ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN HỮU THUẦN ANH NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ELICITOR LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY SOLASODINE Ở TẾ BÀO IN VITRO CỦA CÂY CÀ GAI LEO (Solanum hainanense Hance) LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH LÝ HỌC THỰC VẬT HUẾ - 2016 Công trình hoàn thành tại: Khoa Sinh học, Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên-Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huê (2011-2014) Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Hoàng Lộc PGS.TS Cao Đăng Nguyên Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng chấm luận án cấp Đại học Huế họp tại: Vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trường đại học Khoa học, Đại học Huế MỞ ĐẦU T n cấp t iết c a đề t i Theo số liệu thống kê ngành Y tế, năm Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 loại dược liệu khác để sử dụng y học cổ truyền làm nguyên liệu cho công nghiệp dược xuất Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) có tên khoa học khác Solanum procumben Lour thuộc họ Cà (Solanaceae) Trong thành phần h a học cà gai leo, solasodine hợp chất ch nh, c hoạt t nh kháng vi m ảo vệ gan, chống ại tế ung thư Ngoài solasodine nghiên cứu cho thấy có nhiều tác dụng y dược Tuy nhiên, từ trước đến cà gai eo khai thác chủ yếu từ nguồn hoang dại, nguồn nguyên liệu không đủ để đáp ứng cho việc nghiên cứu điều trị Nuôi cấy mô tế bào thực vật phương pháp có ưu điểm vượt trội mở tiềm ớn để tăng thu sinh khối thời gian ngắn, hàm ượng hợp chất thứ cấp cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất tạo nguồn nguyên liệu phục vụ việc tách chiết hoạt chất sinh học quy mô công nghiệp, góp phần giải kh khăn n i tr n Elicitor thực vật báo hiệu việc hình thành hợp chất thứ cấp, bổ sung vào môi trường nuôi cấy phương thức để thu sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cách hiệu nhất, vừa rút ngắn thời gian lại đạt suất cao uất phát từ đ , tiến hành đề tài: Nghiên cứu ảnh ưởng c a số elicitor lên khả t c lũy solasodine tế bào in vitro c a cà gai leo (Solanum hainanense Hance) p dụng phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù tạo nguồn nguyên liệu cho việc tách chiết solasodine, cung cấp nguồn dược chất tự nhiên cho nghiên cứu ĩnh vực y học Các kết đề tài àm sở cho việc xây dựng qui trình sản xuất solasodine từ sinh khối tế để ứng dụng ĩnh vực dược phẩm sau M c tiêu c a đề t i Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ nuôi cấy in vitro tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) ng a oa ọc v t c tiễn : Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị khả t ch ũy solasodine tế bào cà gai leo nuôi cấy có bổ sung elicitor Đồng thời luận án tài iệu tham khảo hữu ích cho nghiên cứu giảng dạy ĩnh vực sản xuất hoạt chất sinh học đường nuôi cấy tế bào thực vật : Đề tài hướng nghiên cứu có tiềm ứng dụng ĩnh vực sản xuất hoạt chất sinh học dùng àm dược liệu nuôi cấy tế bào thực vật, góp phần vào việc bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng N ng đ ng g p i c a lu n n Đây công trình Việt Nam nghiên cứu ảnh hưởng số elicitor lên khả sinh tổng hợp solasodine nuôi cấy tế bào cà gai leo Kết luận án đáng tin cậy sử dụng để tiếp tục nghiên cứu phát triển sản xuất solasodine quy mô lớn P vi ng iên cứu Các thí nghiệm tiến hành điều kiện in vitro Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguy n, Môi trường Công nghệ sinh học, Đại học Huế từ tháng 11 năm 2011 đến tháng 11 năm 2014 C ương T NG QUAN T I LIỆU 1.1 SẢN TẾ UẤT