ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ PHƢỢNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2011 – 2015 Thái Nguyên - 2015 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HOÀNG THỊ PHƢỢNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY SÂM CAU (Curculigo orchioides Gaertn) BẰNG PHƢƠNG PHÁP IN VITRO” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chuyên ngành: Khoa: Khóa học: Giảng viên hƣớng dẫn: Chính quy Công nghệ Sinh học CNSH - CNTP 2011 – 2015 1.PGS.TS Ngô Xuân Bình Bộ Khoa học Công nghệ ThS Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH - CNTP - Trƣờng ĐH Nông lâm Thái Nguyên Thái Nguyên - 2015 i LỜI CẢM ƠN Sau tháng thực tập phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm đến em hoàn thành xong đề tài Để đạt kết ngày hôm em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa thầy cô giáo môn tạo điều kiện giúp đỡ em suốt thời gian qua Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình ThS Nguyễn Thị Tình tận tình bảo, hướng dẫn em suốt thời gian thực đề tài Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đóng góp hướng dẫn quý báu Ks Lã Văn Hiền trình thực hoàn thành khóa luận Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn tới bạn bè người thân động viên, giúp đỡ tạo điều kiện vật chất tinh thần cho em trình học tập nghiên cứu Do thời gian thực đề tài có giới hạn nên đề tài tránh khỏi sai sót Em mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để đề tài em hoàn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày 03 tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực Hoàng Thị Phượng i ii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 3.1: Bảng tên hóa chất dùng thí nghiệm .22 Bảng 3.2: Bảng tên thiết bị dùng thí nghiệm 22 Bảng 4.1: Kết ảnh hưởng BA đến khả tái sinh chồi Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 29 Bảng 4.2: Kết ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) .31 Bảng 4.3: Kết ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 33 Bảng 4.4: Kết ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả nhân nhanh Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 35 Bảng 4.5: Kết ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) .37 Bảng 4.6: Kết ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả rễ Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 39 Bảng 4.7: Kết ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) 40 ii iii DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Hình 2.1 Cây Sâm cau Hình 2.2 Lá Sâm cau Hình 2.3 Hoa Sâm cau Hình 2.4 Quả hạt Sâm cau Hình 2.5: Một số hợp chất có dược liệu Sâm cau [37] Hình 4.1: Ảnh chồi Sâm cau môi trường bổ sung BA hàm lượng khác (sau 30 ngày nuôi cấy) 30 Hình 4.2: Ảnh chồi Sâm cau môi trường bổ sung Kinetin hàm lượng khác (sau 30 ngày nuôi cấy) 32 Hình 4.3: Ảnh chồi Sâm cau môi trường bổ sung BA hàm lượng khác (sau 30 ngày nuôi cấy) 34 Hình 4.4: Ảnh chồi Sâm cau môi trường bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp Kinetin hàm lượng khác (sau 30 ngày nuôi cấy) 36 Hình 4.5: Ảnh chồi Sâm cau môi trường bổ sung BA 1,0 mg/l kết hợp NAA hàm lượng khác (sau 30 ngày nuôi cấy) 38 Hình 4.6: Ảnh rễ Sâm cau môi trường bổ sung IBA hàm lượng khác nhau(sau 30 ngày nuôi cấy) 40 Hình 4.7: Ảnh rễ Sâm cau môi trường bổ sung NAA hàm lượng khác (sau 30 ngày nuôi cấy) 41 iii iv DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT B1 : Thiamin HCl B2 : Nicotinic acid B5 : Gamborg‟s B6 : Pyridocine BA : 6- Benzyladenine Cs : Cộng CT : Công thức CV : Coeficient of Variation (Hệ số biến động) DNA : Deoxyribonucleic Acid Đ/C : Đối chứng GA3 : Gibberellic Acid IBA : β – Indol Butyric Acid LSD : Least Singnificant Diference Test (Sai khác trung bình có ý nghĩa công thức mức độ tin cậy 95%) KIN : Kinetin MS : Murashige & Skoog (1962) NAA : α -Napthalene Acetic Acid TN Thí nghiệm : iv v MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Yêu cầu đề tài 1.4 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài .2 1.4.