BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẠNH NGHIÊN CỨU TẠO MỘT SỐ CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ CHITOSAN TÁCH CHIẾT TỪ VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN ENZYME Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Văn Thiết HÀ NỘI, 2011 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc em xin gửi tới thầy PGS.TS Nguyễn Văn Thiết giao đề tài trực tiếp hướng dẫn để em hoàn thành khóa luận Đồng kính gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn Trần Thị Hoa Lý, người làm đề tài thầy cô làm việc Phòng Hóa Sinh Thực VậtViện Công Nghệ Sinh Học giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để em thực khóa luận Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến thầy, cô Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, thầy, cô trường Cao đẳng Thủy sản nơi mà em công tác, bạn lớp K13 cao học sinh học thực nghiệm, gia đình người thân bên em suốt thời gian qua! Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Hạnh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực không trùng lặp với đề tài khác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Học viên Nguyễn Thị Hạnh DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ CTSL Chitosan kích thước phân tử nhỏ C% Nồng độ phần trăm DD Độ deacetyl hóa ĐC Đối chứng E, [E] Enzyme, nồng độ enzyme E1 Cellulase E2 Chitinase E3 Chitosanase FPLC Flow Performance Liquid chromatography GlcN Glucosamine GlcNAc N-Acetyl-glucosamine GLS Glucosamin sulfate HH Mẫu chitosan tách chiết từ chitin phương pháp hóa học HQ Hàn Quốc Km Hằng số Michaelis - Menten Mr Phân tử lượng polymer MNSC monosaccharide NAG N-acetylglucosamine η Độ nhớt OLCS Oligochitosaccharide P Sản phẩm S, [S] Cơ chất, nồng độ chất T Thời gian U Đơn vị enzyme MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chitin/chitosan 1.1.1 Phân bố 1.1.2 Cấu tạo tính chất chitin 1.1.3 Cấu tạo tính chất chitosan 1.1.4 Công dụng chitosan 1.2 Các enzyme có khả thủy phân chitosan .13 1.2.1 Quá trình phân giải chitin chitosan tự nhiên 13 1.2.2 Các enzyme thuỷ phân chitosan 15 1.3 Vai trò sinh học Glucosamine 16 1.4 Vai trò sinh học nanochitosan oligochitosaccharide 20 CHƯƠNG .22 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 22 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Thiết bị 22 2.2 Các phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm .22 2.2.2 Phương pháp đo độ nhớt xác định khối lượng phân tử trung bình chitin .24 2.2.3 Phương pháp chuyển chitin thành chitosan 26 2.2.4 Các phương pháp xác định đường khử với antron .27 2.2.5 Các phương pháp nghiên cứu động học trình thủy phân chitosan 28 2.2.6 Phương pháp tủa với ethanol thu sản phẩm khác từ dịch thủy phân chitosan 29 2.2.7 Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử thiết bị FPLC .30 CHƯƠNG .31 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết tách chiết chitin từ vỏ tôm chuyển hóa chitin thành chitosan 31 3.1.1 Kết tách chiết chitin từ vỏ tôm phương pháp hóa học 31 3.1.2 Chuyển hóa chitin thành chitosan 32 3.1.3 Đánh giá chất lượng mẫu chitin chitosan thu 33 3.1.3.1 Kết đo độ nhớt 34 3.1.3.2 Xác định khối lượng phân tử chitin chitosan 36 3.2 Kết thuỷ phân