 12,9 14,2 17,8 23,5 25,1 Toàn Thế giới 364,6 424,6 512,7 536,9 579,1 600,9 Trung Mỹ Nguồn: FAO Statistics (2004) Tại Việt Nam Việt Nam vốn ngành chăn nuôi trâu bò sữa truyền thống nên giống trâu bò sữa chuyên dụng đặc thù Chăn nuôi bò sữa xuất Việt Nam từ năm đầu kỷ XX, thời kỳ Pháp thuộc Trong năm 1920-1923 người Pháp đưa giống bò chịu nóng bò Red Sindhi (thường gọi bò Sin) bò Ongole (thường gọi bò Bô) vào Tân Sơn Nhất, Sài Gòn Hà Nội để nuôi thử lấy sữa phục vụ người Pháp Việt Nam Tuy nhiên số lượng bò sữa thời (khoảng 300 con) xuất sữa thấp (2-3 kg/con/ngày) Từ đến bò Red Sindhi lai tạo với bò địa phương hình thành nên loại bò Lai Sin kiêm dụng nuôi rộng rãi nước Nhìn chung, ngành chăn nuôi bò sữa phát triển mạnh từ đầu năm 1990 đến 2004 Tuy nhiên, tổng sản lượng sữa tươi sản xuất nước đáp ứng khoảng 20-25% lượng sữa tiêu dùng, lại phải nhập từ nước Sau số năm phát triển nóng, từ năm 2005 phát triển ngành chăn nuôi bò sữa chững lại bộc lộ số nhược điểm Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Những nhược điểm ngành chăn nuôi bò sữa nước ta từ năm 2005 đến chủ yếu hai lý Thứ quy mô chăn nuôi bò sữa nước ta quy mô nông hộ, mà vệ sinh chuồng trại, vệ sinh phòng bệnh cho vật nuôi không đảm bảo dẫn tới bò dễ bị bệnh, mà suất chất lượng sữa không cao Nguyên nhân thứ hai dẫn tới chăn nuôi bò sữa khó khăn giá thành thức ăn chăn nuôi, thức ăn dinh dưỡng bổ sung ngày tăng cao( từ năm 2005 đến tăng khoảng 5,5 đến 6,3%), thêm vào diện ích đồng cỏ xanh để lấy thức ăn cho bò không đáp ứng đủ nhu cầu chăn nuôi Từ dẫn tới hiệu chăn nuôi thấp, mặt khách giá thành thu mua sữa từ công ty sữa lại thấp mà người chăn nuôi không tha thiết với chăn nuôi bò sữa không mang lại lợi ích kinh tế cao Đây lý khiến cho chăn nuôi bò sữa nước ta phát triển chậm suốt thời gian dài 1.2 Một số hiểu biết vi khuẩn Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Robert Koch phát năm 1878 sau thực phân lập từ mủ ung nhọt Năm 1880 Louis Paster thực tiến hành phân lập nghiên cứu Staphylococcus aureus 1.2.1 Hình thái Staphylococcus aureus (còn gọi tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, gram (+), đường kính 0,8 – 1µm đứng thành hình chùm nho, hình thức tập hợp vi khuẩn phân bào theo nhiều chiều không gian Trong bệnh phẩm vi khuẩn thường thường họp lại đôi hay tạo thành đám nhỏ Vi khuẩn không di động, lông, không sinh nha bào 1.2.2 Tính chất nuôi cấy Staphylococcus aureus phát triển dễ dàng môi trường thông thường, vi khuẩn kỵ khí tùy nghi Phát triển nhiệt độ 10 - 450C, mọc tốt 370C tạo sắc tố tốt 200C Ở môi trường canh thang sau - làm đục môi trường, sau 24 làm đục rõ, để lâu lắng cặn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page Với 16 chủng Streptococcus spp phân lập tỷ lệ phát Streptococcus uberis cao (56,25%), Streptococcus dysgalactiae (37,50%), có chủng (6,25%) không xác định loài Chúng không phát Streptococcus agalactiae số chủng Streptococcus phân lập Theo nghiên cứu Phạm Bảo Ngọc cs (2009) sử dụng phản ứng CAMP test giám định 88 chủng vi khuẩn Streptococcus spp tỷ lệ phát Streptococcus agalactiae cao 36/88 (40,9%) Streptococcus dysgalactiae (7/88 chủng, 7,95%), Streptococcus uberis thấp (6/88 chủng, 6,81%), có 34 chủng (38,63%) không xác định loài Với 79 chủng Staphylococcus spp phân lập giám định phan rứng sinh hóa phản ứng Coagulase có 37 chủng (46,83%) Staphylococcus aureus, tỷ lệ phát Staphylococcus epidermidis 29,11% (23/79 chủng), có 14 chủng (17,72%) không xác định loài Nghiên cứu Somayyeh