C C H P CHẤT THỨ CẤP TỪ NU I CẤY O THỰC VẬT Nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm cải thiện hợp chất có giá trị y dược, gia vị, hương iệu màu nhuộm mà sản xuất chúng từ tế bào vi sinh vật tổng hợp phương pháp h a học Ưu điểm kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết tỷ lệ lớn ượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy Các sản phẩm trao đổi thứ cấp thường chiếm ượng nhỏ (nhỏ 1% trọng ượng khô) độc lập cao thời kỳ sinh lý phát triển thực vật Mặc dù hợp chất thứ cấp dường không thừa nhận vai trò việc trì trình sống ản thực vật - nơi mà chúng tổng hợp, chúng có vai trò quan trọng tương tác thực vật với môi trường ỨNG D NG CHẤT KÍCH KH NG ĐỂ CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TÍCH LŨY H P CHẤT THỨ CẤP TRONG NU I CẤY TẾ O THỰC VẬT Elicitor thực vật định nghĩa chất mà đưa với nồng độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống khởi động cải thiện sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp Sự cảm ứng thực vật trình cảm ứng tăng cường sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp bổ sung theo hàm ượng elicitor Elicitor bao gồm chất có nguồn gốc từ mầm bệnh chất tiết từ thực vật phản ứng mầm bệnh (elicitor nội sinh) Tr n sở chất tự nhiên, elicitor phân thành nhóm là: elicitor phi sinh học elicitor sinh học Tại Việt Nam, việc sử dụng elicitor nghiên cứu cải thiện khả t ch ũy hợp chất thứ cấp nuôi cấy tế bào quan tâm thời gian gần Trên giới có nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng elicitor lên sinh trưởng khả t ch ũy hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật Hầu hết nghiên cứu cho thấy hàm ượng hợp chất thứ cấp tăng n ổ sung elicitor C Y C GAI LEO Cây cà gai leo (Solanum hainanense Hance) thuộc họ Cà (Solanaceae), có tên khoa học khác Solanum procumbens, mọc rải rác ven rừng, lùm bụi, bãi hoang, ven đường, độ cao 300 m Cà gai leo thuốc quý, rễ dân gian dùng làm thuốc chữa thấp khớp, ho, dị ứng, đau nhức xương, đau răng, trị rắn cắn, đau ưng, cảm cúm… Gần đây, nhiều tác dụng khác cà gai leo phát như: kháng vi m, ức chế xơ gan giai đoạn kịch phát, giảm nhẹ khối u Solasodine loại steroid alkaloid có họ Cà, thay cho diosgenin để tổng hợp thương mại loại hormon steroid khác Solasodine báo cáo chống ung thư, ức chế độc hại nhiều loài sinh vật Solasodine alkaloid ức chế acetylcholinsterase - enzyme quan trọng việc truyền xung động thần kinh Gần đây, so asodine biết tác nhân hóa trị liệu cho điều trị ung thư đặc biệt ung thư da C ương ĐỐI TƯ NG, NỘI DUNG V PHƯ NG PH P NGHI N CỨU ĐỐI TƯ NG NGHI N CỨU Tế bào cà gai leo (Solanum hainanense Hance) nuôi cấy in vitro NỘI DUNG NGHI N CỨU - ác định khả sinh trưởng t ch ũy so asodine tế bào cà gai leo - Nghiên cứu ảnh hưởng số elicitor đến khả sinh trưởng t ch ũy so asodine tế bào cà gai leo: + Nồng độ elicitor: MeJA (25-250 µM, 1-5 g/L YE, 50-250 µM SA) + Thời gian nuôi cấy: tuần + Thời điểm cảm ứng: 7-21 ngày - Khảo sát sơ ộ hoạt tính sinh học dịch chiết solasodine n khả ức chế co agenase - Xây dựng quy trình sản xuất solasodine hiệu suất cao từ tế bào in vitro cà gai leo PHƯ NG PH P NGHI N CỨU P ương p p nuôi cấy ô v tế ot cv t 2.3.1.1 Nuôi cấy in vitro 2.3.1.2 ấ 2.3.1.3 ấ 2.3.1.4 Xử lý cảm ứng t bào Bổ sung methyl jasmonate (25-250 µM), dịch chiết nấm men (1-5 g/L), salicylic acid (50-250 µM) dạng riêng rẽ phối hợp nồng độ tối ưu chúng vào môi trường nuôi cấy tế bào với thời điểm cảm ứng từ đến 21 ngày sau nuôi cấy Xá định sinh khối t bào P ương p p a sin 2.3.2.1 Chi t Soxhlet 2.3.2.2 Sắc ký lỏng hiệ 2323 ă g cao ức