chitosan phương pháp enzyme 37 3.2.1 Kết nghiên cứu động học thuỷ phân chitosan chitosanase 37 3.2.1.1 Nghiên cứu động học trình thuỷ phân chitosan chitosanase phương pháp đo độ nhớt 37 3.2.1.2 Nghiên cứu động học trình thuỷ phân chitosan chitosanase xúc tác phương pháp xác định đường khử 40 3.2.2 Kết nghiên cứu thuỷ phân chitosan chitinase .47 3.2.2.1 Đánh giá khả thuỷ phân chitosan chitinase phương pháp đo độ nhớt 48 3.2.2.2 Nghiên cứu động học trình thuỷ phân chitosan chitinase phương pháp đo đường khử 49 3.2.3 Kết nghiên cứu thuỷ phân chitosan cellulase 56 3.2.3.1 Đánh giá trình thuỷ phân chitosan enzyme cellulase phương pháp đo độ nhớt 56 3.2.3.2 Nghiên cứu động học trình thuỷ phân chitosan cellulase phương pháp đo đường khử 58 3.3 Đánh giá khả thu nhận chế phẩm sinh học từ chitosan phương pháp thủy phân enzyme 64 3.3.1 Đánh giá khả thu nhận chế phẩm glucosamine từ chitosan phương pháp thủy phân enzyme 65 3.3.2 Đánh giá khả thu nhận chế phẩm sinh học khác từ chitosan phương pháp thủy phân enzyme .71 3.4 Phân tích sản phẩm phương pháp sắc kí FPLC 74 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHẦN PHỤ LỤC 85 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Việt Nam quốc gia ven biển, nằm khu vực Đông Nam Á có khí hậu ấm áp quanh năm, có đường bờ biển dài 3.260 km với 112 cửa sông, lạch, có diện tích vùng nội thủy lãnh hải rộng 226.000 km2 [6] với nhiều nguồn sinh vật đa dạng phong phú Chính mà nay, ngành đánh bắt nuôi trồng thủy sản Việt Nam phát triển, ngành mũi nhọn nước ta nuôi tôm chế biến tôm đông lạnh xuất Hàng năm, nhà máy chế biến tôm thải lượng lớn phế liệu (phụ phẩm) đầu vỏ, khoảng 70000 [16], chiếm tới 40% lượng nguyên liệu ban đầu Nguồn phụ phẩm chủ yếu sử dụng làm thức ăn cho gia súc hay bị thải môi trường gây ô nhiễm nghiêm trọng Vì việc tìm giải pháp tận dụng tối đa nguồn phụ phẩm chế biến thủy sản mối quan tâm nhiều nhà khoa học giới Thành phần nguồn phế thải chitin, polymer hữu phổ biến tự nhiên, đứng sau cellulose Trở ngại lớn ứng dụng chitin tính chất khó hòa tan chúng nhiều dung môi, kể dung môi hữu Từ chitin tạo chitosan – polysaccharide mà thành phần chứa chủ yếu gốc glucosamine (GlcN) để ứng dụng cho nhiều ngành kinh tế: nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm đặc biệt ngành dược phẩm, chitosan nguyên liệu để bào chế nhiều loại sản phẩm thuốc chữa bệnh khác Một loại thuốc glucosamine, chất tham gia vào trình tổng hợp nhiều thành phần sụn khớp, đóng vai trò quan trọng trì sức mạnh tính đàn hồi khớp Nó có tác dụng kích thích tế bào sụn khớp tổng hợp proteoglucan, ức chế số enzyme gây phá hủy sụn khớp, giảm gốc tự gây hại cho tế bào sinh sụn, tăng sản sinh chất nhầy dịch khớp, làm trơn dịch khớp giảm tượng thoái hóa khớp Nước ta có nhiều nguồn nguyên liệu chứa chitin phong phú Trong động vật thủy sản đặc biệt vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiếm tỉ lệ cao, từ 14 - 35% so với trọng lượng khô [7] Với đặc tính sẵn có kháng nấm, kháng khuẩn, tăng cường khả miễn dịch, tác động tích cực đến trình chuyển hóa lipid thể, chống lại tế bào u mà chitin/chitosan dẫn xuất chúng nghiên cứu sử dụng vào nhiều lĩnh vực khác sống: công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, xử