Đang tải... (xem toàn văn)
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜKHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜKHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP. CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ
Năm học 2012 - 2013 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM FUSARIUM SP CỦA MỘT CHỦNG XẠ KHUẨN PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Hoàng Thị Hồng (Sinh viên năm 4, Khoa Sinh học) GVHD: ThS Nguyễn Ngọc Phương Mở đầu Theo thống kê tổ chức Nông – Lương Thế giới cho thấy loại trồng đồng ruộng phải chống đỡ với 100.000 loài sâu hại, 10.000 loài nấm, 200 loài vi khuẩn, 600 loài tuyến trùng 600 loài virus gây bệnh khác Đây lực lượng hùng hậu công trồng, gây tổn thất đáng kể cho mùa màng Hàng năm, có khoảng 20% sản lượng lương thực thực phẩm giới bị trắng [6] Trước thực trạng đó, người không ngừng tìm kiếm, nghiên cứu biện pháp phòng, chống tác nhân gây hại Vì vậy, ngành công nghiệp hóa học đời không ngừng pháp triển Chúng ta phủ nhận vai trò to lớn thuốc trừ sâu hóa học ngành nông nghiệp nhiên biện pháp hóa học nảy sinh hạn chế như: tượng kháng thuốc tác nhân gây hại, gây ô nhiễm môi trường cân sinh thái, gây nguy hại đến sức khỏe người,… Để khắc phục hạn chế biện pháp hóa học, nhà khoa học bắt tay nghiên cứu tìm chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học Chế phẩm thuốc trừ sâu bệnh có nguồn gốc sinh học có nhiều ưu việt so với thuốc hóa học, cụ thể là: không gây hại cho người, động vật, trồng, chưa phát hiện tượng lờn thuốc, nhanh chóng phân hủy, không gây ô nhiễm môi trường [9] Xạ khuẩn đối tượng quan tâm khả đối kháng chúng với vi sinh vật (VSV) kiểm định, đặc biệt xạ khuẩn phân lập rừng ngập mặn (RNM) hi vọng với điều kiện môi trường sống khắc nghiệt cho hợp chất sinh trưởng thứ cấp quý Để đáp ứng nhu cầu góp phần phát triển Nông nghiệp Việt Nam định chọn đề tài “Khảo sát khả kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Mục đích đề tài tìm chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm Fusarium sp mạnh khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả kháng nấm chủng xạ khuẩn tuyển chọn Đề tài thực từ tháng 10 năm 2012 đến tháng năm 2013 phòng thí nghiệm Sinh hóa – Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh (TPHCM) Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Xạ khuẩn phân lập từ đất RNM huyện Cần Giờ - TPHCM 61 Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Nấm Fusarium sp nhận từ sưu tập giống Viện Công nghệ Sinh học Trường Đại học Nông Lâm TPHCM Các loại môi trường (MT) – MT Gause I: lít nước cất; 20 g tinh bột; 20 g agar; 0,5 g MgSO4.7H2O; g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,1 g FeSO4; 0,5 g K2HPO4 [2] – MT Gause II: lít nước cất; g cao thịt; g peptone; 10 g glucose; 20 g agar [3] – MT PDA: 300 g khoai tây (cắt hạt lựu); lít nước cất Đậy nắp đun sôi, lọc, bổ sung nước cất cho đủ lít, sau thêm 50 g glucose 20 g agar tiếp tục đun sôi [8] – MT Emerson: lít nước cất; g peptone; g cao thịt; g cao nấm men; 20 g glucose; 20 g agar – MT ISP4: lít nước cất; 10 g tinh bột tan; g K2HPO4 ; g MgSO4; g NaCl; g CaCO3; g (NH4)2SO4; 20 g agar [5] 2.2 Phương pháp – Phương pháp phân lập mẫu (Uyenco, 1988), – Phương pháp bảo quản sử dụng giống [4], – Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn [3], – Phương pháp xác định khả kháng nấm [7],[10], – Khảo sát điều kiện lên men ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chất kháng nấm [5], – Phương pháp xác định khối lượng khô [6] Kết bàn luận 3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng có hoạt tính kháng nấm Fusarium sp Từ mẫu đất lấy RNM Cần Giờ, phân lập 55 kiểu khuẩn lạc (tạm gọi chủng) xạ khuẩn khác đuợc kí hiệu từ F1 đến F55 Chúng tiến hành phân xạ khuẩn thành nhóm dựa tiêu chí: màu sắc khuẩn lạc, màu sắc mép khuẩn lạc, hình dạng mép