Đang tải... (xem toàn văn)
Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm đang là vấn đề rất được quan tâm. Mỗi năm, ước tính ở Hoa Kỳ xảy ra 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca trên 100 nghìn dân), 2 triệu ca xảy ra ở Anh (3.400 ca100 nghìn dân) và 75 nghìn ca ở Pháp(1.220 ca100 nghìn dân). Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy ra, đặc biệt là ngộ độc tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống tại các bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm). Theo một thống kê năm 2008, mỗi năm ở Việt Namcó khoảng 250 500 ca ngộ độc thực phẩm với 7.000 10.000 nạn nhân và 100 200 ca tử vong. Nhà nước Việt Nam cũng phải chi trên 3 tỷ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và điều tra tìm nguyên nhân. Tiền thuốc men và viện phí cho mỗi nạn nhân ngộ độc do vi sinh vật tốn chừng 300.000 – 500.000 đồng, các ngộ độc do hóa chất (thuốc trừ sâu, phẩm màu…) từ 3 – 5 triệu đồng, nhưng các chi phí do bệnh viện phải chịu thì còn lớn hơn nhiều. Một số vụ việc được nhắc đến gồm: Trong tháng 8 năm 2012 đã xảy ra 4 vụ ngộ độc thực phẩm làm 179 người bị ngộ độc, trong đó 2 trường hợp tử vong. Trưa 27112012, 74 nữ công nhân của Công ty TNHH Giày Uy Việt (KCN Đông Xuyên, TP Vũng Tàu) có dấu hiệu bị ngộ độc thức ăn sau khi ăn suất cơm chay. Ở quận 12, TP HCM, 148 công nhân Công ty Terratex, cùng có triệu chứng đau bụng, buồn nôn và chóng mặt. Theo các công nhân, thức ăn tập thể mà họ dùng do chính nhà bếp của công ty nấu. Đây là lần thứ hai công ty này xảy ra ngộ độc tập thể. Trong 2 ngày 6 và 732013, gần 30 người ăn bánh mì ở Đà Nẵng phải nhập viện với các triệu chứng nôn ói kéo dài kèm đau đầu. Chiều 2832013, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm Thái Bình cho biết đã có 69 người bị ngộ độc phải đưa vào Bệnh viện đa khoa Tây Tiền Hải để điều trị. Tất cả 69 người bị ngộ độc đều là công nhân của Công ty TNHH Global MFG Việt Nam. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, trong đó vi sinh vật cũng là nguyên nhân quan trọng. Đáng quan tâm nhất là E.coli. E.coli là vi khuẩn chỉ thị về vệ sinh thực phẩm rõ ràng nhất. Nếu phát hiện E.coli cho phép ta xác định được thực phẩm bị nhiễm bẩn tương đối do phân. Vi khuẩn này hiện diện một cách rất tự nhiên trong đường ruột của chúng ta, có cả hàng trăm chủng E.coli, đa số là chủng có lợi nhưng lại có một số chủng rất có hại. Vì vậy, việc nghiên cứu E.coli đang được các nhà nghiên cứu quan tâm.
A MỞ ĐẦU: Hiện nay, vệ sinh an toàn thực phẩm vấn đề quan tâm Mỗi năm, ước tính Hoa Kỳ xảy 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca 100 nghìn dân), triệu ca xảy Anh (3.400 ca/100 nghìn dân) 75 nghìn ca Pháp(1.220 ca/100 nghìn dân) Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy ra, đặc biệt ngộ độc tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm) Theo thống kê năm 2008, năm Việt Namcó khoảng 250- 500 ca ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân 100 - 200 ca tử vong Nhà nước Việt Nam tỷ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm điều tra tìm nguyên nhân Tiền thuốc men viện phí cho nạn nhân ngộ độc vi sinh vật tốn chừng 300.000 – 500.000 đồng, ngộ độc hóa chất (thuốc trừ sâu, phẩm màu…) từ – triệu đồng, chi phí bệnh viện phải chịu lớn nhiều Một số vụ việc nhắc đến gồm: Trong tháng năm 2012 xảy vụ ngộ độc thực phẩm làm 179 người bị ngộ độc, trường hợp tử vong Trưa 27/11/2012, 74 nữ công nhân Công ty TNHH Giày Uy Việt (KCN Đông Xuyên, TP Vũng Tàu) có dấu hiệu bị ngộ độc thức ăn sau ăn suất cơm chay Ở quận 12, TP HCM, 148 công nhân Công ty Terratex, có triệu chứng đau bụng, buồn nôn chóng mặt Theo công nhân, thức ăn tập thể mà họ dùng nhà bếp công ty nấu Đây lần thứ hai công ty xảy ngộ độc tập thể Trong ngày 7/3/2013, gần 30 người ăn bánh mì Đà Nẵng phải nhập viện với triệu chứng nôn ói kéo dài kèm đau đầu Chiều 28/3/2013, Chi cục An toàn vệ sinh thực phẩm Thái Bình cho biết có 69 người bị ngộ độc phải đưa vào Bệnh viện đa khoa Tây Tiền Hải để điều trị Tất 69 người bị ngộ độc công nhân Công ty TNHH Global MFG Việt