Hosseinzadeh Habib Dastmalchi Saei (2014) lại cho biết số 113 chủng Staphylococcus phân lập sử dụng phản ứng PCR phản ứng Coagulase có (4,4%) Staphylococcus aureus 108 (95,6%) xác định gồm loài sau: 44 chủng Staphylococcus haemolyticus (40,7%), 17 chủng Staphylococcus chromogenes (15,7%), 11 chủng Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus warneri Staphylococcus cohnii (10,2%), chủng Staphylococcus simulans (5,5%), chủng Staphylococcus hominis (3,7%), chủng Staphylococcus capitis (2,7%) chủng Staphylococcus xylosus (0,9%) S haemolyticus, S chromogenes S warneri phát từ mẫu sữa bò bị viêm vú có biểu lâm sàng rõ Nếu so sánh với kết kết nghiên cứu có sai khác Kết điều kiện dịch tễ vùng khác nhau, nguồn mẫu lấy khác phương pháp sử dụng để xác định loài khác Tuy nhiên kết xác định tỷ lệ nhiễm Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis gần giống với nghiên cứu Phạm Bảo Ngọc cs Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 (2009), cho thấy vai trò vi khuẩn Staphylococcus aureus gây bệnh viêm vú bò sữa Kết làm rõ so sánh tỷ lệ mẫu sữa bò viêm vú không viêm vú phân lập vi khuẩn Staphylococcus spp (bảng 3.7) Bảng 3.7 Kết phân lập vi khuẩn Staphylococccus spp từ sữa bò bị viêm vú không viêm vú Kết xác định loài vi khuẩn Nguồn gốc Số sữa bò chủng Staphylococcus Staphylococcus aureus epidermidis Số (+) Viêm vú Không viêm vú Tổng hợp Tỷ lệ (%) Số (+) Tỷ lệ (%) Sta spp khác Số (+) Tỷ lệ (%) 11 72,73 18,18 9,09 16 56,25 25,00 18,75 27 17 62,96 22,22 14,81 Như số chủng Staphylococcus phân lập từ sữa bị viêm vú tỷ lệ loài Staphylococcus aureus cao (72,73%), lần khẳng định thêm vai trò vi khuẩn gây viêm vú bò sữa phạm vi nghiên cứu đề tài Hình ảnh phản ứng PCR xác định loài vi khuẩn Staphylococcus spp minh họa hình 3.3 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 Hình 3.3 Kết PCR giám định Staphylococcus aureus Kết trình bày hình 3.3 cho thấy, giếng đối chứng dương, cho vạch đặc hiệu rõ nét, với kích thước 849 bp tương đương với thiết kế Ở giếng đối chứng âm phản ứng PCR, không quan sát vạch không đặc hiệu Đối với phản ứng PCR định danh Staphylococcus epidermidis, rút nhận xét tương tự (kết không trình bày) Kết chứng tỏ với điều kiện nồng độ mồi, nhiệt độ bắt mồi thời gian kéo dài phản ứng PCR phù hợp Trong mẫu giám định trình bày hình 3.3 (giếng đến giếng 8), quan sát mẫu cho vạch đặc hiệu, có kích thước tương đương đối chứng dương Tuy nhiên, có mẫu cho vạch sáng rõ giống đối chứng dương Như vậy, ứng dụng thành công phản ứng PCR giám định loài tụ cầu khuẩn 3.3 Kết xác định khả sinh trưởng vi khuẩn S.aureus Do khả sinh trưởng phát triển vi khuẩn môi trường lỏng có ảnh hưởng tới kết nghiên cứu khả hình thành biofilm, vậy, Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 46 nghiên cứu này, tìm hiểu ảnh hưởng môi trường TPB môi trường TPB+Y tới sinh trưởng S aureus Mặt khác, để phù hợp với điều kiện thí nghiệm nghiên cứu hình thành biofilm vi khuẩn, tiến hành đánh giá khả sinh trưởng vi khuẩn đĩa 96 giếng vô trùng, với tổng thể tích dung dịch giếng 200 µl Sau nuôi cấy 24 giờ, nhận thấy giếng đối chứng âm (TPB, TPB+Y), môi trường giếng Ngược lại, giếng nuôi vi khuẩn thấy tượng môi trường đục Như vậy, cảm quan, nhận thấy có phát triển vi khuẩn môi trường TPB TPB+Y Tiến hành đo giá trị OD 27 mẫu, sau xử lý số liệu, thu kết trình bày hình 3.4 Hình 3.4: Khả sinh trưởng S aureus môi trường TPB TPB+Y Hình 3.4 trình bày kết so sánh khả sinh trưởng vi khuẩn môi trường bổ sung chiết xuất