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn .3 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung Sâm cau 2.1.1 Nguồn gốc 2.1.2 Phân loại 2.1.3 Đặc điểm hình thái học Sâm cau 2.1.4 Giá trị dược liệu Sâm cau 2.1.5 Phương pháp truyền thống nhân giống Sâm cau 10 2.2 Khái niệm sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 2.2.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật 10 2.2.2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô tế bào 12 2.3.1 Vật liệu nuôi cấy .12 2.3.2 Điều kiện nuôi cấy 12 2.3.3 Môi trường dinh dưỡng 13 2.4 Các giai đoạn nuôi cấy mô tế bào thực vật .16 2.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống Sâm cau phương pháp nuôi cấy mô giới Việt Nam 17 2.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 17 2.5.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 19 v vi PHẦN ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Đối tượng, vật liệu phạm vi nghiên cứu 22 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 22 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 22 3.1.3 Hóa chất dụng cụ thí nghiệm .22 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 23 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu .23 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 23 3.3 Nội dung nghiên cứu 23 3.3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng số Cytokinin đến khả tái sinh chồi Sâm cau .23 3.3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau 23 3.3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng số Auxin đến khả rễ Sâm cau 23 3.4 Phương pháp nghiên cứu 24 3.4.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng số Cytokinin đến khả tái sinh chồi Sâm cau 24 3.4.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau 25 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng Auxin đến khả rễ Sâm cau .27 3.5 Các tiêu theo dõi đánh giá 28 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .29 4.1 Kết ảnh hưởng hàm lượng Cytokinin đến khả tái sinh chồi Sâm cau .29 4.1.1 Kết ảnh hưởng BA đến khả tái sinh chồi Sâm cau .29 4.1.2 Kết ảnh hưởng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sâm cau 31 vi vii 4.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau 33 4.2.1 Kết ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau .33 4.2.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau 35 4.2.3 Kết ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau 37 4.3 Kết ảnh hưởng hàm loại Auxin đến khả rễ Sâm cau 39 4.3.1 Kết ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả rễ Sâm cau 39 4.3.2 Kết ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả rễ Sâm cau 39 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.2 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHAO vii PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sâm cau có nhiều tên Ngải cau, Cô nốc lan, Tiên mao, với tên khoa học Curculigo orchioides Gaertn thuộc họ thuộc họ thủy tiên (Amaryllidaceae) [17] Sâm cau loại thân thảo mọc hoang vùng núi rừng Việt Nam, Lào, Malysia, Thái Lan, Philippine, Ấn Độ, Trung Quốc [22], [30], [31] Ở Việt Nam Sâm cau phân bố rải rác tỉnh vùng núi, từ Lai Châu, Tuyên Quang, Cao Bằng đến Tây Nguyên [4] Theo y học cổ truyền Ấn Độ, Sâm cau có tính chất nhầy dịu, tác dụng lợi tiểu, bổ kích dục, sử dụng chữa trĩ, vàng da, hen suyễn, tiêu chảy Theo y học cổ truyền Trung Quốc gọi tên Sâm cau với tên gọi “Xianmao” sử dụng thuốc bổ để điều trị suy giảm thể lực, chữa bệnh hen suyễn, còi, vàng da, tiêu chảy, đau bụng bệnh lậu, kháng viêm, chống ung thư tăng cường chức sinh lý cho nam giới [21], [22], [30], [44] Như nhận thấy rằng, tác dụng S â m c a u tăng cường sức