ch collagenase solasodine l số liệu T t t sơ đồ t ng iệ Cây cà gai leo in vitro Nuôi cấy callus Nhân callus Nuôi cấy tế ý elicitor khác Thăm dò nồng độ elicitor Thăm dò thời điểm ổ sung elicitor Thu sinh khối tế Tách chiết so asodine Định ượng Thử nghiệm hoạt t nh sinh học C ương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SINH TRƯỞNG V TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO 1.1 Sin trưởng c a tế bào Hình 3.1 Đường cong sinh trưởng tế bào cà gai leo T c lũy solasodine c a tế bào Hình 3.2 Đường cong t ch ũy so asodine tế bào cà gai leo 3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA ELICITOR L N SINH TRƯỞNG VÀ TÍCH LŨY SOLASODINE CỦA TẾ BÀO CÀ GAI LEO 3.2.1 Ản 3.2.1.1 Nồ ưởng c a methyl jasmonate độ methyl jasmonate Bảng 3.1 Ảnh hưởng MeJA n sinh trưởng tế bào cà gai leo K ối lượng tế o (g) Nồng độ MeJA GI (µM) Tươi Khô 25 3,89b 0,37b 1,30 d bc 50 3,38 0,35 1,13 100 3,57c 0,34c 1,19 150 2,96e 0,36bc 0,99 f bc 200 2,40 0,34 0,80 250 2,29g 0,35bc 0,76 a a ĐC 4,98 0,45 1,66 ĐC: Tế bào không xử lý elicitor Các chữ khác cột sai khác có ý nghĩa thống kê trung bình mẫu p < 0,05 (Duncan's test) Chú thích dùng chung cho tất bảng Dịch chiết tế bào tuần tuổi phân t ch HPLC để khảo sát ảnh hưởng nồng độ MeJA (25-250 µM) n t ch ũy solasodine Bảng 3.2 Ảnh hưởng MeJA lên khả t ch ũy so asodine tế bào cà gai leo Nồng độ MeJA (µM) 25 50 100 150 200 250 ĐC1 ĐC2 Solasodine (mg/g) 127,5c 159,0a 138,0b 98,0e 38,0f 36,5f 123,5d 23,5g ĐC1: Tế bào không xử lý elicitor, ĐC2: rễ tự nhiên năm tuổi 3.2.1.2 Thời gian nuôi cấy Table 3.3 Effect of elicitation day of MeJA (50 µM) on the growth of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Cell weight (g) Fresh Dry 3,39b 0,31b 3,43b 0,33ab a 3,71 0,34a 3,38b 0,35a GI 0,88 0,84 0,99 1,13 Control: Adding MeJA 50 µM to medium at the beginning of cell culture Table 3.4 Effect of elicitation day of MeJA (50 µM) on solasodine production of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Solasodine (mg/g) 108,5b 79,5c 74,5d 159,0a Control: Adding MeJA 50 µM to medium at the beginning of cell culture 3.2.2 Effect of yeast extract 3.2.2.1 Yeast extract concentration Table 3.5 Effect of YE concentration on the growth of S.hainanense cells Cell weight (g) YE GI (g/L) Fresh Dry 9,30a 0,54a 3,10 b 9,20 0,53a 3,07 c b 8,80 0,48 2,93 8,08d 0,43c 2,69 7,94e 0,41c 2,65 f bc Control 4,98 0,45 1,66 Control: Non-elicited cells 10 Table 3.6 Effect of YE concentration on solasodine production of S.hainanense YE (g/L) Control1 Control2 Solasodine (mg/g) 125,5d 165,0c 220,5a 198,0b 112,0e 123,5d 23,5f Control1: Non-elicited cells; Control2: in planta 1-year-old root 3.2.2.2 Couture time duration From the survey on content, g/L YE is selected to add in medium when started cuturing and survey the moment of maximum solasodine of ssh in seven-week time Both cell living mass as well as solasodine content increase gradually from 1st week and maximized in 4th week Table 3.8 Cell biomass production of S.hainanense cells in a batch culture added g/L YE at the beginning of culture 11 Table 3.9 Dymamic of solasodine accumulation of S.hainanense cells elicited by 3g/L YE 3.2.2.3 Elicitation time Table 3.7 Effect of elicitation day of YE (3 g/L) on the growth of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Cell weight (g) Fresh Dry a 8,79 0,45a a 8,41 0,36b b 5,66 0,35b 8,80a 0,48a GI 2,93 2,80 1,89 2,93 Control: g/L YE add to medium at the beginning of cell culture Table 3.8 Effect of elicitation day of YE (3 g/L) on solasodine production