cao nấm men 0,5% với môi trường không bổ sung Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 47 Kết cho thấy, môi trường TPB+Y cho giá trị OD cao rõ rệt so với môi trường có TPB Kết phân tích phương sai nhân tố cho giá trị F thực nghiệm = 78,27 >> so với giá trị F lý thuyết = 4,03 (p = 5,99x 10-12) Đối với chủng tụ cầu khuẩn, so sánh khả tăng trưởng môi trường TPB TPB+Y, kết trình bày hình 3.5 Hình 3.5: So sánh khả sinh trưởng S aureus môi trường TPB TPB+Y Kết trình bày hình 3.5 cho thấy, bổ sung chiết xuất cao nấm men làm tăng giá trị OD dao động khoảng 2,03 – 6,35 lần Tổng hợp kết trình bày hình 3.4 hình 3.5 thấy toàn 27 chủng tụ cầu khuẩn phát triển tốt môi trường TPB+Y, mức độ tăng chủng khác Kết theo phản ánh khả sinh trưởng chủng vi khuẩn khác Như vậy, kết trình bày cho thấy môi trường TBP+Y môi trường thuận lợi cho vi khuẩn S aureus sinh trưởng phát triển Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 48 Để đánh giá cụ thể khả sinh trưởng chủng tụ cầu khuẩn môi trường TPB+Y, tiến hành nuôi cấy vi khuẩn đĩa 96 giếng, rút mẫu thời điểm sau nuôi cấy giờ, giờ, giờ, 12 24 Tiến hành đo mật độ quang (OD 630 nm) chủng vi khuẩn thời điểm Kết xây dựng đường cong sinh trưởng chủng S aureus trình bày hình 3.6 Hình 3.6 Biểu đồ đường cong sinh trưởng S.aureus Kết hình 3.6 cho thấy chủng S aureus phân lập có tăng lên mật độ tế bào theo thời gian nuôi cấy môi trường TPB+Y Tuy nhiên, nhận thấy rằng, mức độ tăng mật độ vi khuẩn không giống Sự khác biệt quan sát thấy rõ thời điểm 24 (phản Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 49 ánh mức biến động khoảng 0,4 đến 0,7, hình 3.6B) Ở điều kiện thí nghiệm này, so sánh mức độ sinh trưởng 27 chủng S aureus (hình 3.6C) cho thấy tăng lượng vi khuẩn (∆t2/t1) thời điểm 24 dao động từ – 20,9 lần Kết lần phản ánh mức độ tăng trưởng khác chủng tụ cầu khuẩn 3.4 Kết nghiên cứu khả sản sinh biofilm Staphylococcus spp Kết nghiên cứu hình thành biofilm 27 chủng Staphylococcus spp trình bày phần Hình ảnh đĩa phản ứng xác định khả hình thành biofilm chủng Staphylococcus spp minh họa hình 3.7 3.8 Hình 3.7 Kết kiểm tra khả tạo màng sinh học Staphylococcus spp Vi khuẩn hình thành biofilm mức mạnh (M), yếu (Y) trung bình (TB) không hình thành biofilm (-) dựa cường độ màu thuốc nhuộm giữ lại giếng Kết hình 3.7 cho thấy giếng đối chứng âm tượng giữ màu thuốc nhuộm Ngược lại, giếng nuôi vi khuẩn, quan sát tượng giữ màu thuốc nhuộm mức độ khác Trong hình minh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 50 họa này, mẫu S5.2, S6.2, S9.1 S9.2 có màu giống đối chứng âm đánh giá âm tính (không hình thành biofilm) Các mẫu S4, S4.1, S5.1 S6.1 S8.2 có tượng giữ màu thuốc nhuộm đánh giá dương tính (hình thành biofilm) Hình ảnh màng sinh học giếng phản ứng trình bày hình 3.8 Hình 3.8 Màng sinh học nhuộm tím kết tinh 1% (200X) Sự hình thành biofilm đánh giá mức mạnh (A), trung bình (B) yếu (C) so với đối chứng (D) không hình thành biofilm Hình 3.8 cho thấy giếng đối chứng âm (hình 3.8D) phát triển vi khuẩn tượng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh Ở giếng nuôi cấy vi khuẩn quan sát hình thành mảng biofilm mức độ mạnh (hình 3.8A), trung bình (hình 3.8B) yếu (hình 3.8C), có tượng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh lớp biofilm Để làm rõ mức độ hình thành màng sinh học 27 chủng Staphylococcus spp khiết, đo mật độ quang thuốc nhuộm giữ lại giếng, so sánh với giá trị ODc, 2ODc, 4ODc đối chứng âm để xác định mẫu hình thành/ không hình thành