Nam Có nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, vi sinh vật nguyên nhân quan trọng Đáng quan tâm E.coli E.coli vi khuẩn thị vệ sinh thực phẩm rõ ràng Nếu phát E.coli cho phép ta xác định thực phẩm bị nhiễm bẩn tương đối phân Vi khuẩn diện cách tự nhiên đường ruột chúng ta, có hàng trăm chủng E.coli, đa số chủng có lợi lại có số chủng có hại Vì vậy, việc nghiên cứu E.coli nhà nghiên cứu quan tâm Đề tài: “E.coli bệnh đường ruột” B NỘI DUNG: I Giới thiệu chung E.coli: Nguồn gốc tên gọi: Escherichia coli (thường viết tắt E.coli) hay gọi vi khuẩn đại tràng loài vi khuẩn ký sinh đường ruột động vật máu nóng (bao gồm chim động vật có vú) Vi khuẩn cần thiết trình tiêu hóa thức ăn thành phần khuẩn lạc ruột Sự có mặt E.coli nước ngầm thị thường gặp cho ô nhiễm phân vi Hình 1.1: HìnhE.coli chụp vithuộc khuẩn họ E.coli kính hiển vi với kích thước khuẩn Enterobacteriaceae thường sử dụng làm sinh vật mô hình cho nghiên cứu vi khuẩn Năm 1885, München, bác sĩ nhi khoa tên Theodor Escherich quan tâm đến phát quan trọng Louis Pasteur Robert Koch vi khuẩn Cùng với việc nghiên cứu bệnh tiêu chảy, Escherich tỏ rõ mối lưu ý tới vi sinh vật đường ruột trẻ em qua nhiều thí nghiệm lâm sàng Vi khuẩn Escherich phát từ tã lót trẻ em công bố với tên gọi Bacterium coli commune Chỉ năm sau vi khuẩn giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá Tuy nhiên, gọi tên Bacillus coli vào năm 1895 Bacterium coli vào năm sau đó, Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1919, vi khuẩn định danh thống toàn cầu Escherichia coli Đặc điểm: a Đặc điểm hình thái: E.coli trực khuẩn Gram âm, có hình que, đầu tròn, dài ngắn khác Kích thước trung bình từ đến 3µm x 0,5µm;, điều kiện không thích hợp (ví dụ môi trường có kháng sinh) vi khuẩn dài sợi chỉ, thường đứng riêng lẽ tế bào, có ghép đôi một, có kết với thành đám chuỗi ngắn Rất chủng E.coli có vỏ, hầu hết có lông có khả di động b Tính chất nuôi cấy: E.coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường Một số phát triển môi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng Hiếu kỵ khí tùy ý Có thể phát triển nhiệt độ từ 5-400C Nhiệt độ thích hợp xung quanh 370C Trong điều kiện thích hợp E.coli phát triển nhanh, thời gian hệ khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau đến làm đục nhẹ môi trường, sau 24 làm đục đều; sau hai ngày mặt môi trường có váng mỏng Những ngày sau, đáy ống thấy lắng cặn E.coli không mọc canh thang Selenit Trên môi trường thạch thường, sau khoảng đến 10 giờ, dung kính lúp quan sát khuẩn lạc Sau 24 khuẩn lạc có kích thước khoảng 1,5mm Hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, gặp dạng R, M Trên môi trường phân lập, tùy theo chất thị màu, E.coli có khuẩn lạc màu vàng (như thạch lactose) màu đỏ (như thạch MacConkey) Không mọc môi trường SS Một số loại E.coli có tính chất nuôi cấy riêng có giá trị sàng lọc nhanh, EAEC tạo thành váng đặc trường nuôi cấy canh thang Muller-Hinton c Tính chất hóa sinh : E.coli có khả lên men nhiều loại đường có sinh Hầu hết E.coli lên men lactose sinh hơi, trừ E.coli trơ (inactive) (trong có EIEC) không lên men chậm Một số chi khác họ vi khuẩn đường ruột có khả lên men nhanh lactose (như Klebsiella, Enterobacter, Serratia Citrobacter) gộp vào nhóm vi khuẩn có tên chung coliform E.coli có khả sinh indole Không sinh H 2S Không sử dụng nguồn carbon citrate môi trường Simmons Có decarboxylase, có khả khử carboxyl lysine, ornithin, arginin acid glutamic Betagalactosidase dương tính Thử nghiệm VP (Voges Proskauer) sau 24 âm tính, sau 48 dương tính Bảng 1.1: Tính chất hóa sinh số loài thuộc chi Escherichia Các loài E.coli E.coli E.blatta Thử nghiệm (bình (inactive e thường) ) CNPG + T Indole + T Đỏ + + + methyl Voges- E.fergus E.herma E.vulner E.alberti onii nnii is i T + + + + - - + + + ? - - - - Proskaue r Citrate (Simmo - - T T - - - decarbox T T + + - T + T - - - - T - T T + + + - + ylase Di động D- + - - + + + - Glucose + + + + + + + Glucose + - + + + + + sinh Lactose Sucrose D- + T T T - - T T T - - + Mannitol Adonitol Cellobio se D+ Sorbitol