NHỮNG QUI ĐỊNH TRONG PHÒNG THỰC HÀNH VI SINH VẬT A Mục tiêu: Thực yêu cầu đảm bảo an tồn phịng thực hành Thực qui định đề phòng nhiễm trùng Trình bày biện pháp phịng ngừa xử trí số rủi ro xảy thực hành vi sinh B Nội dung Những yêu cầu đảm bảo an toàn 1.1 Những yêu cầu phòng thực hành vi sinh vật – ký sinh trùng Phải có diện tích làm việc bố trí phù hợp Khoảng cách làm việc hợp lý nhằm hạn chế tối đa di chuyển phịng, tránh nguy lây nhiễm Thơng thường phịng thực hành vi sinh vật cần phân chia khu vực sau: - Lưu trữ mẫu - Rửa dụng cụ, khử trùng, làm khơ - Bảo quản hóa chất - Pha chế môi trường - Thao tác nuôi cấy vi sinh vật có lợi - Thao tác ni cấy vi sinh vật gây bệnh Phòng thực hành phải đảm bảo đủ sáng, thống khí khơng bụi Khu thao tác nuôi cấy cần lắp đặt đèn UV để tiệt trùng khơng khí khơng gian làm việc, hạn chế tối đa việc sử dụng quạt để tránh lây nhiễm Hóa chất cần bảo quản nơi khô, mát, tránh ánh sáng chiếu trực tiếp an toàn cháy nổ 1.2 Sổ lưu ký thí nghiệm * Nhật ký thiết bị Các dụng cụ, thiết bị phải có sổ ghi chép, người sử dụng cần ghi đăng ký thời gian bắt đầu kết thúc sử dụng dụng cụ, thiết bị, tình trạng trước sau sử dụng * Nhật ký thí nghiệm Mỗi sinh viên làm thực hành cần phải có sổ ghi chép cơng việc làm, kết thu cách cẩn thận, rõ ràng làm phúc trình kết thực giấy A4 (Ví dụ: Họ Tên, Lớp, nhóm, ngày tháng năm, tên thực hành, phương pháp tiến hành, diễn biến kết quả…) 1.3 Các qui tắc an tồn Thao tác an tồn phịng thực hành vi sinh vật yêu cầu quan trọng, phải tiếp xúc trực tiếp với lượng lớn vi sinh vật (khoảng 10 tế bào/ml ), có nhiều chủng vi sinh vật tác nhân gây bệnh nguy hiểm, ảnh hưởng đến sức khỏe tính mạng Ngồi có số hóa chất độc hại nên làm việc cần ý đến qui tắc an toàn để bảo vệ thân người xung quanh - Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật - Di chuyển nhẹ nhàn, thao tác cận thận chắn - Trước sau làm việc với vi sinh vật, cần sát trùng vị trí, khơng gian làm việc, dụng cụ hai tay cồn 70o để khô - Khi lỡ tay làm đổ hay nhiễm vi sinh vật nơi làm việc, cần dùng khăn giấy tẩm cồn 70o hay chất diệt khuẩn lau kỹ khử trùng lại nơi làm việc - Khi đốt que cấy có dính vi sinh vật cần đặt đầu hay vòng cấy vào chân lửa, thân que cấy nằm vào lửa đốt cho cháy đỏ trước sau kéo từ từ lên đến vịng cấy để tránh văng vi sinh vật vào khơng khí - Cẩn thận thao tác với đèn cồn, dùng nấp đậy cách dứt khốt, khơng thỏi đèn miệng, không dùng đèn để mồi lửa, không để đèn cháy mà không làm việc - Không dùng mũi ngửi hóa chất, mơi trường, vi sinh vật - Khơng dùng miệng hút hóa chất mà phải chọn lựa dụng cụ phù hợp để sử dụng - Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, phải đeo găng tay để thu gom hết mảnh vỡ cho vào túi riêng - Các dụng cụ, thiết bị cần phải nắm rõ cách sử dụng, không sử dụng tùy tiện - Tất chất thải rắn, mơi trường có chứa nhiễm vi sinh vật cần khử trùng trước bỏ vào bãi rác Các dụng cụ nhiễm vi sinh vật cần ngâm nước tẩy (nước javel dung dịch sát khuẩn khác) trước rửa tái sử dụng - Sát trùng rửa tay trước rời phịng thí nghiệm Một số nguyên tắc làm việc với vi sinh vật Khi