lý nước thải… đặc biệt lĩnh vực y học Từ chitosan người ta bào chế nhiều loại thuốc điều trị bệnh nhiễm xạ, chữa bỏng, giảm đau, đặc biệt bệnh nhân đái tháo đường chitosan có khả kích thích thể tiết insulin [17] Mặc dù chitin/chitosan có nhiều, coi hợp chất không độc, gây dị ứng trình nghiên cứu chitin – chitosan thực có hệ thống vào kỷ 20 [54] Các công trình nghiên cứu nhiều nhà khoa học giới chứng minh vỏ tôm có chứa 27% chất chitin, từ chitin họ nhận chitosan – polysaccharide mà thành phần chứa chủ yếu gốc glucosamine Trên giới nước ta ngày có xu hướng sử dụng chế phẩm chiết xuất từ nguồn gốc thiên nhiên Vì việc tạo chế phẩm sinh học từ chitosan sản phẩm chế biến từ polysaccharide cần thiết Xuất phát từ nhu cầu trên, chọn đề tài: “Nghiên cứu tạo số chế phẩm sinh học từ chitosan phương pháp thủy phân enzyme” Mục đích nghiên cứu Tạo số chế phẩm sinh học từ vỏ tôm phương pháp thủy phân enzyme 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Đề tài có nội dung nghiên cứu sau đây: 1) Thu nhận chế phẩm chitin từ vỏ tôm 2) Chuyển hóa chitin thành chitosan xác định kích thước phân tử chitin thông qua đo độ nhớt chế phẩm chitosan nhận 3) Nghiên cứu động học trình thủy phân chitosan enzyme khác để tìm điều kiện tối ưu cho việc tạo số chế phẩm sinh học từ chitosan: Nhóm sản phẩm thứ chitosan kích thước phân tử nhỏ (bao gồm chitosan khối lượng phân tử thấp, nanochitosan); nhóm sản phẩm thứ hai (bao gồm oligochitosaccharide mạch dài, oligochitosaccharide mạch ngắn) gọi oligochitosaccharide, nhóm sản phẩm thứ ba – monosaccharide (glucosamine) Đối tượng phạm vi nghiên cứu * Đối tượng nghiên cứu: Chitin, chitosan khối lượng phân tử thấp, nanochitosan, oligochitosaccharide mạch dài, oligochitosaccharide mạch ngắn monosaccharide (glucosamine) * Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu trình thủy phân chitosan enzyme khác nhau: chitinase, chitosanase, cellulase nồng độ, nhiệt độ thời gian khác Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp tách chiết chitin từ vỏ tôm; - Phương pháp đo độ nhớt xác định khối lượng phân tử trung bình chitin; - Phương pháp chuyển chitin thành chitosan; - Các phương pháp xác định đường khử với antron; - Các phương pháp nghiên cứu động học trình thủy phân chitosan; - Phương pháp tủa với ethanol thu sản phẩm khác từ dịch thủy phân chitosan; - Phương pháp sắc kí sàng lọc phân tử thiết bị FPLC Dự kiến đóng góp Chỉ phương pháp thủy phân enzyme tạo số chế phẩm sinh học có giá trị giá tăng cao từ chitosan 79 Nguyễn Văn Sức, Ngô Quang Huy, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn Văn Hùng, (2004), “Hấp Thụ uran chitin/chitosan có độ deaxetyl thấp” Tạp chí Hoá học, tập 42, (số 1), tr 1-4 10 Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Trung Sỹ (2006), “Động học trình hoạt hóa chitinase, enzyme xúc tác phản ứng thủy phân chitin tạo thành glucosamin” Tuyển tập báo cáo Hội nghị khoa học Viện Hóa học năm 2006, Hà Nội, tr 261- 266 11 Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Bích Thủy, Đỗ Trung Sỹ (2008) “Động học trình hoạt hóa chitinase phản ứng thủy phân chitin thành glucosamine” Tạp chí Khoa học Công nghệ, tập 46, (số 1), tr.79-85 12 Vũ Thị Ngọc Thanh, Lê