D- + - + + + + - - + - - - - - + + + - T - - - - - - - - - - - ns) Lysine ylase Arginine dihydrol ase Ornithin e decarbox acid D- Arabitol LRamnos e Sinh sắc tố vàng T T + + + + + - - - - + T - ONPG: Ortho-nitrophenyl-beta-Dgalactopyranoside +: >90% dương tính -: < 10% dương tính T: 10-90% dương tính *Cơ chế chuyển đổi: Indole tạo cách khử khử amin từ tryptophan qua axit indolepyruvic phân tử trung gian Tryptophanase xúc tác phản ứng khử amin, amin (NH ) nhóm phân tử tryptophan lấy Sản phẩm cuối phản ứng indole, axit pyruvic , amoni (NH + ) lượng Pyridoxal phosphate yêu cầu coenzyme d Kháng nguyên : Kháng nguyên O: người ta biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O E.coli Kháng nguyên K: Khoảng 100 yếu tố kháng nguyên K xác định chia thành ba loại: A, B L, A dạng vỏ quan sát kính hiển vi quang học thông thường, B L dạng màng mỏng quan sát nhờ kính hiển vi điện tử Kháng nguyên H: 50 yếu tố kháng nguyên H xác định e Phân loại : Dựa vào cấu trúc kháng nguyên, E.coli chia thành type huyết Với tổ hợp yếu tố kháng nguyên O, K H có nhiều type huyết khác Mỗi type huyết ký hiệu kháng nguyên O K, ví dụ O86B7 (yếu tố kháng nguyên O số 86, yếu tố kháng nguyên K số loại B) Dựa vào vị trí gây bệnh E.coli có khả gây bệnh người chia thành nhóm: thứ nhóm gây bệnh đường ruột (IPEC-intestinal pathogenic E.coli) hay E.coli gây tiêu chảy (DEC-Dierrheagenic E.coli), thứ hai nhóm gây bệnh đường ruột (ExPEC-extraintestinal pathogenic E.coli) _ Các loại E.coli gây bệnh đường ruột (IPEC) biết gồm: EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruột EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột _ Hai loại E.coli gây bệnh đường ruột quan trọng là: MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu Quy trình tóm tắt xác định số lượng E.coli: Chuẩn bị mẫu: Cân 50 g mẫu + 450ml dung dịch đệm phosphate Đồng mẫu Pha loãng mẫu: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 … Chuyển ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3Ủvào ống chưa 10 ml LSB (mỗi 35 C / 24-48 nồng độ pha loãng cấy ống nghiệm lặp lại) Ghi nhận ống dương tính (sinh hơi) nồng độ pha loãng Cấy ống dương tính vào canh EC ủ 450C/ 24 Số ống dương tính (sinh hơi) nồng độ pha loãng Cấy ống dương tính lên EMB Ủ 350C/ 24 – 48 Chọn khuẩn lạc điển hình làm thử nghiệm IMViC Test IMViC ++-Đếm số ống EC dương tính với E.coli Một số phương pháp phát E.coli: E.coli Phương pháp chuẩn đoán chủ yếu nuôi cấy phân lập Bệnh phẩm phân nuôi cấy môi trường phân lập có chất ức chế chọn lọc DCL, Endo Nước tiểu dòng tiến hành cấy đếm môi trường đặc, trước thường sử dụng thạch thường, có môi trường uriselect vừa có giá trị cấy đếm, vừa có khả định danh Tiến hành cấy máu nghi có nhiễm khuẩn máu Sau phân lập vi khuẩn xác định tính chất sinh vật hóa học định tên phản ứng ngưng kết phiến kính với kháng huyết mẫu Để xác định E.coli sinh độc tố người ta sử dụng nhiều phương pháp khác phương pháp quai ruột, phương pháp thử nghiệm tế bào nuôi, phương pháp đồng ngưng kết, ELISA, kỹ thuật khuếch đại gen PCR… Có loại phương pháp: _Phương pháp truyền thống: phương pháp MPN, phương pháp đếm khuẩn lạc, phương pháp làm giàu vi khuẩn… _Phương pháp đại: phương pháp PCR, phương pháp ELISA… 4.1 Phương pháp truyền thống: Phương pháp làm giàu vi khuẩn a Nguyên lý Phương pháp dựa vào làm giàu vi khuẩn trước canh thang dinh dưỡng MacConkey, làm giàu canh thang LST EE sau ria lên thạch L-EMB Những khuẩn lạc khả nghi kiểm tra đặc tính sinh hóa huyết EEC b Thiết bị đồ thủy tinh Chậu nước 440C 41,50C Tủ ấm 350C Máy pha trộn Ống nghiệm, pipet, đĩa Petri c Môi trường thuốc thử Môi trường lên men (carbohydrate fermentation medium) (mt 46) Thạch L-EMB (Levine’s methylene blue agar) (mt 76) Canh thang EE (Enteric enrichement broth) (mt 14) Môi trường indole thuốc thử (mt 44, mt 98) Canh thang LST (Lauryl sulphate tryptose broth) (mt28) Thạch MacConkey (mt 80) Canh thang MacConkey (mt 17) Canh thang nitrate (Nitrate broth) (mt 19) Canh thang dinh dưỡng (Nutrient broth) (mt 6) 10 11 12 13 14 Canh thang KCN (Potassium cyanide broth) (mt 