Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán viêm âm đạo, cổ tử cung do Chlamydia trachomatis tại Bệnh viện Đại học Y Thái Bình (luận văn thạc sĩ)
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - TRẦN THỊ HÒA NGHIÊN C U NG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG CHẨN ĐOÁN VIÊM ÂM ĐẠO, CỔ TỬ CUNG DO CHLAMYDIA TRACHOMATIS TẠI BỆNH VIỆN ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis .9 1.2 Các xét nghiệm chẩn đoán vi khuẩn Chlamydia trachomatis 12 1.2.1 Nuôi cấy 12 1.2.2 Kỹ thuật miễn dịch gắn enzyme (enzyme immunoassays – EIAs) .13 1.2.3 Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (direct fluorescent antibody - DFA) 14 1.2.4 Kỹ thuật khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) 14 1.3 Các nghiên cứu Chlamydia trachomatis giới nước .16 1.3.1 Các nghiên cứu giới 16 1.3.2 Các nghiên cứu nước 24 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN C U 29 2.1 ĐỐI T NG NGHI N CỨU .29 2.1.1 Đối tư ng nghiên cứu 29 2.1.2 Thời gian nghiên cứu 29 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 29 2.2 PH NG PH P NGHI N CỨU .29 2.2.1 Phư ng pháp chọn m u c m u 29 2.2.2 Kỹ thuật xét nghiệm 30 2.2.2.1 Phư ng pháp lấy m u .30 2.2.2.2 Xử lý m u 30 2.2.2.3 Tách chiết ADN 31 2.2.2.4 Tối ưu hóa phản ứng PCR 31 2.2.2.5 Xác định độ nhạy phản ứng PCR 35 2.2.2.6 Đánh giá độ đặc hiệu phản ứng 36 2.2.2.7 Xác định t lệ nhiễm Chlamydia trachomatis bệnh nh n viêm m đạo, c tử cung đến khám bệnh viện Đại học Y Thái nh từ tháng đến tháng 10 năm 2011 .37 2.2.2.8 Điện di, ph n t ch kết 37 2.2.3 Xử lý số liệu 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .39 3.1 Tối ưu hóa phản ứng PCR phát Chlamydia trachomatis 39 3.1.1 Nồng độ MgCl2 39 3.1.2 Nồng độ mồi 41 3.1.3 Thời gian nhiệt độ gắn mồi .43 3.1.4 Số chu kỳ 40 3.2 Độ nhạy kỹ thuật PCR 49 3.3 Độ đặc hiệu kỹ thuật PCR .50 3.4 Kết xét nghiệm kỹ thuật PCR 50 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH VẼ Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen vi khuẩn Chlamydia trachomatis…………………… Hình 1.2 Chu kỳ vòng đời vi khuẩn C.trachomatis……………………………… Hình 1.3 T lệ nhiễm C.trachomatis số nước Ch u Âu……………………10 H nh 3.1 Ảnh điện di kết tối ưu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL1/KL2…….34 Hình 3.2 Ảnh điện di kết tối ưu nồng độ MgCl2 với cặp mồi KL5/KL6…….35 Hình 3.3 Ảnh điện di kết tối ưu nồng độ mồi KL5/KL6…………………… 36 H nh 3.4 Ảnh điện di kết tối ưu nồng độ mồi KL1/KL2…………………… 36 H nh 3.5 Ảnh diện di kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL1/KL2……………… 38 H nh 3.6 Ảnh diện di kết tối ưu nhiệt độ gắn mồi KL5/KL6……………… 38 H nh 3.7 Ảnh diện di kết tối ưu thời gian gắn mồi KL5/KL6……………….39 H nh 3.8 Ảnh diện di kết tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2…………….….40 H nh 3.9 Ảnh diện di kết tối ưu chu kỳ phản ứng……………………………40 H nh 3.10 Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai lần vi khuẩn C trachomatis……43 H nh 3.11 Kết xét nghiệm m u bệnh phẩm………………………… …45 ảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR lần thứ nhất…………………………… …41 ảng 3.2 Chu tr nh nhiệt phản ứng PCR lần thứ nhất…………………….….42 ảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR lần 2…………………………………….…42 ảng 3.4 Chu tr nh nhiệt phản ứng PCR lần 2……………………………….43 ảng 3.5 Kết xét nghiệm C.trachomatis…………………………………….45 ảng 3.6 T lệ nhiễm C.trachomatis theo độ tu i……………………………… 46 ảng 3.7 T lệ nhiễm C.trachomatis theo khu vực……………………………….47 Lời cảm ơn Trong qu¸ trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn đà nhận đ-ợc dạy bảo tận tình thầy cô, giúp đỡ bạn đồng nghiệp, động viên to lớn gia đình ng-ời thân Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, Tôi xin trân trọng cảm ơn GS TS L-ơng Xuân Hiến- ng-ời thầy mẫu mực tận tâm đà trực tiếp h-ớng dẫn, dìu dắt b-ớc tr-ởng thành đ-ờng học tập, nghiên cứu khoa học nh- sống Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Ngọc Khái, ThS Nguyễn Nam Thắng cán Trung tâm Dịch vụ Khoa học kỹ thuật Y d-ợc- tr-ờng Đại học Y Thái Bình đà tận tình bảo cho ý kiến quí báu trình thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể thầy, cô giáo, đồng nghiệp bạn bè đà nhiệt tình giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin dành tất tình yêu th-ơng lòng biết ơn sâu nặng cho cha mẹ, chồng ng-ời thân gia đình- ng-ời bên tôi, hết lòng Trần Thị Hòa BNG CH VIẾT TẮT C trachomatis Chlamydia trachomatis DFA Direct Fluorescent Antibody EIAs Enzyme Immuno Assays LPS Lipopolysaccharide MOMP Major Outer Membrane Protein NAATs Nucleic Acid Amplication Tests PCR Polymerase Chain Reaction TPHA Treponema Pallidum Hemagglutination Assay MỞ ĐẦU Hiện nay, vấn đề nóng bỏng chăm sóc sức khỏe sinh sản mà nước giới đối mặt bệnh l y truyền qua đường t nh dục Viêm đường sinh dục Chlamydia trachomatis đư c coi bệnh l y truyền qua đường t nh dục đứng đầu giới Nhiễm Chlamydia trachomatis thường g y viêm niệu đạo, viêm c tử cung Tuy nhiên khơng điều trị d n đến biến chứng viêm phần phụ, đau vùng chậu mãn t nh, thai ngồi tử cung, vơ sinh t n thư ng ống d n trứng, viêm mào tinh địi hỏi phải chăm sóc y tế với ph t n cao T chức Y tế giới ước t nh hàng năm có khoảng 90 triệu ca nhiễm Chlamydia trachomatis đư c phát [34] ệnh Chlamydia trachomatis hay gặp người trẻ tu i, độ tu i sinh đẻ Các nghiên cứu đ y cho thấy, t lệ mắc bệnh tăng lên Tại Châu Âu từ năm 1996-2003, số bệnh nh n nhiễm Chlamydia trachomatis tăng gấp đôi, Hoa Kỳ số tăng 14% giai đoạn 2000-2005 [15, 18] Ở Việt Nam khoảng vài năm gần đ y vấn đề nhiễm khuẩn Chlamydia trachomatis đư c ý Một vài nghiên cứu đưa t lệ khoảng 30% trường h p đến khám phụ khoa có tiết dịch đường m đạo bất thường Chlamydia trachomatis Nguy hiểm nhiễm Chlamydia trachomatis qua đường sinh dục có tới 75% nữ giới 50% nam giới mắc bệnh mà khơng có triệu chứng, người bệnh hồn tồn m nh nhiễm vi khuẩn [2,9] Để chẩn đoán nhiễm Chlamydia trachomatis người ta thường dùng xét nghiệm ni cấy- tiêu chuẩn vàng để chẩn đốn xác định nhiễm Chlamydia trachomatis Tuy nhiên xét nghiệm có hạn chế phải bảo đảm vi khuẩn sống tr