làm việc với vi sinh vật cần hạn chế đến mức tối đa lây nhiễm nhầm lẫn giống với nhau, cần thực bước sau: + Khử trùng: Phịng thí nghiệm phải vệ sinh sẽ, bàn làm việc lau chất sát khuẩn thích hợp (dung dịch javen, cồn 70o, cloramin 1%, ), chiếu tia cực tím (UV) trước tiến hành thí nghiệm + Khơng có luồng gió lưu thơng làm thí nghiệm, đóng kín cửa không sử dụng quạt + Cấy vi sinh vật cần thực tủ an toàn sinh học (tủ cấy vô trùng) + Dụng cụ dùng để nuôi, cấy vi khuẩn phải vô trùng + Các thao tác thực bên lửa đèn cồn + Que cấy phải hơ nóng trước lấy mẫu sau sử dụng + Cầm ống nghiệm trạng thái nghiên góc nhỏ 45 so với mặt phẳng ngang để hạn chế bụi rơi vào Hơn nóng miệng ống nghiệm sau mở nắp trước đóng nắp + Đối với đĩa Petri, để đĩa nằm ngang, nắp nằm phía trên, đáy nằm phía mở tạo góc khoảng 30o, làm nắp cịn che phía đáy đĩa hạn chế bụi rơi vào + Khi để tủ ấm hay tủ lạnh để đáy phía trên, nắp phía hạn chế bay nước làm khơ mơi trường Những qui định đề phòng nhiễm trùng Để đề phòng nhiễm trùng, làm việc phòng thực hành vi sinh vật cần phải thực nghiêm túc qui định sau đây: - Không ăn uống, hút thuốc phịng - Đầu, tóc gọn gàn - Mặt áo blouse, mang trang, đeo tay thao tác với vi sinh vật hay hóa chất - Thận trọng khơng để bắn giọt nhỏ có vi sinh vật ngồi khơng khí, lắc hay ly tâm dung dịch có vi sinh phải đậy nắp - Khử trùng thường xuyên bàn làm việc, sàn nhà chất sát khuẩn - Các thiết bị nhiễm vi sinh (tủ ấm, máy ly tâm, ) phải khử trùng chất sát khuẩn Xử trí số tai nạn hay gặp Loại tổn thương Xử trí Hóa chất hay chất sát khuẩn có nồng độ Nhanh chóng rửa kỹ nước cao bắn vào mắt chuyển đến bệnh viện chuyên khoa Hít phải chất sát khuẩn, dung dịch kiềm Bôi vaselin oxycyanat acid Tổn thương vật nhọn đâm hay Bóp cho máu chảy, rửa nước sạch, bôi mảnh thủy tinh vỡ cồn (iod betadin) Bỏng Cho nước lạnh chảy qua khoảng 10 phút, sau bơi thuốc chống bỏng Vi khuẩn vào miệng Không nuốt, xúc miệng kỹ nước có chất sát khuẩn BÀI 1: DỤNG CỤ, THIẾT BỊ TRONG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP LÀM MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG (5 tiết) A Mục tiêu: - Biết sử dụng, bảo quản trang thiết bị, dụng cụ thường dùng phịng thí nghiệm vi sinh vật - Thực bước chuẩn bị môi trường dinh dưỡng để phân lập vi khuẩn B Nội dung Các trang thiết bị thường dùng 1.1 Các dụng cụ thủy tinh - Đĩa petri (hộp lồng): gồm nắp đáy nhỏ lồng vào nhau, thường dùng chứa môi trường đặc (thạch) để cấy vi khuẩn Khi đĩa có chứa mơi trường cần úp ngược đĩa tránh bóc nước làm khơ mơi trường - Ống nghiệm: Dùng để nuôi tăng sinh vi khuẩn, pha loãng hay lưu trữ vi khuẩn - Lọ thủy tinh/ bình tam giác: dùng để chứa hóa chất, mơi trường nuôi cấy - Cốc thủy tinh/cốc nhựa: dùng để pha mơi trường, pha hóa chất - Đèn cồn: có tác dụng vô trùng làm việc với vi khuẩn - Phiến kính/lam: sử dụng làm tiêu quan sát hình thái, sinh hóa, di động vi khuẩn,… - Lá kính/lamel: Dùng để đậy lên vết bơi vi khuẩn phiến kính - Phiến kính có khung đếm/buồng đếm: Dùng để kiểm tra số lượng vi khuẩn 1.2 Dụng cụ thiết bị khác - Que cấy: Được chế tạo kim loại chóng nóng chóng