of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Solasodine (mg/g) 110,5b 96,0c 92,0d 220,5a Control: g/L YE add to medium at the beginning of cell culture 12 3.2.3 Effect of salicylic acid (SA) 3.2.3.1 Salicylic acid concentration SA at various concentrations (50 µM ~ 250 µM) is added into medium at the beginning of culture to study the growth capability of S.hainanense after weeks Table 3.9 Effect of SA concentration on the growth of S.hainanense cells Cell weight (g) SA (µM) GI Fresh Dry 50 12,03a 0,81a 4,01 b ab 100 8,05 0,68 2,68 150 7,61bc 0,64ab 2,54 200 5,99bc 0,53bc 2,00 250 5,21c 0,51c 1,74 c c Control 4,98 0,45 1,66 Control: Non-elicited cells Table 3.10 Effect of SA concentration on solasodine production of S.hainanense SA (µM/L) 50 100 150 200 250 Control1 Control2 Content (mg/g) 133,5d 186,5b 245,0a 162,0c 51,0f 123,5e 23,5g Control1: Non-elicited cells; Control2: in planta 1-year-old root In general, SA effects on solasodine synthesis in S.hainanense more clearly than MeJA and YE In the medium of adding 150 µM SA, solasodine amount in cell is maximum (245 mg/g dry weight), approximate 1.5 times higher than when processed with 50 μM MeJA and approximate 1.1 times when processed with g/L YE 13 3.2.3.2 Culture duration Table 3.11 Cell biomass production of S.hainanense cells in a batch culture added 150 µM SA at the beginning of culture Table 3.12 Dymamic of solasodine accumulation of S.hainanense cells elicited by 150 µM SA 3.2.3.3 Elicitation time Table 3.11 Effect of elicitation day of SA (150 µM) on the growth of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Cell weight (g) Fresh Dry 8,12c 0,68b 8,90b 0,69b a 9,13 0,74a 7,61d 0,68b GI 2,71 2,97 3,04 2,54 Control: 150 μM SA add to medium at the beginning of cell culture 14 Table 3.12 Effect of elicitation day of SA (150 µM) on solasodine production of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Solasodine (mg/g) 117,0b 101,5c 82,5d 245,0a Control: 150 μM SA add to medium at the beginning of cell culture 3.2.4 Consolidated effect of elicitors 3.2.4.1 Concentration of elicitors 3.2.4.1.1 Combining two elicitors We select the most proper concentration of an elicitor and combine with different contents of the other elicitor to study their combining effects on solasodine growth and accumulation of S.hainanense Here is the detail: combine 50 µM MeJA with (1-5 g/L) YE or (50-250 µM) SA; combine g/L YE with (25-250 µM) MeJA or (50-250 µM) SA; combine 150 µM SA with (25-250 µM) MeJA or (1-5 g/L) YE All elicitors are added to medium at the beginning of cell culture Table 3.13 Effect by combining each pair of elicitor on solasodine growth and accumulation of S.hainanense Elicitor Cell weight(g) SA MeJA YE Fresh Dry (µM) (µM) (g/L) 50 4,56f 0,43e d 50 50 5,17 0,42f c 150 25 5,37 0,49b a 150 7,74 0,47c b 25 5,91 0,55a 4,98e 0,45d Control Control: Non-elicited cells 15 GI Solasodine (mg/g) 1,52 1,72 1,79 2,58 1,97 1,66 186,0b 165,5e 173,0c 197,5a 170,5d 123,5f 3.2.4.1.2 Combining three elicitors Table 3.14 Effect by combining three elicitors on solasodine growth and accumulation of S.hainanense Elicitor Cell weight (g) SA MeJA YE Fresh Dry (µM) (µM) (g/L) b 150 50 4,82 0,31c c 150 150 4,24 0,32c d 100 50 4,05 0,39b a ĐC 4,98 0,45a GI Solasodine (mg/g) 1,61 1,41 1,35 1,66 153,0c 160,0b 180,5a 123,5b 3.2.4.2 Culturing time Picture 3.15 Cell biomass production of S.hainanense cells in a batch culture added 150 µM SA and g/L YE at the beginning of culture Picture 3.16 Dymamic of solasodine accumulation of