nh vận chuyển đến phòng xét nghiệm, thời gian xét nghiệm dài Khuếch đại acid nucleic (nucleic acid amplification tests – NAATs) kỹ thuật sinh học ph n tử đư c ứng dụng rộng rãi y học để phát tồn vi sinh vật m u bệnh phẩm Phản ứng chuỗi trùng h p (Polymerase Chain Reaction– PCR) NAATs có độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiều nghiên cứu xem PCR tiêu chuẩn vàng để khảo sát giá trị xét nghiệm chẩn đoán khác Đối với bệnh nhiễm Chlamydia trachomatis, xét nghiệm cho phép xác định tồn vi khuẩn dịch m đạo, tử cung bệnh nh n Với mong muốn đóng góp vào cơng tác chăm sóc sức khỏe nói chung cơng tác chăm sóc sức khỏe sinh sản nói riêng, thực đề tài “ n u ng dụn kỹ t uật PCR tron ẩn đoán v m âm đạo, ổ tử un C lamyd a tra omat s tạ Bện v ện Đạ ọ Y T Bình” với mục tiêu: - Chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thực phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis - Xác đ nh tỷ lệ nhi m Chlamydia trachomatis bệnh nhân viêm âm đạo, c t cung Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatis thuộc chi Chlamydia, họ Chlamydiaceae, lớp Chlamydiae, ngành Chlamydiae, giới Bacteria [2, 9] Về h nh thái quan sát k nh hiển vi quang học, vi khuẩn có h nh cầu h nh bầu dục, k ch thước khác nhau, vi khuẩn Gram âm có màng lipopolisaccharide Vì thiếu số enzyme t ng h p h p chất cao sử dụng cho tế bào, vi khuẩn phải ký sinh nội bào bắt buộc, khơng có khả sống sót bên ngồi tế bào Hệ gen Chlamydia trachomatis gồm ph n tử DNA dài 1.042.519 nucleotide với 894 tr nh tự mã hóa cho protein Hình 1.1 Cấu trúc hệ gen vi khuẩn Chlamydia trachomatis ( Theo Deborah Dean et al., (2009) Predicting Phenotype and Emerging Strains among Chlamydia trachomatis Infections, CDC Home Vol 15.(9)) Chlamydia trachomatis (C.trachomatis) chứa đến 10 plasmid có k ch thước 7.5 kb Tr nh tự nucleotide plasmid tr nh tự bảo thủ cao (có 1% nucleotide thay thế), chứa khung đọc mở (Open Reading Frame) mã hoá gen kháng nguyên Mặc dù chức plasmid chưa xác định hết tr nh tự nucleotide có mặt plasmid tế bào chứng tỏ có vai trị quan trọng vi khuẩn C.trachomatis C.trachomatis đư c chia thành 15 loại tuýp huyết khác bao gồm: Tuýp huyết (A-K), L1, L2, L3, a, Da, Ia L2a Trong tuýp A, B, Ba C g y bệnh mắt hột Tuýp D, E, F, G, H, I, J K g y bệnh viêm đường sinh dục Tuýp L1, L2 L3 g y bệnh lympho hạt, bệnh viêm hạch bạch huyết hoa liễu bẹn [2,9] Chu kỳ phát triển C.trachomatis bào tư ng tế bào kéo dài 48-72 [34] Vòng đời C.trachomatis gồm giai đoạn: Thể c thể lưới - Thể c (Elementary Body- EB) tế bào trịn có đường k nh khoảng 0.3m, nh n đậm Thể x m nhập vào tế bào theo kiểu thực bào - Thể lưới (Reticulate Body- RB): Sau x m nhập vào tế bào C.trachomatis chuyển hóa nhờ tế bào tạo thành thể lưới (đường k nh 1m), sinh sản theo h nh thức ph n đôi kiểu trực ph n khoảng 2-3 lần Sau thể lưới lại chuyển thành thể c giải phóng khỏi tế bào thơng qua h nh thức ngoại tiết bào (exocytosis) Thông thường thể lưới giải phóng 100-1000 thể c tiếp tục x m nhập vào tế bào Hình 1.2 Chu kỳ vòng đời vi