3) Thạch TSI (Triple sugar iron agar) (mt 86) Canh thang urê (các thành phần thạch urê agar) (mt 93) Môi trường V.P (Voges Proskauer medium) (mt 54) Kháng huyết E.coli d Cách làm Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu thao tác vô khuẩn cho vào 225ml canh thang MacConkey 225ml canh thang dinh dưỡng blender vô khuẩn làm đồng 30 giây (1:10) Ria thẳng Ria từ canh thang dinh dưỡng đồng lên thạch L-EMB, thạch MacConkey Ủ ấm 350C 24h Làm giàu vi khuẩn : ủ ấm canh thang MacConkey 350C 20h , chuyển quai cấy sang 30ml canh thang LST Ủ ấm 44 0C 20h Ủ ấm canh thang dinh dưỡng 350C 6h, Chuyển quai cấy sang 30ml canh thang EE Ủ ấm 41,5 0C 18h Xét nghiệm sơ huyết : Trung hòa canh thang LST EE với 10% NaHCO 3, nhỏ giọt canh thang thứ lên phiến kính cho thêm giọt huyết đa giá OB giọt nước muối 0,5% Trộn giọt xem ngưng kết Xác nhận tính chất sinh vật hóa học : Ria từ canh thang LST dương tính lên thạch L-EMB EE dương tính lên thạch MacConkey thạch L-EMB Ủ ấm 350C 24h e Chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào môi trường: TSI, VP, indole, urease, KCN, citrate adonitol Đồng thời cấy lên mặt thạch nghiêng PCA khuẩn lạc dùng để kiểm tra huyết Đặc tính sinh vật hóa học E.coli TSI + acid 10 (H2S) V.P + IndoleUrease + KCN Adonitol - Cytochrome oxidase - f Nhận diện huyết E.Coli gây bệnh đường ruột: *Thạch EMB: Thạch Eosin methylene thạch màu xanh, có chứa thuốc nhuộm eosin xanh methylene EMB agar chọn lọc thuốc nhuộm anilin phương tiện truyền thông tím ức chế phát triển sinh vật Gram dương Lactose men chuyển hóa đường lactose phương tiện truyền thông sản xuất sản phẩm phụ axit, gây thay đổi màu sắc môi trường Vì vậy, EMB phương tiện khác biệt Sản xuất axit mạnh mẽ sinh vật E.coli kết ánh xanh kim loại Yếu trình lên men kết lactose môi trường với màu hồng tím Thuộc địa men nonlactose không màu, không đậm so với màu sắc phương tiện truyền thông 4.2 Phương pháp đại: Phương pháp ELISA a Nguyên tắc Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ bên đĩa giếng (microplate) Nếu có diện kháng nguyên mục tiêu mẫu, kháng nguyên giữ lại bề mặt giếng Các kháng nguyên phát cách sử dụng kháng thể thứ cấp có gắn với enzyme horseradish peroxidase hay alkaline phosphate Khi bổ sung chất đặc hiệu enzyme vào giếng, enzyme xúc tác 11 phản ứng thủy phân chất để tạo phản ứng có màu hay phát sáng Bằng cách theo dõi đổi màu, phát diện định lượng kháng nguyên Kháng nguyên ( Antigen ) chất có khả huy động hệ miễn dịch tiết kháng thể đặc hiệu với chúng gây phản ứng miễn dịch đặc hiệu Kháng nguyên bao gốm protein lạ, axit nucleic, số lipit poli saccarit Cấu trúc kháng nguyên: _E.coli có cấu trúc kháng nguyên với tên gọi O ( kháng nguyên thân), K (Kháng nguyên bề mặt) H (kháng nguyên lông) _Kháng thể ( Antibody ) protein ﻹ- globulin sinh tế lympo tham gia phản ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên Elisa sử dụng rộng rãi dạng hóa chất (kit) Elisa sử dụng phát định lượng vi sinh thực phẩm thời gian vài sau tăng sinh Kỹ thuật có độ nhạy phát khoảng 10 6CFU/ml(một số báo cáo cho giới hạn đạt 104) b Các phương pháp Elisa : *ELISA gián tiếp (indirect ELISA) gồm bước chính: _Chuyển KN biết lên bề mặt cứng (được gọi chung đĩa) KN cố định bề mặt Nồng độ mẫu kháng nguyên dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ kháng nguyên mẫu chưa biết _Chuyển mẫu KN chưa biết vào giếng khác KN chưa biết hòa tan loại dung dịch đệm giống mẫu KN chuẩn _Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) albumin huyết bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất mẫu (kể mẫu 12 chuẩn) Bước gọi "blockin" protein huyết có tác dụng ngăn cản hấp phụ protein khác lên bề mặt đĩa _Rửa bề mặt đĩa sau chuyển kháng thể (biết trước) vào tất giếng đĩa KT kết hợp với KN cố định mà không kết hợp với protein huyết _Thêm KT thứ cấp (secondary antibody), KT thứ cấp kết hợp với KT dư (bước bỏ qua kháng thể dùng để phát KN gắn với enzyme) _Rửa đĩa, kháng thể gắn enzyme dư loại bỏ _Thêm chất Enzyme làm biến đổi chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng yếu tố khuyếch đại) *Nhược