S.hainanense cells elicited by 150 µM SA and g/L YE 16 3.2.4.3 Elicitation time Table 3.15 Effect of elicitation day of SA (150 µM) and YE (3 g/L) on the growth of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Cell weight (g) Fresh 6,62b 5,35cd 5,13d 7,74a Dry 0,45ab 0,39b 0,32c 0,47a GI 2,21 1,78 1,71 2,58 Control: 150 μM SA and g/L YE add to medium at the beginning of cell culture Table 3.16 Effect of elicitation day of SA (150 µM) and YE (3 g/L) on solasodine production of S.hainanense cells Elicitation day 14 21 Control Solasodine (mg/g) 11,8b 51,0c 46,0d 197,5a Control: 150 μM SA and g/L YE add to medium at the beginning of cell culture 3.3 Determination of solasodine acitivity Table 3.17 Solasodine activity analysis Length of gel Length of gel column (mm) column (mm) Test before after after treatment treatment Height of gel column when dismissed (mm) Solasodine of cell 119 ± 2,1 104,0 ± 1,5 15,0 ± 0,6 Control 118 ± 1,8 50,3 ± 1,2 67,7 ± 1,6 Control: collagenase solution 0.1 mg/mL 17 3.4 High efficient solasodine process from in vitro cell of Solanum hainanense Hance Natural S.hainanense Sterialization: - Ethanol 70% in minute - HgCl2 0,1% in minute - Wash by sterile pure water: times Create in vitro from body part which has leaf-stem in S0 medium In vitro S.hainanense Create callus from body part, root part, and leaf stem of in vitro in S1 medium Enhancement callus Multiply callus in S2 medium Multiply callus Raise g callus in 50 mL S2 medium (no agar) shaking speed 120 round/minute Raise 20 mL cellular liquid in 50 mL S3 medium, shaking speed 150 round/minute Raise suspension cells Add 150 µM salicylic acid into S3 medium when start cell culturing, shaking speed 150 round/minute, weeks Increase solasodine generation Extract solasodine from cell using Soxhlet method Quantify extracted solasodine liquid by HPLC 10 Determination of solasodine activity on collagen gel column Extracted solasodine liquid 18 Chapter DISCUSSION 4.1 EFFECT OF METHYL JASMONATE 4.1.1 Effect of methyl jasmonate concentration Normally, adding elicitor into culturing medium restricts growth capability of cells, this results have been declare in many of previous scientific publication In our study, in MeJA medium, growth of S hainanense is less than the counting experiment which does not have elicitor, the higher elicitor concentration, the less growth of cell This result fits with other previous study on restriction of elicitor on growth of botanical cells Elicitor concentration takes important role in induction process, the accumulation of secondary synthesis will be at proper elicitor concentration High concentration of resistance element causes overthreshold response, and cells dead In our study, solasodine accumulation is maximized when it is processed with MeJA concentration of 50 µM (159 mg/g, 1.3 times of counter cells which we did not add MeJA) 4.1.2 Effect of elicitation time The time to process elicitor is a crucial factor which effects growth and accumulation of secondary synthesis of botanical cells Our study shows that all solasodine growth and accumulation of cells at different elicitor processing time decrease in comparison with those at the beginning of culture process Our research output is similar to that of Chong et cs (2005) study on effect of different 19 elicitors and time to add elicitor into Morinda elliptica culturing cell sample 4.2 EFFECT OF EXTRACTED YEAST EXTRACT 4.2.1 Effect of concerntration of yeast extract Unlike when being processed by MeJA, when adding YE