khuẩn C.trachomatis (theo Yvonne Pannekoek) 10 Thời gian gắn mồi Thời gian gắn mồi đư c chuẩn hóa phản ứng PCR Với cặp mồi KL5/KL6 thời gian gắn mồi thay đ i từ 20s, 30s, 40s 50s 60s, phản ứng đư c chuẩn bị khối lư ng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG Chu tr nh nhiệt : 37°C 15 phút, biến t nh ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC; 20s, 30s, 40s 50s 60s 590C; phút 72°C) 35 chu kỳ, bước kéo dài 20 phút 72°C giữ 4°C Kết điện di cho thấy hiệu gắn mồi tốt 60s (h nh 3.7) M NC 20s 30s 40s 50s 60s Hình 3.7 Ảnh diện di kết tối ưu thời gian gắn mồi KL5/KL6 Với cặp mồi KL1/KL2 tiến hành thử nghiệm với thời gian gắn mồi thay đ i từ 20, 30, 40, 50 60s, kết khác biệt lớn băng điện di 50 60s Do kiểm tra lại thử nghiệm thời gian 20s, 30s, 40s Phản ứng đư c chuẩn bị khối lư ng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG Chu trình nhiệt: 37°C 15 phút, biến t nh ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC, 20s, 30s, 40s 550C, phút 72°C) 35 chu kỳ bước kéo dài phút 72°C Kết cho thấy hiệu gắn mồi 40s nét (hình 3.8) Do vậy, chọn thời gian gắn mồi cho KL1/KL2 40s phản ứng PCR thứ 45 NC 20s 30s 40s M NC: Chứng âm, khơng có sản phẩm DNA (2 µl nướckh ion) Hình 3.8 Ảnh diện di kết tối ưu thời gian gắn mồi KL1/KL2 3.1.4 Số u kỳ Phản ứng PCR tiến hành với hai cặp mồi, số chu kỳ với cặp mồi đư c thay đ i để thu đư c kết tốt thời gian ngắn Phản ứng PCR vòng đư c tiến hành với số chu kỳ 20, 25 30 chu kỳ Với cặp mồi KL5/KL6, phản ứng đư c chuẩn bị khối lư ng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 2.1 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, 0.05 U UNG Chu tr nh nhiệt: 37°C 15 phút biến t nh ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC; phút 59ºC; phút 72°C) 20, 25, 30 chu kỳ, bước kéo dài 20 phút 72°C giữ 4°C Sau tiến hành phản ứng PCR vịng 2, phản ứng đư c chuẩn bị khối lư ng cuối 25 µl có chứa Master mix 2X; 1.5 mM MgCl2; nồng độ mồi 0.4 pmol/µl, µl sản phẩm phản ứng PCR vịng 1,0.05 U UNG theo chu kỳ Chu tr nh nhiệt: biến t nh ban đầu 95°C 10 phút, (1 phút 94ºC, 40s 55ºC, phút 72°C) 20, 25, 30 chu kỳ bước kéo dài phút 72°C Quan sát kết điện di hình 3.9 M Hình 3.9 Ảnh diện di kết tối ưu chu kỳ phản ứng 46 Giếng số đến giếng số 3: 20 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Giếng số đến giếng số 6: 25 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Giếng số đến giếng số 9: 30 chu kỳ PCR lần 20, 25, 30 chu kỳ PCR lần Kết thấy giếng số 3, số số 7, với t ng số 50 chu kỳ phản ứng PCR th kết khếch đại tốt giếng số (25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 25 chu kỳ PCR lần với cặp mồi KL1/KL2) Giếng số số hiệu khuếch đại thấp, không sử dụng Các giếng khác cho băng điện di rõ nét không sử dụng v thời gian xét nghiệm dài Giếng số cho băng nhỏ h n giếng số thành phần nguyên liệu phản ứng cạn kiệt d n đến đứt gãy DNA chu kỳ biến t nh lại Kết tư ng tự với giếng số số V lựa chọn 25 chu kỳ với cặp mồi KL5/KL6 25 chu kỳ PCR lần với cặp mồi KL1/KL2 để thực phản ứng PCR phát