biofilm mức độ sản sinh biofilm Kết trình bày bảng 3.8 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 51 Bảng 3.8 Kết xác định khả sản sinh biofilm Staphylococcus spp Nguồn gốc sữa bò Viêm vú Không viêm vú Tổng hợp Số chủng kiểm tra Số chủng Số chủng hình thành Tỷ lệ (%) biofilm không hình thành Tỷ lệ (%) biofilm 11 63,64 36,36 16 43,75 65,25 27 14 51,85 13 48,15 Kết trình bày bảng 3.8 cho thấy có 14/27 (58,85%) chủng Staphylococcus spp đánh giá có khả sản sinh biofilm Trong số chủng sản sinh biofilm tỷ lệ chủng phân lập hình thành biofilm mức mạnh, trung bình yếu 14,29%, 14,29% 71,42% (bảng 3.9) Bảng 3.9 Kết xác định mức độ sản sinh biofilm Staphylococcus spp Sản sinh biofilm Nguồn gốc Số chủng hình sữa bò thành biofilm Mạnh Trung bình Yếu Viêm vú (28,57) (14,29) (57,14) Không viêm vú (14,29) (85,71) Tổng hợp 14 (14,29) (14,29) 10 (71,42) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 52 Kết kiểm tra khả mức độ hình thành biofilm vi khuẩn S aureus trình bày bảng 3.10 Bảng 3.10 Kết xác định mức độ sản sinh biofilm Staphylococcus aureus Nguồn Số chủng Số chủng hình gốc sữa kiểm tra thành biofilm Mạnh Trung bình Yếu Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) Tỷ lệ (%) 2 (62,50) (40,00) (20,50) (40,00) (25,00) (75,00) bò Viêm vú Không (44,44) viêm vú 17 Tổng hợp Sản sinh biofilm 2 (52,94) (22,22) (22,22) (55,56) Biểu diễn phân bố giá trị OD 27 chủng vi khuẩn mối tương quan với mức tạo màng sinh học 2ODc 4ODc trình bày hình 3.9 Hình 3.9 Mức độ tạo màng sinh học chủng Staphylococcus spp Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 53 Kết hình 3.9 cho thấy chủng Staphylococcus spp phân lập nghiên cứu hình thành biofilm mức độ: mạnh, trung bình yếu Trong chủng S aureus có khả sản sinh biofilm mức độ mạnh trung bình Với kết trình bày, nghiên cứu cho thấy có mặt với tỷ lệ cao vi khuẩn Staphylococcus mẫu sữa bò chủng vi khuẩn có khả hình thành màng sinh học điều kiện in vitro Nhiều nghiên cứu giới vai trò biofilm bệnh viêm vú bò sữa (Melchior, M.B cs., 2006, Oliveira, M cs., 2006, Babra, C cs., 2013), đề nghị cần nghiên cứu làm sáng tỏ vai trò vi khuẩn sản sinh biofilm bệnh viêm vú bò sữa Việt Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu nêu trên, rút số kết luận sau: - Trong tổng số 49 mẫu sữa tiến hành nghiên cứu có 32,65% mẫu bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus spp; 55,10% mẫu nhiễm vi khuẩn Staphylococcus spp 26,53% mẫu nhiễm vi khuẩn E.coli; đặc biệt tổng số 13 mẫu sữa lấy từ bò bị viêm vú kiểm tra tỷ lệ mẫu nhiễm Staphylococcus spp cao 84,61% - Các chủng vi khuẩn phân lập mang đặc tính sinh học tài liệu kinh điển mô tả Sử dụng phản ứng PCR xác định số 27 chủng vi khuẩn Staphylococcus spp phân lập tỷ lệ phân lập vi khuẩn Staphylococcus aureus cao (62,96%), tỷ lệ phân lập Staphylococcus epidermidis 22,22%, có chủng thuộc loài Staphylococcus khác chiếm tỷ lệ 14,81% - Bổ sung chiết xuất cao nấm men làm tăng giá trị OD dao động khoảng 2,03 – 6,35 lần Mặc dù toàn 27 chủng tụ cầu khuẩn phát triển tốt môi trường TPB+Y, mức độ tăng chủng khác - Có 14/27 (58,85%) chủng Staphylococcus spp có khả sản sinh biofilm mức mạnh, trung bình yếu 14,29%, 14,29% 71,42%; S aureus phát khả sản sinh mức độ mạnh trung bình ĐỀ NGHỊ Tiếp tục có nghiên cứu sâu rộng màng sinh học (biofilm) tạo màng sinh học vi khuẩn nói chung vi khuẩn Staphylococcus aureus nói riêng Đề biện pháp hữu hiệu nhằm hạn chế ảnh hưởng màng sinh học việc dùng thuốc kháng sinh để giảm thiểu tối đa nguy