into culturing medium, we collect fresh and dry living mass more than counter element that we not add elicitor Some study mentions that when adding YE into culturing medium, YE works as nitrogen source and under pressure, this nutrition can take an important role in growing and stimulating botanical cells to increase secondary synthesis generation Our result shows that both solasodine living mass and content of S hainanense increase at suitable concerntration (2-4 g/L) Our output is closest to the study of Jain et cs (2015) on the different family named S melongena 4.2.2 Effect of elicitation time With S hainanense, the longer elicitor processing time, the more stimulation to cellular living mass to grow When adding YE at starting culture or after seventh day, cells have similar growth capability, at induction moment is 14 days, the cell growth indicator starts decreasing and reach maximum decrease on 21st day The results of Jain et cs (2015) using S melongena also shows the induction time on 28th day is best for living mass development and solasodine content that is similar to result of our research Analyzing accumulated solasodine content using S hainanense shows that the best induction time is the start culturing time as with MeJA (solasodine achieves 220.5 mg/g dry weight) 20 4.3 EFFECT OF SALICYLIC ACID 4.3.1 Effect of salicylic acid concerntration In our research, SA of concentration from 50µM to 100µM has clear stimulating effect on cell living mass in comparison with counter SA; similar to YE and opposite to MeJA In present, there are not many researches report this syndrome except research on S hainanense Using S hainanense, the research of Jain et al (2015) shows that by adding 50 µM SA in planting baby roots of S melongena, collecting living mass higher than counter part 1.5 times after 28 days (5.16g and $3.39) Meanwhile, solasodine content is higher than counter part about 13.5 times (89.03 nano µg/g - 6,5 µg/g) The result of solasodine content analysis in S hainanense cell shows that the accumulation gradually increases when adding SA from 50 μM to 150 μM, then decreases dramatically when SA is from 200 μM to 250 μM In general, SA effects on the capability of solasodine synthesis in S hainanense cell more visible than MeJA YE 4.3.2 Effect of elicitation time Similar to MeJA processing, the longer time process with SA, the more effect on growth of S hainanense cells Short induction time (7 days) has less effect on the cell growth Counter cell has longest induction time, then the living mass is only 7.61g fresh and 0.68g dry weight The effect of SA processing time on solasodine synthesis is similar to MeJA and YE, the longer processing time, the more capability to accumulate solasodine The survey result show that processing 150 μM SA from to 21 days after culturing is not 21 enough induction time for cell to produce high solasodine level SA process right at beginning of culture time show best consequence, higher than other cases from to times 4.4 EFFECT OF COMBINING ELICITORS In general, processing of combining elicitors at different content in this research increases solasodine accumulation in S hainanense in comparison with counter sample The best combination formula returns solasodine level 1.6 times higher than unprocessed cells and 8.4 times comparing to one-year old natural roots However, processing with combination only returns higher than processing with 50 μM MeJA, and lower than separate processing with g/L YE or 150 μM SA Similar to separately processing