vi khuẩn C trachomatis Với kết rút ngắn thời gian tiến hành hai phản ứng PCR xuống Từ kết trên, chọn đư c điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2 số chu kỳ tối ưu cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis Điều kiện tối ưu kỹ thuật PCR nhiệt độ gắn mồi, thời gian gắn mồi, nồng độ MgCl2 nồng độ mồi đư c thể qua bảng sau: ảng 3.1: Thành phần phản ứng PCR vòng Thành phần phản ứng PCR Thể t ch Mastermix 2X 12.5µl H2O khử ion vơ trùng 4.4µl MgCl2 (mM) 2.1µl 2.1mM Mồi KL5/KL6 1µl 0.4 pmol UNG 0.05 µl 0.05 U DNA template 5µl T ng Nồng độ 25µl 47 ảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng Nhiệt độ Thời gian (phút : gi y) Số chu kỳ 37ºC 15:00 95ºC 10:00 94ºC 01:00 59ºC 01:00 72ºC 01:00 72ºC 20:00 4ºC ∞ 25 ảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR vòng Thành phần phản ứng PCR Thể t ch Mastermix 2x 12.5µl H2O khử ion vơ trùng 9µl Nồng độ MgCl2 (mM) 1.5µl 1.5mM Nồng độ mồi 1µl 0.4 pmol PCR product 1µl T ng Nồng độ 25µl 48 ảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vịng Nhiệt độ Thời gian (phút : gi y) Số chu kỳ 95ºC 10:00 94ºC 01:00 55ºC 00:40 72ºC 01:00 72ºC 20:00 4ºC ∞ 25 Độ nhạy củ kỹ thuật PCR Phản ứng PCR gồm hai lần chạy đư c thực với m u chứng dư ng plasmid có nồng độ khác nhau: 101, 102, 103, 104 sao/µl sử dụng 10 µl để điện di gel agarose 1% M Hình 3.10 Ảnh diện di độ nhạy phản ứng PCR hai vòng vi khuẩn C.trachomatis Kết điện di (hình 3.10) cho thấy phản ứng dư ng t nh (quan sát đư c băng DNA sau nhuộm ethidium bromide) m u có từ 10 plasmid trở lên Dựa kết đánh giá độ nhạy kỹ thuật PCR, lựa chọn nồng độ DNA chuẩn để làm chứng dư ng cho phản ứng PCR phát vi khuẩn Chlamydia trachomatis m u bệnh phẩm 101 Sử dụng chứng dư ng nồng độ 49 làm giảm nguy c ngoại nhiễm khuếch tán sản phẩm PCR lần tr nh chuyển sản phẩm khuếch đại lần sang tuýp thứ hai Độ nhạy thuận l i cho thực tế phát bệnh v số lư ng vi khuẩn m u bệnh phẩm thấp Tuy so với nghiên cứu Pamela Cribb, Juan Pablo Scapini Esteban Serra, phản ứng nested PCR sử dụng hai cặp oligonucleotides (KL5/KL6 KL1/KL2) làm mồi phát t h n 10 E phản ứng m u sinh học khác nhau, độ nhạy phản ứng chưa cao Do đề xuất thử nghiệm PCR điều kiện nghiêm ngặt h n nhằm tăng giá trị độ nhạy 3 Độ đặc hiệu củ kỹ thuật PCR Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi KL1, KL2 đư c thực với m u DNA vi khuẩn Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci m u DNA có sẵn phòng th nghiệm như: m u DNA người, Escherichia Coli, Mycobacteria Tuberculosis, Hepatitis B virus, Human Papilloma virus Các phản ứng sau thực đư c điện di kiểm tra gel agarose 1% cho kết m t nh Điều chứng tỏ độ đặc hiệu cao 100% phản ứng PCR, không khuếch đại sản phẩm đối tư ng khác kể loài Chlamydia khác 3.4 Kết xét nghiệm kỹ thuật PCR Phản ứng hai vịng NAATs có độ nhạy độ đặc hiệu cao Tuy nhiên khả ngoại nhiễm lớn Để giảm thiểu nguy c ngoại nhiễm, chúng tơi sử dụng bốn phịng riêng biệt, để pha mix, để chuẩn bị m u PCR lần 1, tạo phản ứng PCR lần phòng điện di Trong phản ứng sử dụng