nguội, dùng để lấy chuyển vi khuẩn, có loại que cấy: + Que cấy vòng: làm kim loại, có đầu uốn cong thành vịng trịn, sử dụng lấy vi khuẩn từ môi trường lỏng đặc chuyển sang môi trường khác, sử dụng cấy vạch (cấy ria) để tách ròng + Que cấy thẳng: làm kim loại, đầu thẳng dùng để cấy trích sâu mơi trường đặc + Que cấy móc: làm kim loại, đầu uốn cong giống có móc dùng để cấy nấm xạ khuẩn + Que cấy gạt: thường làm thủy tinh, đầu có hình tam giác hình chữ L dùng để phân bố dịch chứa vi khuẩn mặt môi trường đặc - Cân: cân mơi trường, hóa chất,… - Máy đo pH: dùng để phá hóa chất mơi trường - Tủ lạnh/tủ âm: lưu trữ, vi sinh vật, hóa chất, mơi trường - Tủ cấy vơ trùng (tủ an tồn sinh học): Có hệ thống quạt, đèn UV, khử trùng tạo khoảng không gian vô trùng để cấy vi sinh vật - Tủ ấm: Dùng để ủ vi sinh vật, có chế độ điều chỉnh nhiệt độ phù hợp giúp cho vi sinh vật phát triển - Tủ sấy: dùng để sấy khô dụng cụ - Nồi hấp khử trùng nhiệt ướt (autoclave): hấp khử trùng môi trường, số nguyên liệu dụng cụ thí nghiệm nước áp suất cao - Kính hiển vi quang học: dùng để quan sát hình thái, di động hay khảo sát trực tiếp số lượng vi khuẩn Kính hiển vi quang học 1.3 Một số điểm cần lưu ý sử dụng thiết bị, dụng cụ - Tủ lạnh, tủ ấm: bảo quản môi trường nuôi cấy vi khuẩn, hóa chất hay giống vi sinh vật cần phải ghi thời gian làm dấu tên người làm thí nghiệm, xếp gọn gàng, ngăn nắp tránh nhầm lẫn hay đổ vỡ - Đối với tủ cấy vô trùng: trước cấy phải bậc đèn UV 30 phút, trước sau cấy phải dùng cồn 700 lau tủ Sử dụng chổi giẻ riêng để quét, lau tủ, bậc quạt cấy - Que cấy: trước sau cấy phải hơ lửa đèn cồn đầu thân que cấy cháy đỏ - Đèn cồn: Không dùng miệng thổi đèn, không mồi lửa từ đèn sang đèn khác, không rót cồn q đầy Khi khơng sử dụng đèn dùng nắp đậy để tắt đèn - Hấp khử trùng: Cần thận để tránh bị bỏng, phải nắm rõ yêu cầu mục đích khử trùng, điều kiện khử trùng, cách sử dụng khử trùng Các dụng cụ chứa hóa chất, mơi trường khử trùng khơng chứa nhiều 1/3 thể tích - Kính hiển vi quang học: Cần quan sát mẫu vật kính có độ phóng đại nhỏ (10X) thật rõ trước chuyển sang vật kính dầu (100X) Ở vật kính 40X thấy rõ, nhỏ giọt dầu vào tiêu điểm sáng chuyển vật kính 100X vào Khơng sử dụng ốc thứ cấp điều chỉnh quan sát mẫu vật kính 40X 100X Đối với vật kính dầu, sau sử dụng xong phải dùng giấy khăn lau dành riêng tẩm cylon xăng tốt lau thật Thực hành làm môi trường dinh dưỡng Làm môi trường dinh dưỡng dùng để phân lập, nhân giữ giống vi sinh vật, đồng thời để nuôi cấy nghiên cứu đặc điểm sinh học chúng + Nguyên tắc - Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hoá chất dinh dưỡng loại sinh vật - Đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vật - Đảm bảo điều kiện hoá lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật + Dụng cụ thiết bị - Đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, cân, máy đo pH, phễu, giấy lọc, tủ cấy vô trùng, tủ ấm - Môi trường dinh dưỡng, agar, nước cất + Các bước thực - Cân, đong xác thành phần mơi trường theo hướng dẫn nhà sản xuất (đối với môi trường pha sẳn) hóa chất theo cơng thức mơi trường - Hịa tan chất vào nước - Làm môi trường cách lọc môi trường bơng giấy lọc - Kiểm tra thể tích, pH có - Phân phối mơi trường vào dụng cụ ống nghiệm, bình tam giác Đối với ống nghiệm, trước rót phải đun cho hóa chất hịa tan rót vào ống nghiệm Mơi trường phân phối vào dụng cụ khoản ¼ đến 1/3 thể tích dụng cụ - Khử trùng, tùy loại môi trường yêu cầu sử dụng chọn phương pháp khử khác nhau, thông thường khử trùng nhiệt ướt nhiệt độ 121oC, áp suất atm, thời gian 15 phút + Đổ thạch (môi trường dinh dưỡng thạch) Thao tác đổ khẩn trương khéo léo để hạn chế nhiễm khuẩn Mặt thạch phải phẳn, nhẵn, có độ dày khoản 2mm Mơi trường sau đổ cho vào tủ ấm – ngày kiểm tra xem có nhiễm khuẩn hay khơng sử dụng • Làm thạch đĩa: - Việc phân phối môi trường vào đĩa petri phải thực vô trùng - Đĩa petri phải vô khuẩn (khử trùng lúc với môi trường) - Đặt đĩa tủ cấy vơ trùng, nắp nằm phía trên, đáy phía - Hé nắp phần đĩa rót mơi trường vào (tùy theo mục đích thí nghiệm mà lượng mơi trường phân phối vào đĩa dày hay mỏng) - Đậy nắp lại, xoay đĩa theo đường trịn tới, lui vài lần tránh làm mơi trường dính vào thành đĩa - Hé mở nắp phần đĩa, bậc đèn UV tủ để yên khoảng 15 phút - Tắc đèn UV, đậy nắp đĩa lật úp mặt đáy lên cho vào hộp đựng đĩa bọc kiến để vào tủ ấm nhiệt độ 37 oC 24 – 48 kiểm tra nhiễm khuẩn Bảo quản lạnh – 5oC, sử dụng khơng q tuần • Làm thạch nghiên - Mơi trường sau pha rót vào ống nghiệm khơng q ¼ thể tích ống - Vặn nút ống nghiệm khơng q chặt làm khơng - Khử trùng - Sau khử trùng ống nghiệm chứa mơi trường đặt nghiên góc cho mơi trường ống tạo thành mặt phẳng nghiên, sâu đạt yêu cầu - Để nguội, vặn nắp ống nghiệm chặt lại giữ ống đứng, bảo quản điều kiện lạnh • Làm thạch đứng - Các bước thực giống thạch nghiên, sau khử trùng ta giữ ống môi trường đứng môi trường cứng lại Các đĩa, ống môi trường dán nhãn (nhãn gồm tên môi trường, thời gian đổ, người làm thí nghiệm) 10 BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E.COLI (10 tiết) A Mục tiêu: - Nắm nguyên tắc cách thực để xác định mật độ coliform E coli thực phẩm - Đánh giá mẫu thực phẩm có đạt tiêu chuẩn mặt vi sinh thực phẩm B Nội dung Khái niệm Coliforms trực khuẩn gram âm khơng sinh bào tử, hiếu khí kỵ khí tùy ý, có khả lên men lactose sinh acid sinh 37 oC 24 – 48 Coliforms xem nhóm vi sinh vật thị: số lượng diện chúng thực phẩm, nước hay loại mẫu môi trường dùng để thị khả diện loại vi sinh vật gây bệnh khác Nhóm Coliforms gồm giống là: E coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter Tính chất sinh hóa đặc trưng nhóm thể qua thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) Citrate (iC) thường gọi IMViC Coliforms chịu nhiệt Coliforms có khả lên men lactose sinh khoảng 24h ủ 44oC môi trường lỏng EC Coliforms phân (Faecal Coliforms) Coliforms chịu nhiệt có khả sinh indole ủ khoảng 24h 44oC môi trường lỏng trypton E coli Coliforms phân cho kết thử nghiệm IMViC ++ (Indol +, Methyl Red +, Voges-Proskauer -, Citrate – Nguyên tắc Số lượng Coliforms, Coliforms chịu nhiệt, Coliforms phân E coli chứa mẫu nước, thực phẩm với mật độ thấp xác định phương pháp MPN (Most Probable Number) Phương pháp MPN phương pháp định lượng vi khuẩn dựa kết định tính loạt thí nghiệm lặp lại số độ pha loãng khác nhau, độ pha loãng cách 10 lần Thông thường, việc định lượng thực lặp lại lần độ pha loãng liên tiếp Các ống nghiệm mẫu có đặt ống bẫy khí Durham để theo dõi sinh Các ống nghiệm sau ủ thấy có đổi màu sinh ghi nhận dương tính Số lượng ống nghiệm dương tính nồng độ ghi nhận tra bảng Mac Crady để suy số lượng vi khuẩn diện 1g (1ml) mẫu ban đầu 18 Dụng cụ, hóa chất mẫu thực phẩm * Dụng cụ: ống Durham, ống nghiệm, đầu côn xanh, đầu côn vàng, micropipet, chai nút xanh, đĩa petri, cần kỹ thuật số lẻ,… * Mơi trường hóa chất: LSB (Lauryl Sulphate Broth), BGBL (Brilliant Green Bile Lactose Broth), EC (E.coli medium), EMB (Eosin Methylene Blue Agar), MR-VP Both (Glucose Phosphate), trypticase, NaCl, Pepton * Mẫu thực phẩm: mẫu nước đóng chai, mẫu rau quả, mẫu thịt, mẫu sữa, mẫu trứng, … Các bước tiến hành Bước 1: Chuẩn bị môi trường + Buổi - Dung dịch pha loãng mẫu SPW (mỗi nhóm 27ml, phân bố vào ống nghiệm) - Mơi trường LSB (mỗi nhóm 90ml, phân bố vào ống nghiệm) + Buổi - Môi trường BGBL (mỗi nhóm 90ml, phân bố vào ống nghiệm) - Mơi trường EC (mỗi nhóm 90ml, phân bố vào ống nghiệm) + Buổi - Môi trường thạch EMB (mỗi nhóm đĩa) + Buổi - Trypton (mỗi nhóm 20ml, phân bố ống nghiệm) - MR-VP (mỗi nhóm 30ml, phân bố vào ống nghiệm) - SCA (mỗi nhóm 50ml, phân bố vào ống nghiệm) Bước 2: pha loãng mẫu - Lấy 1g (đối với mẫu rắn) 1ml (đối với mẫu lòng) cho vào ống nghiệm chứa SPW đồng mẫu ống nghiệm mẫu có độ pha loãng 10 -1, lấy 1ml dung dịch mẫu ống nghiệm cho vào ống thứ ống nghiệm có độ pha lỗng 10 -2, thực tương tự độ pha lỗng 10-3 Q trình pha lỗng mẫu tóm tắt qua hình sau: 19 1ml 1ml 10ml Pha loãng Độ pha loãng 10-1 101 9ml 1ml 9ml 1ml 1ml 9ml 9ml 9ml 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 102 103 104 105 106 Hình Sơ đồ pha loãng mẫu Bước 3: Cấy mẫu vào canh LSB Chuyển 1ml dung dịch mẫu nồng độ pha lỗng 10 -1, 10-2, 10-3 vào ống nghiêm có chứa 10ml mơi trường LSB lỏng có đặt ống Durham, nồng độ có ống lặp lại, ủ 37oC Hình chuyển mẫu vào mơi trường LSB lỏng Sau 48 kiểm tra sinh chuyển màu môi trường Ghi nhận số ống nghiệm sinh nồng độ Bước 4: Cấy chuyển mẫu vào mơi trường BGBL EC Dùng que cấy vịng lấy mẫu từ ống sinh chuyển vào ống mơi trường BGBL EC có đặt ống Durham Ủ 37 oC thời gian 48 môi trường BGBL, 44oC 24 ống môi trường trường EC 20 Bước 5: Định lượng Coliform E Coli Bước 6: thử nghiệm IMViC a Thử nghiệm Indol (I): + Nguyên tắc: Tryptophan acid amin bị oxi hóa số vi sinh vật có hệ enzyme tryptophanase tạo nên sản phẩm chứa gốc indol Việc phát indol thực phản ứng phân tử với thuốc thử chứa p-Dimethylaminbenzaldehyde (p-DMABA) tạo nên phức chất dạng quinone có màu đỏ + Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm nước tryptone Sinh khối chủng cấy vào môi trường lỏng tryptone, ủ nhiệt độ 37oC 24-48 Bổ sung 1ml ether xylene vào ống nghiệm, lắc để chiết tách indol lên lớp dung môi hữu Nhỏ giọt thuốc thử vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút, theo dõi tạo