khỏe tinh thần, giảm mệt mỏi, tăng sức lực độ dẻo dai, tăng cường chức sinh lý nam giới, củng cố hệ thống miễn dịch,… Trên thị trường nước cho phép bán chế phẩm có nguồn gốc Sâm cau, chẳng hạn chế phẩm “KAMA SUTRA CAPSULE” hãng Alma Health Care, “STRONG-NITE CAPSULE” hãng Medimix, „POTENCY PLUS” “BRAINCARE” Trung Quốc, “AIPANI KAMON” hãng Vaipani "SHARMIOTONE SYRUP” hãng Sharmila [22] Do giá trị dược liệu lớn Sâm cau bị khai thác tới mức cạn kiệt tự nhiên Do việc tìm kỹ thuật nhân giống cho đối tượng tự nhiên quan trọng Theo tài liệu kỹ thuật nhân giống số loài thuốc quan trọng thương mại, công bố Ấn Độ mô tả, Sâm cau sử dụng nhân giống vô tính phương pháp cắt mầm giâm hom Tuy nhiên, với tìm hiểu chưa có quy trình công bố quy trình nhân giống vô tính Sâm cau 41 Từ bảng 4.7 cho thấy: Khi bổ sung NAA vào môi trường có ảnh hưởng đến khả rễ chồi Sâm cau Cụ thể: CT2 với NAA 0,5 mg/l số rễ tạo thành nhiều 2,23 rễ/cây, chất lượng rễ yếu, nhỏ, ngắn CT3 CT4 hàm lượng NAA 1,0 mg/l 2,0 mg/l số rễ có xu hướng giảm từ 1,97 rễ xuống 1,53 rễ; chất lượng rễ thu từ nhỏ, khỏe, ngắn sang nhỏ, yếu, ngắn CT1(Đ/C) khả hình thành rễ thấp 1,00 rễ/ cây, chất lượng rễ yếu, nhỏ, ngắn Theo nghiên cứu Thomas cs (2007) môi trường 1/2 MS bổ sung hàm lượng NAA từ 1,0 - 5,0 μmol/l hàm lượng 3,0 μmol/l cho tỷ lệ chồi rễ 64% với 1,8 rễ/chồi [56] Shende cs (2012) môi trường MS có bổ sung hàm lượng NAA 0,25 mg/l cho tỷ lệ chồi rễ 60%, số rễ 2,00 rễ, chiều dài rễ 9,68 cm [52] a b c d Hình 4.7: Ảnh rễ Sâm cau môi trƣờng bổ sung NAA hàm lƣợng khác (sau 30 ngày nuôi cấy) ngày nuôi a- NAA 0,0 mg/l số (sau rễ/cây30 1,00 rễ, rễ yếu,cấy) nhỏ, ngắn b- NAA 0,5 mg/l số rễ/cây 2,23 rễ, rễ yếu, nhỏ, ngắn c- NAA 1,0 mg/l số rễ/ 1,97 rễ, rễ khỏe, nhỏ, ngắn d- NAA 2,0 mg/l số rễ/cây 1,53 rễ, rễ yếu, nhỏ, ngắn 41 42 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu đạt rút kết luận sau: - Môi trường MS bổ sung 4.0 mg/l BA thích hợp cho tái sinh chồi Sâm cau, tỷ lệ tái sinh chồi đạt 90% - Môi trường BA 1,0 mg/l + Kinetin 1,0 mg/l thích hợp cho nhân nhanh chồi Sâm cau đạt 4,63 lần, chất lượng chồi thu mập, xanh - Môi trường MS bổ sung IBA thích hợp cho rễ: IBA 1,0 mg/l - Môi trường thích hợp cho nâng cao chất lượng chồi IBA 0,5 mg/l 5.2 Kiến nghị - Để tiếp tục hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro Sâm cau có số kiến nghị sau: + Nghiên cứu ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng khác tới khả tái sinh chồi, nhân nhanh rễ Sâm cau (GA3,TDZ) + Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố khác (khoai tây, cà rốt, nước dừa…) tới trình nuôi cấy nhằm hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro Sâm cau 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu Tiếng Việt Ngô Xuân Bình, Bùi Bảo Hoàn, Nguyễn Thúy Hà (2003), Giáo trình công nghệ sinh học, NXB Nông Nghiệp Hà Nội Nguyễn Tiến Bân Cs (2003), Danh lục loài thực vật Việt Nam, NXB Nông nghiệp, tập II, trang 1067 - 1093 Nguyễn Tiến Bân cs (2007), Sách đỏ Việt Nam, phần II - Thực vật, NXB Khoa học kỹ thuật, trang 82 - 84 Đỗ Huy Bích cs (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, II, NXB Khoa học kỹ thuật Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, II, tập 2, NXB Trẻ, trang 488 – 525 Nguyen Thi Thu Huong, Tran My Tien, Tran Cong Luan, Nguyen Minh Duc (2009): “Androgenic effect of AMA KONG” remedy on castrated mice, Journal of Medicinal Materials, vol 14(2), trang 108-114 Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích, Trần Mỹ Tiên, Trần Công Luận, Phạm Khánh Biền (2008), Nghiên cứu tác dụng dược lý thực nghiệm chế phẩm “Kỷ thược địa hoàng gia vị” theo hướng tăng cường thể trạng chức gan, Tạp chí Y học TP.HCM, tập12, phụ số 4, trang 152 - 158 Trần Thị Lệ, Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Triêu Hà (2008), Giáo trình Công nghệ sinh học thực vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Tập (2001), Áp dụng khung phân hạng IUCN-1994 để đánh giá tình trạng bị đe doạ loài thuốc cần bảo tồn Việt Nam nay, Tạp chí Dược liệu, (2+3), trang 42 - 45 10 Nguyễn Tập (2006), Danh lục đỏ thuốc Việt Nam, Tạp chí Dược liệu,11(3), trang 97 - 105 11 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2005), “giáo trình công nghệ sinh học”, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 12 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng dụng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 44 13 Nguyễn Duy Thuần, Nguyễn Thị Phương Lan (2001), “Bước đầu nghiên cứu sâm cau”, Tạp chí Dược Liệu, 6(6), trang 163-166 14 Trần Mỹ Tiên, Hồ Việt Anh, Lê Minh Triết, Nguyễn Thị Thu Hương, Trần Công Luận (2008), “Ứng dụng kỹ thuật ELISA định lượng testosteron nghiên cứu tác dụng kiểu nội tiết tố sinh dục nam gai chống (Tribulus terrestris L 15 Trần Mỹ Tiên, Nguyễn Thanh Hồng Vân, Trần Công Luận, Nguyễn Thị Thu Hương (2012), “Khảo sát tác dụng hướng sinh dục nam từ dịch chiết cồn rễ Bách bệnh (Eurycoma longifolia Jack.) chuột nhắt trắng”, Y học TP Hồ Chí Minh, tập 16, Phụ số 1, trang 186-191 16 Võ Châu Tuấn, Nguyễn Thị Út, Trần Quang Dần (2011), “Nhân giống in vitro sâm cau (Curculigo orchiodes Gaertn)-Một loài thuốc quý”, Tạp chí Khoa hoc Công nghệ Đại học Đà Nẵng, 6(47), trang 163-169 17 Nguyễn Thị Út, Nguyễn Thị Xuân Tâm, Từ Thị Tú (2010), “Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng đến khả nhân nhanh chồi in vitro Sâm cau (curculigo orchioides gaertn)”, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ Đại học Đà Nẵng, trang 523 - 527 18 Đỗ Năng Vịnh (2007), Công nghệ tế bào thực vật ứng dụng, NXB Nông Nghiệp Hà Nội 19 Vũ Văn Vụ cộng (2008), Công nghệ sinh học tập CNSH tế bào, Nhà xuất Giáo Dục 20 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tân (2009), Sinh lý học thực vật, Nhà xuất Giáo dục II Tài liệu Tiếng Anh 21 Agrawal VS (1997) Drugs plant of India, New Delhi: Kalyani publisher, 306 22 Ajit M (2012) A review on phytochemical and ethnopharmacological activities of Curculigo orchioides, Journal of Pharmaceutical Sciences, 39:(3-4):1-10 23 Anonymous (2000), In plant tissue from Research to commercialization, DBT Ministry of Sciene and Technology (Eds), India, p.33-34 45 24 Augustine AC and Souza LD(1997), “Regeneration of an anticarcinogenic herb, Curculigo orchioides (Gaertn.)”, In Vitro Cellular and Development Biology Plant 33(2), p.111-113 25 Bafna AR, Mistra SH (2006), Immunostimulatory effect of methanol extract of Curculigo orchioides on immunosuppressed mice J Enthnopharmacol, 104(12), p.1-4 26 Bandyopadhyay U, Das D, Banerjee R (1999) Reactive oxygen species: oxidative damage and pathogenesis Curr Sci., 77(5), p.658-665 27 Cao DP, Zheng YN, Qin LP, Han T, Zhang H, Rahman K, Zhang QY (2008) Curculigo orchioides, a traditional Chinese medicinal plant, prevents bone loss in ovariectomized rats Maturitas, 59(4), p.373-380 28 Chauhan NS, Dixit VK (2007), “Antihyperglycemic activity of the ethanolic extract of Curculigo orchioides Gaertn”, Pharmacog Mag, 3(12), p.236-239 29 Chauhan NS, Dixit VK (2008), “Spermatogenic activity of rhizomes of Curculigo orchioides Gaertn in male rats”, International Journal of Applied Research in Natural Products, 1(2), p.26-31 30 Chauhan NS, Sharma V, Thakur M, Dixit VK (2010), “Curculigo orchioides: the black gold with numerous health benefits”, Journal oF Chinese Integratve Medicine, 8(7), p.613-623 31 Dhar ML, Dhar MN, Dhawan BN, Mehrota DN, Ray C (1968), “Screening of Indian Plants for Biological activity part-I”, Indian J Expt Biol, 6, p.232-49 32 Francis SV, Senapati SK and Rout GR (2007), “Rapid clonal propagation of Curculigo orchioides Gaertn An endangered medicinal plant”, In Vitro Cellular and Development