Thị Hải Yến, (2001), “Bước đầu nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp tác dụng giảm đau chỗ chitosan thực nghiệm”, Tạp chí Dược học, (số 7), tr.19 13 Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú, Nguyễn Thanh Hải, (2005),“ Một số kết bước đầu nghiên cứu quy trình sản xuất chitin từ vỏ tôm phương pháp công nghệ enzyme” Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị Môi trường toàn quốc 2005, Hà Nội, tr.1428- 1432 14 Nguyễn Văn Thiết, Đỗ Ngọc Tú (2006), “Phương pháp enzym tách chiết chitin từ vỏ tôm” T/c Dược liệu, T 11 (2), tr.77-80 15 Lê Thị Hải Yến (2003) “ Nghiên cứu chitin/chitosan ứng dụng y học” Luận án tiến sỹ hóa học, Hà Nội 16 Lê Thị Hải Yến, Nguyễn Thị Ngọc Tú, (2003), “Khảo sát động học phản ứng deaxetyl hoá chitin thành chitosan nhiệt độ thường” Tạp chí hoá học, tập 41, (số 3), tr 54-60 Tài liệu Tiếng Anh: 80 17 Copecny l., Hodrova B (1998) Chitinolytic enzymes in rumen microbial ecosystem Scientific Symp “Animal Microbiology” Domzale, Slovenia, May 29, 1998, pp 85-93 18 Encyclopedia of Polymer Science and Technology (1965) Sydney – London, Vol 3, pp 605-704 19 Fenton, G., Sammons, D C., Seabourne, F A., and Woodhouse, D L (1967) Lethal action of sugars on ascites tumor cells in vitro Nature 213, 308-309 20 Fulamizo T., Sasaki Ch., Schelp E., Bortone K., Robertus J.D (2001) Kinetic properties of chitinase-1 from the fungal pathogen Coccidioides immitis Biochemistry, Vol 40, pp 2448-2454 21 Fukamizo, T., Ohkawa, T., Sonoda, K., Toyoda, H., Nishiguchi, T., Ouchi, S., Goto, S (1992) Chitinous components of the cell wall of Fusarium oxysporum Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 56:1632-1636 22 Karanda M J., Robbins P W (1991) Chitinase is required for cell separation during growth of Saccharomyces cerevisiae JBC, Vol 266, pp 19758 – 19767 23 Lundblad G., Elander M., Lind J., Sletengren K (1994) Bovine serum chitinase Eur J.Biolchem., Vol 100, pp 455-460 24 Ji C., Kuc J (1996) Antifungal activity of cucumber β-1,3-glucanase and chitinase Physiol Mol Plant Pathol., Vol 49, pp 257-265 25 Lehninger A L (1997) Principlé Biochemistry Worth Publishers, Inc., New York 26 Lundblad G., Elander M., Lind J., Sletengren K (1994) Bovine serum chitinase Eur J.Biolchem., Vol 100, pp 455-460 81 27 Masatoshi Sugimoto, Mimoru Morimoto, Hitoshi Shashiwa Hiroguki Saimoto, Yoshihiro Shigemasa (1998) Preparation and characterization of water-soluble chitin and chitosan derivative, Cacbohydrate Polymers, Vol.36, pp 49-59 28 Mitsutomi, M., Ohtakara, A (1992) Difference between microbial chitinase and chitosanase in the mode of action on partially N-acetylated chitosan In: Advances in chitin and chitosan (C.J Brine, P.A Sandford, J.P Zikakis, editors) Elsevier, London, pages 304-313 29 Mucha M, Miskiewicz D (2000) “Chitosan blends as fillers for paper”, J.Appl.Polymer Sci., Vol 77, pp 3210-3215 30 Mitsutomi, M., Isono, M., Uchiyama, A., Nikaidou, N., Ikegami, T., Watanabe, T (1998) Chitosanase activity of the enzyme previously reported as beta-1,3-1,4-glucanase from Bacillus circulans WL-12 Bioscience Biotechnology and Biochemistry 62:2107-2114 31 Muzzarelli R A A (1977) Chitin, Oxford: Pergamon