of MeJA, YE and SA, the processing of elicitor combination also shows that the most proper time to add elicitor is the moment of starting culture, or long induction time (4 weeks) and this is most effective Cell growth and solasodine content are both higher than other induction periods (from to 21 days after culturing) equivalent to period from 21 to days Comparing to study results on cells of most of other botanical species, S hainanense cells need longer induction time 4.5 COMPARING EFFICIENCY OF AMONG ELICITORS In this study, all three elicitors increase the solasodine biosynthesis in S hainanense cells, in which SA has first role, second is YE and last is MeJA The effect of these elements on living mass is similar SA is cheap non-biological elicitor, easy to use then become popular to many authors; many outputs also show SA is most efficient among stimulator systhesis of HCTC in botany 22 CONCLUSION AND PROPOSAL CONCLUSION: SOLASODINE growth and accumulation in suspension S hainanense cell gets highest after weeks, fresh weight is 4.98 g/jar, dried living mass is 0.45 g/jar, solasodine content is 123.5 mg/g dry weight, higher than in natural root 5.3 times Effect of elicitors on solasodine accumulation capabilit in vitro cell of S hainanense 2.1 Solasodine content accumulation is highest when process S hainanense at 150 µM salicylic acid at culture time (245 mg/g dry weight) 2.2 When adding separate or combined elicitors, solasodine increase gradually from second to third week, maximum in week and then gradually reduced from 5th to seventh week Solasodine from suspension cells has inflamation resistance, showing by their collagenase limitation Propose a high efficient solasodine producing process from in vitro cell culture of S hainanense with processing 150 µM salicylic acid from natural sources PROPOSAL Study to improve solasodine production of S hainanense in biocreator system Study the influence scheme transformation in S hainanense 23 of elicitor on solasodine REFERENCE Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Le Thi Minh Khuyen, Ton Nu Thuy An (2014) Effects of yeast extract and methyl jasmonate on the enhancement of solasodine biosynthesis in cell cultures of Solasodine hainanense Hance J BioSci Biotech 2014, 3(1): 1-6 Nguyễn Hữu Thuần Anh, Tôn Nữ Thùy An, Lê Thị Hà Thanh, Võ Thị Viên Dung, Nguyễn Thuần Nho, Đinh Hồng Kim Cương, Nguyễn Ngọc Hiếu, Nguyễn Thanh Giang, Nguyễn Hoàng Lộc (2015) Nghiên cứu ảnh hưởng methyl jasmonate dịch chiết nấm men lên sinh trưởng tích lũy solasodine tế bào cà gai leo (Solasodine hainanense Hance) Tạp chí Công nghệ sinh học 13(2A): 1-7 Nguyen Huu Thuan Anh, Ton Nu Thuy An, Nguyen Thuan Nho, Vo Thi Vien Dung, Nguyen Hoang Loc (2015) Effect of salicylic acid on the biosynthesis of solasodine in cell suspension culture of Solanum hainanense Hance Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology 17(1-2): 14-20 24 [...]... sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM MeJA Hình 3.6 Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 50 µM MeJA 3.2.1.3 Thờ đ ểm cảm ứng Dựa vào kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ MeJA lên khả năng t ch ũy so asodine trong tế bào cà gai leo, 50 µM MeJA được chọn để khảo sát thời điểm cảm ứng trong nuôi cấy tế bào Bảng 3.3 Ảnh hưởng của thời điểm xử ý MeJA 50 µM 9 n sinh... sinh trưởng của tế bào cà gai leo sau 4 tuần Bảng 3.9 Ảnh hưởng của SA n sinh trưởng của tế bào cà gai leo Nồng độ SA (µM) 50 100 150 200 250 ĐC K ối lượng tế Tươi 12,03a 8,05b 7,61bc 