Biology Plant, 43(2), p.140-143 33 Garg S.N., Misawa L.N and Reddy M.N (1989), Phytochem, 28, p.1171-72 34 Hazarika BN (2003), Acclimatization of tissue cultured plants, Curr Sci 85, p.1704-1712 35 Jaiswal S, Batra A, Mehta BK (1984), “The antimicrobial efficiency of root oil against human pathogenic bacteria and phytopathogenic fungi”, J Phytopathol 109(1), p.90-93 46 36 Kubo M, Namba K, Nagamoto N, Nagao T, Nakanishi J, Uno H and Nishimura H (1983), Planta Med, 47, p.52-55 37 Lu HW, Zhu BH, Liang YK (2002), “Determination of curculigoside in crude medicine Curculigo orchioides by HPLC”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 27(3), p.192-4 38 Mathew JS, Savithri KE, Skaria BP and Kurien K (2004), “Quality variations in black musli (Curculigo orchioides Gaertn)”, Ancient Science of Life, 26(1), p.45-51 39 Mehta BK, and Gawarikar R (1991), Indian J Chem, 30B: 986-88 40 Misra TN, Singh RS, Tripathi DN and Sharma SC (1990), Phytochem, 29: 929-31 41 Nagesh KS (2008), “High Frequency Multiple Shoot Induction of Curculigo orchioides Gaertn, “Shoot Tip V/S Rhizome Disc Taiwania”, 53(3), p.242-247 42 Nagesh KS and Shanthamma C (2009), “Antibacterial activity of Curculigo orchioides rhizome extract on pathogenic bacteria”, African Journal of Microbiology Research 3(1), p.005-009 43 Nema RK, Dass SS, Mathur M and Ramawat KG (2008), “Morphactin and Cytokinin promotes high frequency bulbil formation from leaf explant of Curculigo orchioides grown in shake flask culture”, Indian journal of Biotechnology, 7, p.520-525 44 Nema RK, Ramawat KG (2010), “Isolation and identification of a new molecule from Curculigo Orchioides (hypoxidaceae)”, J Chem Pharm Res., 2(2), p.610-617 45 Pandit P, Singh A, Bafna AR, Kadam PV, Patil MJ (2008) 70(4), p.440-444 46 Purohit SD, Dave A and Gotam K (1994), “Micropropagation of safed musli (Chlorophytum borivilianum), a rare Indian medicinal herb”, Plant cell tiss Org Cult, 39, p 93-96 47 Rao PVK, Ali N and Reddy MN (1987), Indian J Pharm Sci, 40, p.104-5 48 Rao KS, Mishra SH (1996), “Effect oF rhizomes of Curculigo orchioides Gaerntn on drug induce hepatoxicity”, Indian Drugs, 33(9), p.458-461 49 Shende, C.B., Undal, V.S and Chaudhari, U.S (2012), “In vitro propagation of Curculago orchioides from rhizome bud”, Journal of Agricultural Technology, 8(1), p.353-362 47 50 Singh R, Gupta AK (2008), “Antimicrobial and antitumor activity of the fractionated extracts of Kalimusli (Curculigo orchioides)” Int J Green Pharm, 2, p.34-36 51 Somashekhar & Manju Sharma (2002), Training manual on Propagation techniques of commercially important medicinal plants, Foundation for Revitalisation of Local Health Traditions, Bangalore, 118 pages 52 Soni et al (2012), “golden eye grass - a magical remedy by nature”, IJPSR, Vol 3(8), p.2407-2420 53 Thakur M, Dixit VK (2007), “Effect of some Vajikaran herbs on pendiculation activities and in vitro sperm count in male”, Sex Disabil, 25(4), p.203-207 55 Thakur M, Chauhan NS, Bhargava S, Dixit VK (2009), “A comparative study on aphrodisiac activity of some Ayurvedic herbs in male albino rats”, Arch Sex Behav, 38(6), p.1009-1015 55 The Wealth of India (1950) Raw Materials, C.S.I.R, New Delhi, Vol II , p.400 56 Thomas TD (2007), “Pretreatment in thidiazuron improves the in vitro shoot induction from leaves in Curculigo orchioides Gaertn, an endangered medicinal plant”, Acta Physiologiae Plantarum, 29(5), p.455-461 57 Venukumar MR, Latha MS (2002), “Antioxidant activity of Curculigo orchioides in carbon tetrachlorideinduced hepatopathy in rats”, Indian J Clin Biochem, 17(2), p.80-87 58 Wala BB and Jasrai YT (2003), “Micropropagation of an endangered medicinal plant: Curculigo orchioides Gaertn”, Plant Tissue Culture 13(1), p.13-19 59 Xu JP and Dong QY (1987), Zhongcaoyao, 18, p.194-195 60 