Press 209 p 32 Muzzarelli, R.A.A., Xia, W., Tomasetti, M., Ilari, P (1995) Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation Enzyme and Microbial Technology 17:541-545 33 Ohno, T., Armand, S., Hata, T., Nikaidou, N., Henrissat, B., Mitsutomi, M., Watanabe, T (1996) A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037 Journal of Bacteriology 178:5065-5070 34 Olsen, R., Weppner, D S W., and Winandy, R., "Biomedical applications of chitin and its derivatives", in Chitin Handbook, (ed Muzzarelli, R.A.A and Peter, M.G.), 1997, p 813 35 Roberts W.K., Selitrennikoff C.P (1988) Plant and bacterial chitinases deffer in antifungal activity J.Gen.Microbiol., Vol.134, pp 169-176 82 36 Sakai, K., Katsumi, R., Isobe, A., Nanjo, F (1991) Purification and hydrolytic action of a chitosanase from Nocardia orientalis Biochimica et Biophysica Acta 1079: pp 65-72 37 Simpson, B K., Gagne, N., and Simpson, M V., "Bioprocessing of chitin and chitosan", in Fisheries Processing: Biotechnological applications, (ed Martin, A M.), Chapman & Hall, London, 1994, pp 155-173 38 Sirica.A.E and R.J.Woodman (1971) J Nat Cancer., Vol 47, No 2, pp 377-388 39 Sudharshan N.R, Hoover D.R, Knorr D (1992) “Antibacterial action of chitosan”, Food Biotech, Vol 6, pp 257-271 40 Sashiwa, H., Saimoto, H., Shigemasa, Y., Ogawa, R., Tokura, S (1991) Lysozyme susceptibility of partially deacetylated chitins International Journal of Biological Macromolecules, 12:295-296 41 Terbojevich, M., Cosani, A., Muzzarelli, R.A.A (1996) Molecular parameters of chitosans depolymerized with the aid of papain Carbohydrate Polymers 29: pp 63-68 42 Terwisscha A.C., Klak K.H., Beintema J.J., Dijkstra B.D (1994) Crystal structure of hevamine, a plant defence protein with chitinase and lysozyme activity, and its complex with an inhibitor Structure, Vol 2, pp 1181-1189 43 Velosquez C.L., Medina D., Torres C Millon E (2007) Kinetic of the enzymatic degradation of chitosan using bromelain: a viscosimetric study Advances en Quimica, Vol 2, No 2, pp 25-32 44 Visakh P.M., Anu Tresa Sunny, S Thomas and Aji P Mathew Mechanichal properties and transport behaviour of chitin whiskers (CW) reinforced carboxylated styrene butadiene rubber latex (XSBR) nanocomposites 83 45 Yagita, M., Nakajima, M., and Saksela, E (1989) Suppression of human natural killer cell activity by amino sugars Cell Immunol 122, 83-95 46 Yalpani, M., Pantaleone, D (1994) An examination of the unusual susceptibilities of aminoglycans to enzymatic hydrolysis Carbohydrate Research 256:159-175 Tài liệu Tiếng Nga: 47 (Bolshakov I.N et al.) Бльшaкoв И.Н., Hacибoв C.M., Kyклин E.Ю., Пpиxoдькo (2002) Иcпoльзoвaниe xитoзанa и eгo пpoдyктов при воыпалитeльныx зaбoлeвaний жeлy-дoчнo-кишeчнoгo тpaктa c 280– 301 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoв 48 Gorovoi L.F., Kosyakov V.I (Гopoвoй Л.Ф., Kocякoв В.И.) (2002) Copбциoнныe cвoйcтвa xитинa и eгo пpoизвoдныx c 217–246 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 49 Maslova G.VG (Macловa Г.B.) (2002) Teopия и пpaктикa пoлyчeниe xитинa элeктpoxимичecким мeтoдoм c 24–43 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 50 Быкoвa B.M., Heмцев C.