điểm bản: Bước cố định KN tính đặc hiệu nên protein gắn với bề mặt đĩa KN (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với protein khác huyết gắn kết với bề mặt điwax Sandwich ELISA hạn chế nhược điểm *Sandwich ELISA: Phương pháp sử dụng để phát KN mẫu nghiên cứu bao gồm bước sau (quy trình thay đổi nhiều trường hợp): (1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT (2) Khóa tất vị trí gắn kết không đặc hiệu bề mặt (3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định (4) Rửa đĩa, kháng KN không gắn kết bị rửa trôi (5) Thêm KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán (6) Thêm KT thứ cấp gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp bước 5) 13 (7) Rửa đĩa, phần không gắn kết bị rửa trôi (8) Thêm chất Enzym biến đổi chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện (9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa qua xác định có mặt hàm lượng KT Hình 2.10: Các bước tiến hành Sanwich ELISA Các bước Sandwich ELISA (1) Phủ đĩa KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN KN (nếu có) gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát thêm vào kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme KT thứ cấp gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm chất Enzym làm biến đổi chất phát tín hiệu phát đo *ELISA cạnh tranh: (1) "Ủ" KT không đánh dấu với KN (2) Đưa hỗn hợp vào giếng vi phiếm có chứa KN (3) Rửa đĩa, KT không gắn kết bị rửa trôi Lượng KN lớn, lượng KT gắn thành công với KN đĩa thấp "cạnh tranh" (4) Thêm KT thứ cấp (KT KT bước 1) KT thứ cấp gắn với enzym (5) Thêm chất Lượng enzym dư giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu Trong phương pháp này, hàm lượng KN gốc cao, tín hiệu sản sinh yếu 14 Một số trường hợp, enzym gắn với KN KT II E.coli O157: H7: EHEC gọi E.coli sinh độc tố Shiga Yếu tố động lực EHEC độc tố Stx (Shiga toxin) hay độc tố gây độc tế bào Vero VT(veroccytotoxin) loại thuộc nhóm có tên VTEC – Verocytotoxin E.coli.Hiện nay, có ba loại Stx EHEC sinh xác định Stx1, Stx2 Stx2v.Các độc tố mã hóa gen prophage thích hợp nhiễm sắc thể Độc tố Shiga hủy hoại chọn lọc vi nhung mao hất thu tế bào biểu mô ruột.Nó xâm nhập vào tế bào biểu mô đại tràng,ức chế trình tổng hợp protein dẫn đến làm chết tế bào Hậu viêm đại tràng xuất huyết, gây tiêu chảy phân máu Những trường hợp hoại tử nặng gây thủng ruột Stx gây hội chứng tăng ure huyết tan máu (HUS-haemorrhagicuremic syndrome) Stx vào máu đến thận gây tổn thương tế bào biểu mô tiểu cầu thân,làm hẹp tắc mao mạch tiểu cầu thận Hậu trình mức lọc thận suy giảm, bệnh nhân bị suy thận cấp Escherichia coli O157: H7 Hình ảnh địa hình thuộc địa E coli chủng H7 (A) 43895OW (:O157 curli phi sản xuất) (B) 43895OR (curli sản xuất) trồng môi trường thạch 48 28 ° C Sơ lược E.coli O157: H7: 15 Escherichia coli O157: H7 enterohemorrhagic serotype vi khuẩn Escherichia coli nguyên nhân gây bệnh Nhiễm E.coli O157: H7 sau uống thực phẩm bị ô nhiễm nước, tiếp xúc miệng với bề mặt bị ô nhiễm E.coli O157:H7 tìm thấy ruột phân loài gia súc, đặc biệt phân bò Vi khuẩn xác định lần vào năm 1982 Hoa Kỳ nhân biến cố ngộ độc thực phẩm hamburger gây Từ vi khuẩn có tên vi khuẩn bệnh hamburger Tại lò sát sinh, E.coli O157:H7 hiển diện phân lây nhiểm vào quầy thịt Thịt bằm, thịt xay hay gọi thịt hamburger thịt bò thường có tỷ lệ nhiểm khuẩn cao nhất, E.coli O157:H7 nhiểm vào nguồn nước (nếu nước không khử rùng cholorine), vào rau cải, trái cây, giá sống, rượu cidre (apple cidre), sữa loại nước trái lon, hộp chúng không khử trùng trước bán Đặc điểm: Kích thước nhiễm sắc thể E.coli O157: H7 5.5 Mb Gen bao gồm xương sống tự Mb bảo tồn tất E.coli chủng Việc lại cụ thể cho E.coli O157: H7 Ngoài ra, hệ gen so sánh E.coli O157: H7 với nonpathogenic E coli K12 0,53 Mb DNA E.coli O157: H7 việc giảm gen đóng vai trò E.coli O157: H7 tiến hóa Đa số E.coli O157: H7 trình tự DNA đặc hiệu (1,4 Mb) ngang chuyển DNA ngoại prophage prophage giống yếu tố E.coli O157: H7 có chứa 463 gen thực khuẩn liên quan so với có 29 E.coli K-12 Một thay đổi G + C dấu hiệu