5,99bc 5,21c 4,98c o (g) Khô 0,81a 0,68ab 0,64ab 0,53bc 0,51c 0,45c GI 4,01 2,68 2,54 2,00 1,74 1,66 ĐC: Tế bào không xử lý elicitor Bảng 3.10 Ảnh hưởng của SA lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo Nồng độ... Nồ ưởng c a dịch chiết nấm men độ dịch chi t nấm men Bảng 3.5 Ảnh hưởng của YE lên sinh trưởng của tế bào cà gai leo K ối lượng tế o (g) Nồng độ YE GI (g/L) Tươi Khô 1 9,30a 0,54a 3,10 b 2 9,20 0,53a 3,07 3 8,80c 0,48b 2,93 d c 4 8,08 0,43 2,69 5 7,94e 0,41c 2,65 ĐC 4,98f 0,45bc ĐC: Tế bào không xử lý elicitor 10 1,66 Bảng 3.6 Ảnh hưởng của YE lên khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo Nồng... cao nhất đã được sử dụng để nghiên cứu Hình 3.15 Đường cong sinh trưởng của tế bào cà gai leo khi bổ sung SA 150 µM và YE 3 g/L Hình 3.16 Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE 16 3.2.4.3 Thờ đ ểm cảm ứng Bảng 3.15 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo K ối lượng tế T ời điể (ngày) Tươi 7 14... 3.16 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 150 µM SA và 3 g/L YE đến khả năng t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo T ời điể (ng y) 7 14 21 ĐC Solasodine (mg/g) 11,8b 51,0c 46,0d 197,5a ĐC: SA 150 μM và YE 3 g/L được bổ sung vào môi trường lúc bắt đầu nuôi cấy 3.3 Khảo s t sơ ộ hoạt tính c a solasodine từ dịch chiết tế bào cà gai leo Bảng 3.17 Hoạt tính của dịch chiết solasodine của tế bào cà gai leo trên... từ nuôi cấy in vitro tế bào của cây cà gai leo có xử lý 150 µM salicylic acid từ nguồn cây tự nhiên ĐỀ NGHỊ 1 Nghiên cứu cải thiện sản xuất solasodine từ tế bào cà gai leo trong hệ lên men bioreactor 2 Nghiên cứu cơ chế tác động của elicitor đến con đường chuyển hóa solasodine trong tế bào cà gai leo 23 DANH M C C C C NG TRÌNH ĐÃ C NG Ố 1 Nguyen Hoang Loc, Nguyen Huu Thuan Anh, Le Thi Minh Khuyen,... bào cà gai leo cho thấy sự t ch ũy tăng dần khi bổ sung SA từ 50-150 μM, sau đ giảm mạnh ở 200-250 μM SA Nhìn chung, SA đã ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp solasodine trong tế bào cà gai leo rõ rệt hơn cả MeJA và YE 4.3.2 Ản ưởng c a thời gian x lý salicylic acid Tương tự với khi xử lý MeJA, thời gian xử lý bằng SA càng dài thì càng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của tế bào cây cà gai leo Thời gian... trưởng và t ch ũy so asodine trong tế bào huyền phù cà gai eo đạt cao nhất sau 4 tuần nuôi cấy, sinh khối tươi đạt 4,98 g/bình, sinh khối khô đạt 0,45 g/ ình và hàm ượng solasodine đạt 123,5 mg/g khối ượng khô, cao hơn trong rễ tự nhiên khoảng 5,3 lần 2 Ảnh hưởng của các e icitor đến khả năng t ch ũy solasodine trong tế bào in vitro của cây cà gai leo: 2.1 Hàm ượng so asodine t ch ũy cao nhất khi tế bào. .. dần từ tuần thứ 1 và đạt cực đại vào tuần thứ 4 Hình 3.8 Đường cong sinh trưởng tế bào cà gai leo khi bổ sung 3 g/L YE 11 Hình 3.9 Đường cong t ch ũy so asodine của tế bào cà gai leo khi bổ sung 3g/L YE 3.2.2.3 Thời đ ểm cảm ứng Bảng 3.7 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung 3 g/L YE lên khả năng sinh trưởng của tế bào cà gai leo K ối lượng tế T ời điể (ng y) Tươi 7 8,79a 14 8,41a 21 5,66b ĐC 8,80a o (g) Khô... thấy, cả sinh khối và hàm ượng solasodine của tế bào cà gai eo đều tăng ở nồng độ thích hợp (2-4 g/L) Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương tự như kết quả nghiên cứu của Jain và cs (2015) trên một đối tượng khác của họ cà là S melongena 4.2.2 Ản ưởng c a thời gian x lý dịch chiết nấm men Đối với cây cà gai leo, thời gian xử lý elicitor càng dài càng kích thích sinh khối tế bào phát triển Khi bổ sung YE