В (2002) Cыpeвые иcтoчники и cпocoбы пoлyчeния xитинa и xитoзанa c 7–23 B кн “Xитин и xитoзан Пoлyчeниe, cвoйcтвa и пpимeнeниe” Пoд peдaкциeй K.Г Cкpябинa, Г.A Bиxopeвoй, B.П Bapлaмoвa Издaтeльcтвo “Нayкa” 2002 – 368 c 84 51 Большой Практикум по Биохимии (под редакцией профессора Н.П.Мешковой и академика Северина С.Е.) Издaтeльcтвo МГУ, Moсква 1979, 409 стр 52 Химия Издaтeльcтвo “Химия”, Moсква 672 стp 53 http://www.thuocbietduoc.com.vn/home/newdt9393tt1ev22.aspx 54 http://www.baocantho.com.vn/vietnam/trongnuoc/9862/Đưa công nghệ sản xuất chitin chitosan vào phục vụ đời sống 55 http://www.haiphong.gov.vn/baohaiphong/vn/ 56 http://user.chollian.net/%7Echitin/prechitosan.gif 57 http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/chitosan.html 58 http://www.lboro.ac.uk/departments/cg/Projects/2001/clarke/exper.html#s olvent 59 http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/chitosan.html 60 http://www.greatvistachemicals.com/biochemicals/chitin.html 61 http://en.wikipedia.org/wiki/Chitin 85 PHẦN PHỤ LỤC Bảng Kết đo độ nhớt (thời gian chảy) hỗn hợp phản ứng thủy phân chitosan thời điểm khác Phản ứng với nồng độ chitosan khác lượng chitosanase (E3) (1,5 đv) xúc tác (*) Nồng độ chất (chitosan), % Thời gian phản ứng, h 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 22.96 30.12 44.45 63.12 71.69 19.07 23.92 37.69 52.61 60.35 17.99 20.88 34.62 47.79 55.21 16.87 18.74 32.81 45.46 52.48 16.25 18.74 31.54 43.25 50.64 (*) Trong thí nghiệm tất thí nghiệm khác nghiên cứu khả thủy phân chitosan enzyme khác phương pháp đo độ nhớt (thời gian chảy dung dịch ctd hỗn hợp phản ứng), phản ứng thủy phân chitosan tiến nhành nhiệt độ 37oC với thể tích hỗn hợp phản ứng 15 ml Bảng Kết đo độ nhớt (thời gian chảy) hỗn hợp phản ứng thời điểm khác Phản ứng với nồng độ chitosan 0,5% lượng chitosanase khác xúc tác Nồng độ chitosanase, đv (U) Thời gian phản ứng, h 0,25 U 0,50 U 0,75 U 1,00 U 71.65 71.65 71.65 71.65 60.58 57.91 56.64 55.81 57.01 53.85 51.28 50.15 54.99 51.81 49.75 48.15 54.32 50.79 48.91 47.25 54.25 50.68 48.76 47.02 86 Bảng Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ 0,5% lượng chitosanase khác xúc tác Chitosanase, Lượng đường khử đo thời điểm khác phản U/mẫu ứng, μg/mẫu 1h 2h 4h 6h 8h 1.0 179.2 349.4 627.2 851.2 1030.4 2.5 416.5 812.2 1457.8 1978.4 2394.9 5.0 788.6 1537.8 2760.1 3745.9 4534.5 7.5 1116.7 2177.6 3908.5 5304.3 6421.0 10.0 1402.9 2735.7 4910.2 6663.8 8066.7 Bảng Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ khác lượng chitosanase xúc tác Nồng độ Lượng đường khử đo thời điểm khác phản ứng, chitosan, μg/mẫu mg/ml 1h 2h 4h 6h 8h 0,2 101.2 197.4 372.6 552.5 775.7 0,5 197.4 408.5 781.1 1135.4 1611.3 318.7 677.9 1307.6 1833.5 2319.9 472.2 976.4 1796.3 2447.0 3016.8 567.9 1137.5 2075.2 2842.2 3430.1 650.8 1243.0 2261.5 3083.7 3724.9 694.7 1321.5 2391.7 3260.8 3962.5 Bảng Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ khác xúc tác lượng chitosanase khác (Lượng đường khử dịch thủy phân xác định thời điểm h kể từ bắt đầu phản ứng) 87 Nồng độ Lượng đường khử đo thời điểm h hỗn hợp phản ứng chitosan, lượng chitosanase khác xúc tác, μg/mẫu mg/ml 0.5U 1U 2U 3U 4U 0.2 39.7 91.5 187.4 292.9 441.2 0.5 91.4 189.4 