khuẩn lạc, sắc tố tan 55 chủng xạ khuẩn phân lập có 11 chủng có khả kháng nấm Fusarium sp ,trong đó: chủng có hoạt tính kháng nấm Fusarium sp mạnh, chiếm 36,36%; số chủng có hoạt tính trung bình yếu chiếm 63,64% Kết khả kháng nấm Fusarium sp 11 chủng xạ khuẩn thể bảng Bảng Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn phân lập từ RNM Cần Giờ Chủng xạ Hoạt tính kháng nấm STT khuẩn Fusarium sp (D – d, cm) F8 1,6 F20 0,5 62 Năm học 2012 - 2013 10 11 F33 F38 F39 F40 F41 F45 F46 F47 F49 1,9 2,1 1,1 1,1 2,0 1,7 2,2 2,0 1,8 Chúng định chọn chủng xạ khuẩn F46 chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh để tiến hành thí nghiệm sau 3.2 Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn F46 – Quan sát đại thể: Trên môi trường Gause I sau ngày cấy chấm điểm xạ khuẩn tạo thành khuẩn lạc tròn có đường kính khoảng mm Mặt khuẩn lạc tạo thành lỗ tổ ong nhỏ màu nâu, khuẩn ty khí sinh phát triển theo hình phóng xạ tạo thành vòng tròn đồng tâm bao bên Mép khuẩn lạc màu trắng, cưa Mặt trái khuẩn lạc phẳng, khuẩn ty chất có màu trắng, có màu vàng nhạt Hình Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn F46 – Quan sát vi thể: Sau ngày nuôi cấy đĩa petri phương pháp xẻ rãnh thạch Dưới kính hiển vi độ phóng đại X1000, khuẩn ty khí sinh có vách ngăn, cuống sinh bào tử dạng xoắn lò xo Sau – ngày, cuống sinh bào tử hình thành bào tử hình trụ theo phương pháp phân đoạn Các bào tử hình thành suốt chiều dài cuống sinh bào tử tạo thành chuỗi bào tử 63 Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH a b Hình Hình thái hệ sợi khuẩn ty (a) cuống sinh bảo tử (b) chủng xạ khuẩn F46 (độ phóng đại x1000) 3.3 Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến khả kháng nấm Fusarrium sp chủng xạ khuẩn F46 3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp Môi trường đóng vai trò quan trọng sinh trưởng phát triển VSV Một môi trường tốt thường phải môi trường vừa thuận lợi cho sinh trưởng tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao Chúng tiến hành lên men chủng xạ khuẩn F46 môi trường: Gause I, Gause II, Emerson ISP4 Quá trình lên men tiến hành bình tam giác 250 ml chứa 50 ml dịch môi trường bổ sung 2% lượng giống, lắc 160 vòng/phút 28 - 30oC Sau 72 lên men xác định khả kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn Kết thu thể bảng hình Bảng Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn F46 môi trường lên men khác STT Môi trường Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp (D – d, cm) Gause I Gause II Emerson ISP4 2,0± 0,15 2,1± 0,23 2,6± 0,07 1,8± 0,19 Hình Đồ thị hoạt tính kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn F46 môi trường lên men khác 64 Năm học 2012 - 2013 Số liệu bảng đồ thị cho thấy chủng xạ khuẩn F46 sinh trưởng thể khả kháng nấm Fusarium sp môi trường Tuy nhiên, thể khả kháng nấm Fusarium sp tốt môi trường Emerson môi trường giàu đạm hữu điều cho thấy chúng có khả phân bố rộng tự nhiên Môi trường Emerson có nguồn đạm đa dạng điều chứng tỏ khả sinh enzyme protease giúp chủng xạ khuẩn F46 tận dụng nhiều nguồn dinh dưỡng khác chủng xạ khuẩn tham gia tích cực vào trình chuyển hóa vật chất RNM Bên cạnh với thành phần môi trường Emerson tương đối đơn giản so với môi trường lại ưu tiến hành thí nghiệm sau Hình Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn F46 môi trường lên men khác 3.3.2 Xác định động thái trình lên men Để có nhìn khái quát giai đoạn sinh trưởng, phát triển khả kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn F46 tiến hành nghiên cứu động thái trình lên men chủng Chúng tiến hành nuôi chủng xạ khuẩn F46 50ml môi trường Emerson bổ sung 2% lượng giống, lắc 160 vòng/phút Sau 24h, 48h, 72h, 84h, 96h, 108h, 120h, 132h, 144h, 156h, 168h xác định tiêu sau: + Khả sinh trưởng phương pháp xác định trọng lượng khô tuyệt đối, + Khả kháng nấm Fusarium sp phương pháp khoan lỗ thạch, + Sự thay đổi pH bình lên men Động thái trình lên men chủng xạ khuẩn F46 thể bảng hình 65 Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH STT Bảng Động thái trình lên men chủng xạ khuẩn F46 Thời Hoạt tính kháng nấm Sinh khối (g/l) pH gian Fusarium sp (D-d, cm) 24h 1,6 ± 0,13 1,33± 0,57 5,48± 0,44 48h 72h 1,8 ± 0,17 2,1 ± 0,27 1,87± 0,29 2,13± 0,29 7,40± 0,05 7,49± 0,05 84h 96h 108h 120h 2,5 ± 0,16 2,2 ± 0,17 2,1 ± 0,16 2,0 ± 0,25 2,33± 0,29 2,07± 0,29 2,00± 0,50 1,93± 0,57 7,29± 0,12 7,44± 0,07 7,47± 0,14 7,41± 0,00 10 132h 144h 156h 1,9 ± 0,18 1,9 ± 0,16 1,5 ± 0,13 1,73± 0,29 1,73± 0,29 1,33± 0,57 7,42± 0,27 6,81± 0,55 7,42± 0,03 11 168h 1,2 ± 0,18 1,33± 0,57 7,40± 0,04 Hình Đồ thị động thái trình lên men chủng xạ khuẩn F46 Chúng nhận thấy tốc độ sinh trưởng chủng xạ khuẩn F46 tăng dần sau 24 nuôi cấy sinh khối đạt cực sau 84 giờ, sau sinh khối giảm dần nguồn carbon, nitrogen môi trường cạn kiệt dần Chủng xạ khuẩn thể khả kháng nấm Fusarium sp sau 24 tang mẫu thời gian sau Trong khoảng thời gian từ 72 đến 120 chủng xạ khuẩn thể hoạt tính kháng nấm Fusarium sp mạnh mạnh sau 84 Sau 132 hoạt tính kháng nấm giảm xuống mức trung bình giảm nhanh sau 156 Việc sinh khối khả kháng nấm Fusarium sp đạt giá trị cực đại thời gian thuận lợi cho trình thu sinh khối để trộn vào đất khảo sát khả kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn F46 trồng pH môi trường bắt đầu tăng sau 24 nuôi cấy gần cần khoảng thời gian từ 48 đến 132 pH giảm xuống thời gian 144 tăng trở lại sau 66 Năm học 2012 - 2013 a b Hình Hoạt tính kháng nấm Fusarium sp chủng xạ khuẩn F46 sau 168 (a) sau 84 (b) Kết luận kiến nghị 4.1 Kết luận – Phân lập 55 khuẩn lạc xạ khuẩn khác phân thành nhóm – Trong 55 khuẩn lạc xạ khuẩn phân lập có 11 khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm Fusarium sp chiếm 20% Trong có khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm mạnh, khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm trung bình khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm yếu – Mô tả đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn F46 – Chủng xạ khuẩn F46 kháng nấm Fusarium sp tốt (D-d = 2,2cm > 2cm) môi trường Emerson – Chủng xạ khuẩn F46 sinh trưởng thể khả kháng nấm Fusarium sp cực đại sau 84 4.2 Kiến nghị Định danh đến loài chủng xạ khuẩn F46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Thị Hà (2008), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên, luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Thái Nguyên, tr 3-21 Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng, luận án tiến sĩ, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr 4-38 Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, luận án tiến sĩ, Trường Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội, tr 3-20 67 Kỉ yếu Hội nghị sinh viên NCKH Phạm Nguyễn Đăng Khoa (2006), Sử dụng xạ khuẩn để làm chế phẩm phân giải cellulose, khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 5-8 Nguyễn Ngọc Phương (2006), Xác định số điều kiện hoạt động tối ưu cho chủng xạ khuẩn có khả phân giải lignin cellulose mạt dừa, luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, tr 3-5 Trần Thị Thanh (2007), Công nghệ vi sinh, Nxb Giáo dục, tr 120-137 Nguyễn Thị Thu (2005), Nghiên cứu đặc tính sinh học khả sinh kháng sinh chủng Streptomyces phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam, khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, tr 1-10 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nxb Giáo dục, tr 36-41 Phạm Văn Ty, Vũ Nguyên Thành (2009), Công nghệ Sinh học, tập 5, Công nghệ Vi sinh môi trường, Nxb Giáo dục, tr 105-107 10 Crawford DL, Lynch JM, Whipps JM, Ousley MA (1993), “Isolation and characterization of actinomycete antagonists of a fungal root pathogen”, Applied and Environmental Microbiology, 59 (3), pp.899-905 68