Xu JP and Xu RS (1991), Chin Chem Lett, 2, p 227 61 Xu JP and Xu RS (1992), Phytochem, 31, p.2455-58 62 Xu JP, Xu RS and Li XY (1992a), Phytochemistry, 3, p.1233-36 48 PHỤ LỤC 1: MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY Table 1: Preparation of modified Murashige and Skoog‟s (MS medium) Amount to Bottle Component Stock take Solution (g/l preparation (ml) I II III NH4NO3 V 20 concentratic (mg/l) 1.650,0 KNO3 95 MgSO4.7H2O 37 MnSO4.4H2O 2,23 ZnSO4.7H2O 1,058 CuSO4.5H2O 0,0025 0,025 CaCl2.2H2O 44 440,0 1.900,0 370,0 10 10,6 0,083 CoCl2.6H2O 0,0025 0,025 17 170,0 H3BO4 0,62 Na2MoO4.2H2O 0,025 FeSO4.7H2O 2,784 Na2EDTA.2H2O 3,724 10 22,3 KI KH2PO4 IV 82,5 Final 10 0,83 6,2 0,25 10 27,85 37,25 mg/100ml Vitamin Nicotinic acid 100 0,5 0,5 Glycine 100 2,0 2,0 Thiamine acid 100 0,1 0,1 Pyridocine HCl 100 0,5 0,5 Sucrose 20.0000,0 Agar 5.000,0 pH 5,6-5,8 49 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XỬ LÝ SỐ LIỆU Thí nghiệm 1: Kết ảnh hƣởng BA đến khả tái sinh chồi Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE PHUONG 25/ 5/** 13: PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả tái sinh chồi Sâm cau ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT$ -VARIATE TREATMENT MS - DF TLTS 943.33 RESIDUAL MS - DF 20.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS F-RATIO F-PROB FILE PHUONG 10 47.17 0.000 25/ 5/** 13: PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả tái sinh chồi Sâm cau MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS TLTS 46.6667 63.3333 3 70.0000 86.6667 90.0000 SE(N= 3) 2.58199 5%LSD 10DF 8.13595 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PHUONG 25/ 5/** 13: PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả tái sinh chồi Sâm cau F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLTS GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 15) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 16.847 4.4721 15 71.333 C OF V |CT$ % | | | | | | 6.3 0.0000 50 Thí nghiệm 2: Kết ảnh hƣởng Kinetin đến khả tái sinh Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLTS FILE IRRISTAT 19/ 5/** 1:55 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng kinetin đến khả tái sinh chồi Sâm cau VARIATE V003 TLTS LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN SQUARES SQUARES F RATIO PROB ER LN ============================================================================= CT$ 343.333 10 200.000 20.0000 * RESIDUAL 1373.33 17.17 0.000 * TOTAL (CORRECTED) 14 1573.33 112.381 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IRRISTAT 19/ 5/** 1:55 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sâm cau MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS TLTS 46.6667 73.3333 3 63.3333 60.0000 50.0000 SE(N= 3) 2.58199 5%LSD 10DF 8.13594 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IRRISTAT 19/ 5/** 1:55 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng Kinetin đến khả tái sinh chồi Sâm cau F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLTS GRAND MEAN STANDARD (N= SD/MEAN | 15) DEVIATION NO BASED ON BASED ON OBS TOTAL SS RESID SS 10.601 4.4721 15 58.667 C OF V |CT$ % | | | | | | 7.6 0.0002 51 Thí nghiệm 3: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng BA đến khả nhân nhanh Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE PHUONG 31/ 5/** 9:32 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 4.01733 1.00433 125.54 0.000 * RESIDUAL 10 800003E-01 800003E-02 * TOTAL (CORRECTED) 14 4.09733 292667 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE PHUONG 31/ 5/** 9:32 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 HSN 1.03333 2.63333 2.00000 1.90000 1.66667 SE(N= 3) 0.516399E-01 5%LSD 10DF 0.162719 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE PHUONG 31/ 5/** 9:32 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSN GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 1.8467 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.54099 0.89443E-01 4.8 0.0000 | | | | 52 Thí nghiệm 4: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng BA kết hợp Kinetin đến khả nhân nhanh Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:45 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp kinetin đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 6.82400 1.70600 88.24 0.000 * RESIDUAL 10 193334 193334E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 7.01733 501238 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:45 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp kinetin đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 HSN 2.63333 3.50000 4.63333 3.47000 3.00000 SE(N= 3) 0.802774E-01 5%LSD 10DF 0.252957 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:45 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp Kinetin đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSN GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 3.4533 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.70798 0.13904 4.1 0.0000 | | | | 53 Thí nghiệm 5: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng BA kết hợp NAA đến khả nhân nhanh Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:55 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 5.10933 1.27733 91.24 0.000 * RESIDUAL 10 140000 140000E-01 * TOTAL (CORRECTED) 14 5.24933 374952 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:55 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 HSN 2.63333 3.00000 2.83333 2.70000 1.36667 SE(N= 3) 0.683130E-01 5%LSD 10DF 0.215257 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:55 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng BA kết hợp NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE HSN GRAND MEAN (N= 15) NO OBS 15 2.5067 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.61233 0.11832 4.7 0.0000 | | | | 54 Thí nghiệm 6: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng IBA đến khả rễ Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:10 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau VARIATE V003 SRTB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 8.80917 2.93639 195.76 0.000 * RESIDUAL 120001 150001E-01 * TOTAL (CORRECTED) 11 8.92917 811742 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:10 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 SRTB 1.00000 2.83333 3.26667 2.13333 SE(N= 3) 0.707110E-01 5%LSD 8DF 0.230581 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE IRRISTAT 19/ 5/** 0:10 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng IBA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SRTB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 2.3083 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.90097 0.12248 5.3 0.0000 | | | | 55 Thí nghiệm 7: Kết ảnh hƣởng hàm lƣợng NAA đến khả rễ Sâm cau (sau 30 ngày nuôi cấy) BALANCED ANOVA FOR VARIATE SRTB FILE ABC 25/ 5/** 12:59 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau VARIATE V003 SRTB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 2.61667 872222 116.30 0.000 * RESIDUAL 600001E-01 750001E-02 * TOTAL (CORRECTED) 11 2.67667 243333 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE ABC 25/ 5/** 12:59 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS 3 3 SRTB 1.00000 2.23333 1.96667 1.53333 SE(N= 3) 0.500000E-01 5%LSD 8DF 0.163045 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE ABC 25/ 5/** 12:59 PAGE Ảnh hưởng hàm lượng NAA đến khả nhân nhanh chồi Sâm cau F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE SRTB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 1.6833 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.49329 0.86603E-01 5.1 0.0000 | | | | 56