cho thấy khu vực gen chuyển đoạn theo chiều ngang, ước tính 53 loài khác góp phần vào trình tự E.coli O157: H7 Việc thêm DNA đóng vai trò quan trọng phát triển bệnh sinh E.coli O157: H7 16 Một số nghiên cứu so sánh dịch tễ cho thấy E.coli O157: H7 có nguồn gốc từ phi toxigenic độc lực chủng E.coli O55: H7 E.coli O157: H7 lên qua bốn bước tuần tự; (i) thu vi khuẩn stx2 chứa, (ii) thu lại Po157 RFB khu vực, (iii) thu lại bacteriophage stx1 chứa, (iv) khả lên men D-sorbitol beta -glucuronidase (gud) hoạt động Cơ chế gây bệnh E.coli O157:H7: _Độc lực STEC việc tạo enterohaemolysin (EHEC-Hly) độc tố chịu nhiệt EASTI Mà EHEC-Hly mã hoá gen plasmid 60 Mda (pO157), plasmid tìm thấy tất dòng O157:H7 _Hầu hết ổ dịch STEC/EHEC O157:H7, _Phát triển nhanh 30 – 420C, tăng trưởng khó khăn 43 -440C, ngừng tăng trưởng 450C _Liều gây nhiễm: nhỏ, từ 10 -100 vi khuẩn (Griffin 1994; Paton 1996), diện phân, thực phẩm với tần số thấp so nhóm non - O157 (Paton, 1998) _Độc tố Shiga: hủy hoại vi nhung mao hấp thu tế bào biểu mô ruột, ức chế trình tổng hợp protein tế bào biểu mô đại tràng, dẫn đến làm chết tế bào, gây hội chứng HUS Phát E.coli O157:H7 phương pháp ELISA: 4.1 Phản ứng ELISA gián tiếp: a Nguyên liệu: _Microplate _Kháng nguyên chuẩn, huyết thỏ,conjugate (chất gắn kết) có gắn enzym ∆= peroxidase, bub trate (chất tạo màu phản ứng, thường TMBZ (3,3’ 5,5’ tetramethybenzodine)), PBS,PBS-Tween, Sữa tách bơ(casein) _Máy đọc phản ứng b Trình tự phản ứng: 17 _Bước Phủ kháng nguyên 100µl kháng nguyên pha loãng nồng độ thích hợp gắn trưc tiếp vào đĩa microplate Thời gian ủ kháng nguyên thường qua đêm nhiệt độ 4oC 37oC 2h Đổ bỏ dung dịch có microplate Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) có chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa lần, đập khô _Bước Phủ đĩa 200µl dung dịch sữa tách bơ 5% giếng, ủ nhiệt độ phòng lắc 37 oC sau Đổ bỏ dung dịch có microplate Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa lần, đập khô _Bước Gắn kháng thể : 100µl huyết pha loãng nồng độ thích hợp dung dịch PBS-sữa tách bơ 5% Kháng thể ủ đĩa nhiệt độ 37 oC, lắc sau 30 phút Đổ bỏ dung dịch có microplate Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa lần, đập khô _Bước Kháng thể đặc hiệu loài : 100µl conjugate pha loãng PBS với độ pha loãng 10.000 lần, nhỏ giếng ủ 37 oC 30 phút Đổ bỏ dung dịch có microplate Rồi dùng dung dịch PBS( Phosphate Buffer Saline) cò chứa Tween 20, 0,05% rửa đĩa lần, đập khô _Bước Cơ chất tạo màu : 100µl TMB vào giếng, để nhiệt độ phòng 15 phút, phản ứng chuyển sang màu xanh lục dương tính Dừng phản ứng dung dịch H2SO4 1M, lúc phàn ứng có màu vàng _Bước Đọc đĩa máy đọc đĩa ELISA bước sóng 450 nm Kháng nguyên thu hoạch trên, đươc đo nồng độ protein nhiệt độ -200C 4.2 Ứng dụng kháng thể đơn dòng xác định E.coli O157: H7: _E.coli O157:H7 có hai loại kháng ngyên có ý nghĩa chuẩn đoán kháng nguyên O157 H7 Vì vậy, kháng thể đơn dòng đặc hiệu với epitop hai 18 loại kháng nguyên thường sử dụng để xác định vi khuẩn hệ thống chuẩn đoán huyết _Kháng thể đơn dòng đặc hiệu MAB 46E9-9 nhận biết đặc hiệu kháng nguyên lông H7 loài E.coli Kháng thể MAB 13C4 nhận biết theo hướng nhận biết kháng nguyên độc tố Stx1 E.coli O157:H7 4.3 Ưu nhược điểm phương pháp Elisa: Ưu điểm: _Nhanh chóng thuận tiện _Kháng nguyên nồng độ thấp phát kể từ bắt giữ kháng thể lấy kháng nguyên cụ thể Nhược điểm: _Thời gian xét nghiệm lâu _Chỉ có kháng thể đơn dòng sử dụng cặp phù hợp _Kháng thể đơn dòng chi phí nhiều so với kháng thể đa dòng _Enzyme /chất phản ứng microwells phải đọc sớm tốt Các vụ nhiễm độc E.coli O157: H7: *Vụ án bánh mì kẹp thịt bò nhiễm khuẩn gây chấn động nước Mỹ Thứ Tư ngày 13/1/1993, Brainne chuyển tới Bệnh viện Nhi thành phố Seattle cô bé bắt đầu đau bụng từ ba ngày trước Một tuần trước, Brianne hai lần ăn bánh mì kẹp thịt bò cửa hàng thức ăn nhanh Jack in the Box Trong lúc dẫn tới phòng khám bác sĩ gia đình, mẹ Brianne phát dấu vết máu nước tiểu gái.Các bác sĩ chẩn đoán Brianne bị hội chứng tán huyết, tăng urê máu (HUS), biến chứng nguy hiểm gây khuẩn E coli sau nhiều