kháng thuốc ngày tăng cao vi khuẩn gây bệnh điều trị bệnh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Quang Huy, Ngô Thị Kim Toán, 2014 Khả tích lũy photpho tạo biofilm chủng Bacillus licheniformis A4.2 phân lập Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 30, 43-50 Đỗ Thị Tố Uyên, 2014 Nghiên cứu tạo màng sinh học (biofilm) từ vi sinh vật dùng xử lý ô nhiễm dầu mỏ KC.04.21/11-15 Almshawit, H., I Macreadie and D Grando, 2014: A simple and inexpensive device for biofilm analysis Journal of Microbiological Methods, 98, 59-63 Arciola, C R., D Campoccia, S Gamberini, M Cervellati, E Donati and L Montanaro, 2002: Detection of slime production by means of an optimised Congo red agar plate test based on a colourimetric scale in Staphylococcus epidermidis clinical isolates genotyped for ica locus Biomaterials, 23, 42334239 Atalla, H., C Gyles, C L Jacob, H Moisan, F Malouin and B Mallard, 2008: Characterization of a Staphylococcus aureus small colony variant (SCV) associated with persistent bovine mastitis Foodborne Pathog Dis, 5, 785-799 Atalla, H., C Gyles and B Mallard, 2011: Staphylococcus aureus small colony variants (SCVs) and their role in disease Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases, 12, 33-45 Auger, S., N Ramarao, C Faille, A Fouet, S Aymerich and M Gohar, 2009: Biofilm formation and cell surface properties among pathogenic and nonpathogenic strains of the Bacillus cereus group Appl Environ Microbiol, 75, 6616-6618 Biswas, K., M W Taylor and S J Turner, 2014: Successional development of biofilms in moving bed biofilm reactor (MBBR) systems treating municipal wastewater Appl Microbiol Biotechnol, 98, 1429-1440 Christensen, G D., W A Simpson, A L Bisno and E H Beachey, 1982: Adherence of slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces Infection and Immunity, 37, 318-326 10 Clutterbuck, A L., E J Woods, D C Knottenbelt, P D Clegg, C A Cochrane and S L Percival, 2007: Biofilms and their relevance to veterinary medicine Vet Microbiol, 121, 1-17 11 Costerton, J W., P S Stewart and E P Greenberg, 1999: Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections Science, 284, 1318-1322 12 Darwish, S F and H A Asfour, 2013: Investigation of biofilm forming ability in Staphylococci causing bovine mastitis using phenotypic and genotypic assays TheScientificWorldJournal, 2013, 378492 13 Djordjevic, D., M Wiedmann and L A McLandsborough, 2002: Microtiter plate assay for assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation Appl Environ Microbiol, 68, 2950-2958 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 56 14 Đỗ, T T U., 2014: Nghiên cứu tạo màng sinh học (biofilm) từ vi sinh vật dùng xử lý ô nhiễm dầu mỏ KC.04.21/11-15 15 Donlan, R M., 2002: Biofilms: microbial life on surfaces Emerging infectious diseases, 8, 881-890 16 Freeman, D J., F R Falkiner and C T Keane, 1989: New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci J Clin Pathol, 42, 872874 17 Hassan, A., J Usman, F Kaleem, M Omair, A Khalid and M Iqbal, 2011: Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates The Brazilian journal of infectious diseases : an official publication of the Brazilian Society of Infectious Diseases, 15, 305-311 18 Lee, K., J W Costerton, J Ravel, R K Auerbach, D M Wagner, P Keim and J G Leid, 2007: Phenotypic and functional characterization of Bacillus anthracis biofilms Microbiology, 153, 1693-1701 19 Nguyễn, Q H and T K T Ngô, 2014: Khả tích lũy photpho