màu đỏ lớp dung môi hữu + Đọc kết quả: (+) xuất lớp màu đỏ bề mặt môi trường (-) lớp màu vàng thuốc thử Đơi có xuất màu cam skatol, tiền chất methyl hóa indol tạo 21 b Thửnghiệm Methyl Red (MR): + Nguyên tắc: thị đỏ methyl red giúp phân biệt nồng độ H + diện môi trường sau vi sinh vật lên men glucose Chỉ thị thay đổi màu sau: pH 6.0 màu vàng + Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm môi trường lỏng Glucose Phosphate (MR-VP Broth) Dùng que vịng cấy lượng nhỏ khuẩn lạc mơi trường MR-VP, ủ 37oC khoảng 2-5 ngày Thêm vào vài giọt thuốc thử đỏ methyl red (0.02% hỗn hợp cồn nước có tỷ lệ 3:2, bảo quản oC) vào ống nghiệm dịch nuôi cấy, đọc kết + Đọc kết quả: (+) môi trường có màu đỏ sau bổ sung thuốc thử (-) có màu vàng Trường hợp màu cam, cần tiếp tục ủ ống mơi trường có giống ngày thực lại thử nghiệm c Thử nghiệm Voges-Proskauer (VP) + Nguyên tắt: thử nghiệm VP dùng để nhận biết aceton Trong q trình biến dưỡng, nhóm vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae sản sinh 2,3- butanediol, chất bị oxy hóa tạo thành aceton Trong mơi trường kiềm, có diện oxy, aceton tiếp tục bị oxy hóa tạo thành diacetyl Diacetyl kết hợp với nhân guanidine có pepton hình thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ 22 + Phương pháp: Cấy chủng vi khuẩn thử nghiệm sau ủ 18-24 vào ống mơi trường lỏng Clark-Lubs (mơi trường MR-VP) có pH 6.9 Các ống nghiệm ủ 37oC thời gian từ 24-48 Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử vào ống vi khuẩn Thuốc thử Barritt gồm dung dịch A 5% α-naphthol cồn tuyệt đối, dung dịch B 40% NaOH hay KOH Trước tiên nhỏ giọt dung dịch A, sau nhỏ giọt dung dịch B + Đọc kết quả: Sau 20 phút chậm Thử nghiệm VP (+) có màu đỏ bề mặt mơi trường Phản ứng âm tính khơng đổi màu bề mặt môi trường d Thử nghiệm Citrate (iC) + Nguyên tắc: biến dưỡng citrate vi sinh vật tạo CO2 làm kềm hóa mơi trường Mặt khác VSV có khả sử dụng citrate làm nguồn carbon có khả dùng muối ammonium làm nguồn đạm Sự phân giải muối ammonium dùng làm nguồn đạm môi trường sinh NH làm kiềm hóa mơi trường Sự gia tăng giá trị pH thị đổi màu thị pH môi trường + Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm mơi trường lỏng SCA Dùng que vịng cấy ria lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn ống nghiệm thạch nghiêng, ủ 35oC khoảng 24-48 + Đọc kết quả: (+) xuất khuẩn lạc môi trường chuyển sang màu xanh dương (-) khơng có khuẩn lạc mơi trường giữ nguyên màu xanh lục 23 Cách tính kết Từ số lượng ống nghiệm có E coli (+) độ pha loãng mẫu, dùng bảng MPN loạt ống nghiệm nồng độ pha loãng liên tiếp để tính mật độ vi sinh vật mẫu biểu diễn dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha lỗng Tóm tắt qui trình 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Thùy Linh 2010 Thực hành phân tích vi sinh thực phẩm Trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm TP HCM Trần Linh Thước 2006 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục 25 PHỤ LỤC QUY CHUẨN KỸ THUẬT QUỐC GIA ĐỐI VỚI Ô NHIỄM VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM QCVN 8-3: 2012/BYT 26 27 28 29 30 31 32