dUTP thay cho dCTP đồng thời sử dụng enzyme Uracyl-N-Glycosylase (UNG) nồng độ 0,05U Enzyme có tác dụng ph n cắt liên kết N- glycosylic Uracyl glucose sản phẩm ngoại nhiễm có chứa dUTP phản ứng thành dUTP tự do, vơ hiệu hố amplicon nhiễm từ đ t PCR trước tránh đư c kết dư ng t nh giả Do vậy, trước thực chu kỳ khuếch đại chu tr nh PCR, cần ủ bệnh phẩm 37ºC 15 phút với enzyme UNG để phá tr nh tự sản phẩm PCR nhiễm từ đ t trước Các chu tr nh khuếch đại làm bất hoạt hoạt t nh UNG với nhiệt độ 55ºC Sau chạy xong chu 50 kỳ khuếch đại, ủ m u 72ºC thời gian 20 phút để bất hoạt hoàn toàn hoạt t nh UNG, không g y cản trở cho việc đọc kết PCR Kết dư ng t nh giả đư c loại trừ chứng m thực đồng thời với xét nghiệm m u thay DNA khuôn nước khử ion vô trùng Kết m t nh giả đư c hạn chế đến mức thấp v phản ứng có độ nhạy cao, phát đư c kết dư ng t nh có mặt 10 E Kết xét nghiệm m u bệnh phẩm đư c thể h nh 3.11 NC M Hình 3.11 Kết xét nghiệm mẫu bệnh phẩm NC: Chứng âm, khơng có sản phẩm DNA (2 µl nướckh ion) Giếng số 1,3,4: Mẫu bệnh phẩm dương t nh Giếng số 2: Mẫu bệnh phẩm âm t nh Giếng số 5: Chứng dương M: Thang DNA 100 bp Fermentas với k ch thước vạch 100 bp T lệ dư ng t nh C.trachomatis số bệnh nh n đến khám phòng khám Sản phụ khoa, bệnh viện Đại học Y Thái nh thể bảng 3.5 PCR Số lư n Tỷ lệ p ần trăm Dư ng tính 80 36.9 % Âm tính 137 63.1 % T ng 217 100% ảng 3.5 Kết xét nghiệm C.trachomatis 51 Trong số 217 bệnh nh n có biểu viêm m đạo, c tử cung đến khám bệnh viện Đại học Y Thái nh từ tháng đến tháng 10 năm 2011 có 80 người có kết dư ng t nh với C.trachomatis chiếm t lệ 36.9% Kết cao h n nghiên cứu Trần Thị L i đối tư ng viêm m đạo, c tử cung năm 1999 có t lệ 32.5% [8]; bệnh viện da liễu thành phố Hồ Ch Minh năm 2008 với xét nghiệm PCR t lệ 35.7% [6]; bệnh viên phong da liễu Quy Hòa 12.1% [5] Trong nghiên cứu t lệ thấp bệnh viên phong da liễu Quy Hịa c m u t Kết cao h n nhiều so với nghiên cứu Farhad Hashemi cộng Iran năm 2006 [16] Tuy nhiên nghiên cứu Sóc Trăng đối tư ng phụ nữ mại d m t lệ dư ng t nh với C.trachomatis 48.4% [3], cao h n nghiên cứu Kết xét nghiệm chưa phản ánh đư c toàn quần thể v cịn có đối tư ng nhiễm bệnh khơng có biểu viêm nhiễm nên khơng khám, xét nghiệm lần đư c áp dụng Thái nh V vậy, với kết dư ng tính cao trên, chúng tơi đề xuất việc triển khai xét nghiệm vi khuẩn C.trachomatis bệnh viện Đại học Y Thái nh đối tư ng nữ có khơng có biểu viêm nhiễm sinh dục nhằm kiểm soát l y nhiễm vi khuẩn qua đường t nh dục Đồng thời đề nghị tiến hành nghiên cứu thêm c m u lớn h n để khẳng định kết Tiếp tiến hành thống kê số bệnh nh n theo nhóm tu i Kết thu đư c thể bảng 3.6 Bện nhân theo nhóm Số mẫu dươn tuổ tính 35 (n=88) 32 36.4% Tỷ lệ ảng 3.6 Tỷ lệ nhi m C.trachomatis theo độ tu i 52 Kết cho thấy nhóm 25 tu i có t lệ nhiễm vi khuẩn C.trachomatis cao nhất, chiếm 40.6% Nghiên cứu tác giả ulhak Koziol V cộng 33] tỉnh alan cho thấy t lệ dư ng t nh với vi khuẩn 39.5%, gần tư ng đư ng với kết Sự khác biệt t lệ dư ng t nh nhóm 25 tu i 35 tu i có ý nghĩa thống kê với p