tạo biofilm chủng Bacillus licheniformis A4.2 phân lập Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 30, 43-50 20 Paytubi, S., P Guirado, C Balsalobre and C Madrid, 2014: An improved and versatile methodology to quantify biofilms formed on solid surfaces and exposed to the air-liquid interphase J Microbiol Methods, 103, 77-79 21 Quinn P.J., M.E Carter, B Markey, G.R Carter (2004) Clinical Veterinary Microbiology, pp 118-136 22 Scher, K., U Romling and S Yaron, 2005: Effect of heat, acidification, and chlorination on Salmonella enterica serovar typhimurium cells in a biofilm formed at the air-liquid interface Appl Environ Microbiol, 71, 1163-1168 23 Simões, M., L C Simões and M J Vieira, 2010: A review of current and emergent biofilm control strategies LWT - Food Science and Technology, 43, 573-583 24 Somayyeh Hosseinzadeh, Habib Dastmalchi Sae (2014) Staphylococcal species associated with bovine mastitis in the North West of Iran: Emerging of coagulase-negative staphylococci International Journal of Veterinary Science and Medicine Volume 2, Issue 1, Pages 27–34 25 Thornton, R B., P J Rigby, S P Wiertsema, P Filion, J Langlands, H L Coates, S Vijayasekaran, A D Keil and P C Richmond, 2011: Multi-species bacterial biofilm and intracellular infection in otitis media BMC Pediatr, 11, 94 26 Yang, L., Y Liu, H Wu, N Hoiby, S Molin and Z.-j Song, 2011: Current understanding of multi-species biofilms Int J Oral Sci, 3, 74-81 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 57 PHỤ LỤC Kết đánh giá khả sinh trưởng chủng S aureus môi trường TPB+Y trình bày bảng sau: 2h 0.012 0.050 0.034 0.112 0.048 0.084 0.030 0.162 0.040 0.066 0.038 0.030 0.064 0.110 0.082 0.056 0.102 0.070 0.060 0.032 0.100 0.034 0.174 0.106 0.124 0.036 0.076 4h 0.064 0.080 0.104 0.138 0.098 0.152 0.162 0.276 0.082 0.170 0.142 0.038 0.066 0.122 0.090 0.060 0.172 0.084 0.074 0.048 0.150 0.102 0.280 0.112 0.166 0.178 0.176 6h 0.126 0.110 0.150 0.144 0.162 0.192 0.206 0.364 0.194 0.200 0.198 0.220 0.072 0.194 0.202 0.090 0.226 0.272 0.140 0.084 0.238 0.180 0.344 0.130 0.206 0.274 0.188 12h 0.180 0.166 0.274 0.228 0.238 0.270 0.234 0.460 0.288 0.226 0.316 0.234 0.246 0.290 0.248 0.232 0.318 0.370 0.164 0.340 0.360 0.274 0.420 0.276 0.386 0.304 0.266 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 24h 0.208 0.538 0.602 0.452 0.490 0.566 0.430 0.704 0.664 0.594 0.682 0.536 0.308 0.748 0.774 0.746 0.480 0.556 0.338 0.382 0.590 0.422 0.710 0.504 0.534 0.514 0.612 Page 58 ... khả sản sinh biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò, Học vi n Nông nghiệp Vi t Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page (2) Kết nghiên cứu khả sản sinh biofilm vi khuẩn phân lập từ sữa bò. .. nghiên cứu khả hình thành biofilm chúng Trong nghiên cứu lựa chọn vi khuẩn Staphylococcus aureus vi khuẩn thường gặp sữa bò làm đối tượng để thực đề tài "Nghiên cứu khả hình thành màng sinh học. .. phá vỡ màng sinh học 1.4.7 Ứng dụng có lợi màng sinh học Ngoài tác hại màng sinh học, người ứng dụng vi sinh vật có khả hình thành màng sinh học xử lý nước thải Ở Vi t Học vi n Nông nghiệp Vi t
- Xem thêm -

Xem thêm: Nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn staphylococcus aureus phân lập được từ bò sữa , Nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn staphylococcus aureus phân lập được từ bò sữa , Nghiên cứu khả năng hình thành màng sinh học (biofilm) của vi khuẩn staphylococcus aureus phân lập được từ bò sữa

Từ khóa liên quan