ngày tiêu chảy thường gây suy thận đe dọa tính mạng, tình hình trở nên tệ hại 19 nhiều phận thể cô ngưng hoạt động Một tuần sau Brianne rơi vào hôn mê kéo dài tới 42 ngày Cô bị phù toàn thân, da vàng Các bác sĩ buộc phải phẫu thuật cắt bỏ ruột già cô bé Do lách Brianne tê liệt, sản xuất insulin nên cô bị tiểu đường Brianne đành sống nhờ máy trợ tim, phổi thận Vào hôm 24/2 Brianne tỉnh lại dần hồi phục Hơn 1.000 co giật gần nửa năm trời khiến hầu hết quan nội tạng não bị thương tổn, bị teo Cùng nhiễm bệnh đợt dịch với Brianne có 700 người, khoảng 170 người nhập viện trẻ em qua đời.Cùng lúc Brianne Kiner phát bệnh, Sở Y tế Washington (WDOH) tin số bệnh nhân nhập viện khu vực Seattle với triệu chứng cầu máu gia tăng, vài trẻ em số xác nhận hội chứng HUS vi khuẩn E coli dòng O157:H7 Trong vòng tuần, từ ngày 3/1 đến 17/1/1993, có người, phần lớn trẻ em Weston Washington vào viện với triệu chứng đau bụng tiêu chảy máu Một vài em suy thận phải chạy thận nhân tạo Chỉ riêng ngày 19/1 có 38 ca ghi nhận với triệu chứng tương tự Khoảng 40% bệnh nhân tuổi 2/3 số bệnh nhân 15 tuổi Có nạn nhân tử vong suy thận, bao gồm bé gái tuổi hạt Snohomish, bé trai tuổi khác Tacoma bé trai 16 tháng tuổi Bellingham *Dịch E Coli vừa bùng phát Washington khiến 32 trẻ nhiễm bệnh sau chúng tham gia lễ hội sữa tiếp xúc với vài loài gia súc Theo trang Food Poisioning Bulettin, dịch E.coli bùng phát diện rộng Lynden, Washington khiến 32 trẻ mắc bệnh tính ngày 1/5 vừa qua Những trẻ em bắt đầu xuất triệu chứng sau khoảng 1300 trẻ khác tới tham dự Lễ hội người làm sữa hạt Whatcom Được biết trình tham gia kiện này, đứa trẻ tiếp xúc với số loài vật ngựa, cừu, nhỏ, gà bê; tặng sữa chocolate tiệt trùng 20 Hiện quan chức y tế chưa thể xác định liệu có trẻ nhiễm chủng E coli O157:H7 mà lại xuất thêm biểu hội chứng tán huyết – tăng ure máu (HUS) khuẩn E.coli gây hay không Trẻ nhỏ đối tượng dễ mắc bệnh chết người HUS gây bệnh mãn tính đột quỵ, suy tim, suy hệ thần kinh, liệt cho dù triệu chứng ban đầu chữa khỏi Khả gây bệnh biểu bệnh: Ở người có sức khỏe bình thường E.coli O157:H7 gây rối loạn tiêu hóa, đau bụng, tiêu chảy, nôn mửa, thân nhiệt tăng chút Bình thường bệnh khỏi sau tuần 10 ngày Bệnh nặng trẻ em, người cao tuổi người mà hệ miễn dịch bị suy giảm yếu sẵn bệnh tật Từ 3%-5% trường hợp gây biến chứng sau vài ba tuần lễ… Độc tố Verotoxin E.coli.O157:H7 làm xung huyết (hemolysis), hủy hoại niêm mạc ruột gây têu chảy có máu, làm hư thận đồng thời làm giảm lượng nước tiểu Khoa học gọi hội chứng HUS ( Hemolytic Uremic Syndrome), nguy hiểm chết, không cần phải lọc thận suốt đời Nó nguy hiểm , với mức thấp khoảng từ 10 đến 100 CFU E.coli O157: H7 đủ để gây nhiễm trùng, so với triệu CFU chủng E.coli gây bệnh khác Ví dụ, E.coli O26 sản xuất loại độc tố E.coli O157 sản xuất, gây bệnh tương tự, thường có khả dẫn đến vấn đề thận (gọi hội chứng urê huyết tán huyết, HUS) Các triệu chứng nhiễm STEC khác cho người thường bao gồm chuột rút nặng bụng, tiêu chảy (thường có máu), ói mửa Nếu có sốt, thường cao (ít 101˚F / 38.5˚C) Hầu hết người tốt vòng 5-7 ngày Một số bệnh nhiễm trùng nhẹ, người khác nghiêm trọng chí đe dọa tính mạng 21 Khoảng 5-10% người chẩn đoán nhiễm STEC phát triển biến chứng đe dọa tính mạng gọi hội chứng urê huyết tán huyết (HUS) Manh mối người phát triển HUS bao gồm số lần tiểu giảm, cảm thấy mệt mỏi, màu hồng má bên mí mắt Người có HUS nên phải nhập viện thận họ ngừng làm việc họ phát triển vấn đề nghiêm trọng khác Hầu hết người có HUS phục hồi vòng vài tuần, số bị tổn thương vĩnh viễn chết Nguyên tắc điều trị, phòng bệnh đối tượng dễ lây nhiễm bệnh: 7.1 Điều trị: E.coli thuộc vào vi khuẩn có tỷ lệ kháng thuốc cao, chủng phân lập từ nước tiểu, cần phải làm kháng sinh đồ để chọn kháng sinh thích hợp Ngoài việc sử dụng kháng sinh, số việc khác có giá trị điều trị bồi phụ nước, điện giải trường hơp ỉa chảy (việc nhiều có vai trò định để cứu sống bệnh nhân), giải cản trở đường tiết niệu, rút ống thông sớm Đối với bệnh gây E.coli O157: H7, phương pháp điều trị chữa trị nhiễm trùng, làm giảm triệu chứng