BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ******* KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***** THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức Thành Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LỜI CẢM TẠ Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp, gặp khó khăn định nhờ hướng dẫn giúp đỡ người khóa luận hoàn thành Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, tất quý thầy cô truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt trình học tập trường  TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên hết lòng hướng dẫn giúp đỡ trình thực tập tốt nghiệp  Các anh chị Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản anh chị Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  Ban Giám đốc anh chị công ty Nam Khoa  Các bạn bè thân yêu lớp Công nghệ Sinh học 27 chia sẻ vui buồn trình học tập giúp đỡ thời gian thực tập iii TÓM TẮT NGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)” Thời gian thực từ tháng 03/2005 – 08/2005 Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản (RIA 2) Đề tài thực đối tượng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây bệnh tôm sú (Penaeus monodon) Thí nghiệm bố trí cách trộn chung dịch chiết virus WSSV với hợp chất chiết xuất từ thảo dược nồng độ khác nhau, sau kiểm tra tác dụng hợp chất virus WSSV Sau sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu tác dụng hợp chất lên virus WSSV cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất vào thể tôm thí nghiệm Đánh giá tác dụng hợp chất dựa vào kết Reatime PCR tỷ lệ sống tôm thí nghiệm Kết đạt sau thí nghiệm với hợp chất ký hiệu D2, B, M: Ở nồng độ thử nghiệm 2,5 (mg/ml), (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml): Hợp chất M chưa đủ liều lượng để tác dụng lên lớp vỏ protein virus hiệu tác dụng virus Hợp chất B D2 có tác dụng lên virus WSSV nồng độ 2,5 (mg/ml), (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml) iv MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt vi Mục lục v Danh sách hình viii Danh sách bảng sơ đồ ix PHẤN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích, yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tình hình dịch bệnh tôm giới 2.2 Tình hình nuôi dịch bệnh tôm Việt Nam .4 2.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch tôm sú 2.4 Khái quát bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng tôm sú 2.4.1 Tác nhân gây bệnh 2.4.2 Khu vực phân bố 2.4.3 Ký chủ 2.4.4 Điều kiện phát sinh đường lây truyền 2.4.5 Cơ chế xâm nhập 2.4.6 Bệnh lý 2.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng 10 2.5.1 Một số phương pháp phổ biến 10 2.5.2 Sơ lược phương pháp PCR Realtime PCR 10 2.6 Một số dạng hợp chất thực vật 11 2.6.1 Alkaloid 11 v 2.6.2 Flavonoid 12 2.7 Một số công trình nghiên cứu sử dụng thực vật phòng trị bệnh cho đối tượng thuỷ sản 12 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 3.1 Thời gian địa điểm thực 15 3.2 Vật liệu nghiên cứu 15 3.2.1 Vật liệu sinh học 15 3.2.2 Dụng cụ hoá chất 15 3.2.2.1 Dụng cụ hóa chất phòng thí nghiệm 15 3.2.2.2 Dụng cụ hóa chất phòng thí nghiệm ướt 16 3.3 Phương pháp nghiên cứu 16 3.3.1 Phương pháp ly trích thu dịch chiết virus 16 3.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus tôm 16 3.3.3 Phương pháp thu mẫu 16 3.3.4 Phương pháp PCR 16 3.3.4.1 Phương pháp PCR định tính 16 3.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 17 3.3.5 Phương pháp xác định số yếu tố môi trường 17 3.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 18 3.4.1 Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng 18 3.4.2 Thử nghiệm hợp chất sàng lọc tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus hợp chất vào tôm 19 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng 20 4.1.1 Kết sàng lọc hợp chất D2 20 4.1.2 Kết sàng lọc hợp chất B 21 4.1.3 Kết sàng lọc hợp chất M 23 vi 4.2 Kết thử nghiệm sau tiêm tôm hỗn hợp virus WSSV hợp chất D2, B nồng độ khác 23 4.2.1 Kết thử nghiệm hợp chất D2 27 4.2.2 Kết thử nghiệm hợp chất B 29 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 4.1 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất D2 thời gian 20 Hình 4.2 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất B thời gian 21 Hình 4.3 Kết điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus ủ với hợp chất M thời gian 22 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất D2 trước thí nghiệm 28 H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất D2 sau thí nghiệm 28 H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất B trước thí nghiệm 30 H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR hỗn hợp dịch virus WSSV hợp chất B sau thí nghiệm 30 viii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG .TRANG Bảng 2.1 Tên số quốc gia năm xuất bệnh đốm trắng Bảng 2.2 Đánh giá khả phát bệnh đốm trắng phương pháp khác 10 Bảng 4.1 Các yếu tố môi trường trình thí nghiệm 24 Bảng 4.2 Kết ghi nhận tỷ lệ tôm chết lô trình thí nghiệm 25 Bảng 4.3 Kết Realtime PCR so sánh chu kỳ ngưỡng hàm lượng DNA mẫu hỗn hợp dịch virus hợp chất trước thí nghiệm sau thí nghiệm 26 SƠ ĐỒ .TRANG Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc hợp chất chiết xuất từ thảo dược virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 18 Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả tác dụng virus WSSV thể sống tôm sau ủ hỗn hợp virus thuốc thử nồng độ khác 19 ix PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong thập kỷ qua, nhu cầu sử dụng thực phẩm có nguồn gốc động vật, đặc biệt sản phẩm thủy sản ngày tăng cao Vì thế, sản lượng thủy sản đáp ứng nhu cầu thị trường, nguồn lợi thủy sản ngày giảm khai thác mức Trước tình hình việc phát triển tự phát nghề nuôi trồng thủy sản, đặc biệt bùng phát nghề nuôi tôm biển thực tế khách quan nhu cầu cần thiết Nghề nuôi trồng thủy sản nước ta phát triển mạnh vài thập kỷ gần đây, đặc biệt nghề nuôi tôm tỉnh ven biển Nghề nuôi tôm nước ta phát triển chủ yếu mang tính tự phát, nguồn vốn kỹ thuật nuôi hạn chế Điều dẫn đến suy thoái môi trường nuôi bùng phát lây lan dịch bệnh Khoảng 20 năm gần đây, dịch bệnh tôm xảy khắp nơi gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi tôm Một bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng bệnh đốm trắng ( White Spot Desease ) virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) Thiệt hại lên đến 100 % quần đàn từ - ngày kể từ phát tôm bệnh Có nhiều phương pháp phòng trị bệnh đốm trắng dùng chế phẩm sinh học, hoá chất, thuốc… tồn nhiều mặt hạn chế mức độ thành công chưa cao Việt Nam nước nằm khu vực nhiệt đới gió mùa nên khu hệ thực vật phong phú Thảo dược từ xưa ứng dụng phòng trị bệnh có hiệu y học thú y Tuy nhiên lĩnh vực thuỷ sản chưa ứng dụng rộng rãi Thử nghiệm số hợp chất thảo dược phòng trị bệnh đối tượng nuôi thuỷ sản hướng nghiên cứu cần khai thác Được đồng ý Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường Phòng ngừa Dịch bệnh Thuỷ sản khu vực Nam Bộ (MCE) thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản II (RIA 2) Bộ môn Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh thầy cô hướng dẫn, thực khoá luận tốt nghiệp: “Thử nghiêm số hợp chất chiết xuất từ thảo dược phòng trị bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) tôm sú (Penaeus monodon)”