ngăn chặn biến chứng Đối với hầu hết người, tùy chọn tốt nghỉ ngơi uống nhiều nước để giúp đỡ với tình trạng nước mệt mỏi Tránh dùng thuốc chống tiêu chảy, điều làm chậm hệ thống tiêu hóa, ngăn chặn thể loại bỏ độc tố Thực theo biện pháp để ngăn ngừa nước giảm triệu chứng hồi phục: Chất lỏng Uống nhiều chất lỏng, bao gồm nước, nước sô-đa nước canh, gelatin nước trái Tránh táo nước ép lê, cà phê rượu 22 Thêm loại thực phẩm Khi bắt đầu cảm thấy tốt hơn, ăn vào chất xơ thực phẩm lần Hãy thử bánh soda, bánh mì nướng, trứng cơm Tránh loại thực phẩm định Sản phẩm sữa, thức ăn béo, chất xơ thực phẩm loại thực phẩm cứng làm triệu chứng nặng 7.2 Phòng bệnh Hiện chưa có vắc xin, thuốc bảo vệ khỏi bệnh E.coli, nhà nghiên cứu nghiên cứu vắc-xin tiềm Để làm giảm hội tiếp xúc với vi khuẩn E.coli, tránh thực phẩm nguy hiểm tránh lây nhiễm chéo Rủi ro từ thực phẩm Tránh hamburger đỏ Bánh mì kẹp thịt nên thực tốt Thịt sống phải ướp lạnh sớm tốt sẵn sàng sử dụng Khi nướng, thịt có màu nâu trước nấu chín hoàn toàn, nên sử dụng nhiệt kế để đảm bảo thịt đun nóng nhiệt độ tối thiểu 71 C điểm dày Nếu nhiệt kế, nướng thịt không thấy màu hồng trung tâm Uống sữa tiệt trùng, nước trái rượu táo Bất kỳ nước trái đóng hộp đóng chai giữ nhiệt độ phòng tiệt trùng, chí nhãn không nói Tránh dùng sản phẩm sữa sống nước trái chưa khử trùng Rửa nguyên liệu Mặc dù rửa không thiết loại bỏ tất E.coli, đặc biệt rau xanh, cung cấp nhiều điểm cho vi khuẩn bám vào, rửa cẩn thận loại bỏ chất bẩn làm giảm lượng vi khuẩn bám vào Tránh lây nhiễm chéo Rửa dụng cụ Sử dụng nước xà phòng nóng dao, bàn, thớt trước sau tiếp xúc với sản phẩm tươi sống thịt sống 23 Giữ cho thực phẩm sống riêng biệt Điều bao gồm cách sử dụng riêng biệt thịt sống thực phẩm rau trái Không đặt bánh mì kẹp thịt nấu chín đĩa mà dùng cho nguyên liệu sống Rửa tay trước sau chuẩn bị ăn thức ăn, sau sử dụng phòng tắm thay tã (phải rửa tay cho em bé, vứt tã lót cách khử trùng khu vực thay tã) Hãy chắn trẻ em rửa tay trước ăn, sau sử dụng phòng tắm sau tiếp xúc với động vật Thực vệ sinh vùng hậu môn phận sinh dục ngoài, thực nghiêm túc nguyên tắc vô trùng phải tiến hành thăm dò đặt thông đường tiết niệu Điều trị loại trừ yếu tố nguy khác Không chuẩn bị thức ăn cho người khác, tránh bơi lội bể bơi công cộng, hồ, chia sẻ phòng tắm với người khác thân bị tiêu chảy không bơi lội hồ bơi ao hồ quý vị bị tiêu chảy 7.3 Đối tượng dễ lây nhiễm vi khuẩn: E.coli ảnh hưởng đến người tiếp xúc với vi khuẩn Nhưng số người có nhiều khả phát triển người khác Các yếu tố rủi ro bao gồm: Tuổi: Trẻ em người lớn tuổi có nguy cao bệnh gây E.coli biến chứng nghiêm trọng từ nhiễm trùng Suy yếu hệ thống miễn dịch: Những người suy yếu hệ thống miễn dịch AIDS loại thuốc để điều trị ung thư để ngăn chặn đào thải cấy ghép nội tạng, có nhiều khả mắc bệnh ăn phải vi khuẩn E.coli Ăn số loại thực phẩm: Rủi ro thực phẩm bao gồm hamburger nấu chưa chín, sữa chưa tiệt trùng, nước táo rượu táo mát mềm làm từ sữa tươi 24 Phẫu thuật dày: Những người phẫu thuật để giảm kích thước dày có nhiều khả phát triển triệu chứng từ E.coli, có acid dày để tiêu diệt vi khuẩn C Kết luận: Có nhiều nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm phần lớn trường hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật Một loại ngộ độc thực phẩm gây vi sinh vật thường gặp ngộ độc thực phẩm vi khuẩn E.coli Do phương pháp phát E.coli có vai trò quan trọng nhiệm vụ đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm giảm tỷ lệ ngô độc thực phẩm vi khuẩn gây nên Triển vọng nghiên cứu vắc xin điều trị: _Vấn đề tìm loại vắc xin chống khuẩn E.coli hấp dẫn, song việc nghiên cứu loại vắc xin găp nhiều khó khăn chủng khuẩn E.coli có cấu trúc gen khác _Các nhà khoa học phòng thí nghiệm hãng Novartis Italy lấy đồ gan vi khuẩn thay dùng vi khuẩn làm điểm khởi đầu giúp vượt qua khó khăn nói _Các nhà nghiên cứu sử dụng đồ gen để chọn hàng trăm kháng thể chung chủng E.coli gây bệnh _Tuy nhiên, chưa thấy vắc xin đâu mà có dư luận nghi ngờ người nguyên nhân làm thay đổi cấu trúc gen làm cho E.coli trở thành cực độc 25