392.9 601.9 916.4 152.9 314.4 657.8 971.9 1319.4 224.1 452.8 903.6 1297.1 1715.8 266.3 527.5 1043.9 1506.6 1950.8 291.3 576.4 1137.6 1634.6 2118.5 310.4 612.8 1203.1 1728.5 2253.6 Bảng Kết đo độ nhớt (thời gian chảy) hỗn hợp phản ứng thời điểm khác nhau, phản ứng với nồng độ chitosan 0,5% lượng chitinase (E2) khác xúc tác Nồng độ chitinase, đv (U) Thời gian phản ứng, h 0,5U 1U 1,5U 2U 71.65 71.65 71.65 71.65 66.46 63.12 61.92 61.33 62.95 58.92 57.31 55.35 60.47 57.25 55.55 53.45 59.54 56.35 54.37 52.75 59.39 56.02 54.06 52.31 Bảng Kết đo độ nhớt hỗn hợp phản ứng thủy phân chitosan nồng độ khác lượng chitinase (E2) (1,5 đv) xúc tác Nồng độ chất (chitosan), % Thời gian phản ứng, h 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 22.86 30.72 45.75 63.12 71.65 88 Nồng độ chất (chitosan), % Thời gian phản ứng, h 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 21.26 26.71 36.97 52.31 59.84 19.87 24.01 32.91 47.31 54.51 18.41 21.34 31.58 45.56 52.83 17.58 20.23 31.24 45.18 52.17 Bảng Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ 0,5% lượng chitinase khác xúc tác Lượng Lượng đường khử đo thời điểm khác phản ứng, chitinase, U μg/mẫu 1h 2h 4h 6h 8h 1.0 14.4 27.8 50.1 68.0 82.7 2.5 39.5 76.2 137.5 186.4 226.7 5.0 74.9 144.6 260.7 353.5 429.9 7.5 106.2 205.0 369.6 501.3 609.6 10.0 132.2 255.1 460.1 624.0 758.8 Bảng Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ khác lượng chitinase xúc tác Nồng độ Lượng đường khử đo thời điểm khác phản ứng, chitosan, μg/mẫu mg/ml 1h 2h 4h 6h 8h 0,2 8.0 17.8 33.5 49.7 69.8 0,5 18.4 36.8 70.3 102.2 145.1 30.8 61.0 117.7 165.0 208.9 45.2 87.9 161.7 220.2 271.6 53.7 102.3 186.8 255.7 308.9 89 Nồng độ Lượng đường khử đo thời điểm khác phản ứng, chitosan, μg/mẫu mg/ml 1h 2h 4h 6h 8h 58.8 111.8 203.6 277.5 335.4 62.6 118.9 215.3 293.4 356.8 Bảng 10 Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ khác xúc tác lượng chitinase khác (Lượng đường khử dtp xác định thời điểm h kể từ bắt đầu phản ứng) Nồng độ Lượng đường khử đo thời điểm h dtp lượng chitosan, chitinase khác xúc tác, μg/mẫu mg/ml 0.5U 1U 2U 3U 4U 0.2 3.7 8.7 17.9 27.9 42.1 0.5 8.6 18.1 37.5 57.4 87.5 14.4 30.0 62.7 92.7 126.0 21.1 43.2 86.1 123.7 163.8 25.0 50.4 99.5 143.7 186.3 27.4 55.0 108.5 155.9 202.3 29.2 58.5 114.7 164.9 215.2 Bảng 11 Kết đo thời gian chảy (t, s) hay hay độ nhớt hỗn hợp phản ứng thủy phân chitosan với nồng độ chất khác lượng cellulase xúc tác t, h Nồng độ ban đầu chất (chitosan) 0,1% 00,2% 0,3% 0,4% 0,5% 22.54 29.58 43.68 62.01 71.56 18.66 23.45 37.09 51.66 59.43 90 Nồng độ ban đầu chất (chitosan) t, h 0,1% 00,2% 0,3% 0,4% 0,5% 17.63 21.07 34.01 46.99 54.44 16.54 19.34 32.28 44.67 51.76 15.87 18.39 30.97 42.58 48.96 Bảng 12 Kết đo độ nhớt (thời gian chảy) hỗn hợp phản ứng thời điểm khác nhau, phản ứng thực với nồng độ chitosan 0,5% lượng cellulase (E1) khác xúc tác Thời gian chảy (độ nhớt) hỗn hợp phản ứng thời điểm Lượng E1, khác nhau, s mg/mẫu 1h 2h 4h 6h 8h 56.16 52.15 50.29 49.59 49.45 10 53.04 48.77 46.98 46.08 45.85 15 51.67 47.05 45.01 44.28 43.98 20 51.18 45.29 43.45 42.75 42.55 Bảng 13 Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ 0,5% lượng cellulase khác xúc tác Lượng Lượng đường khử đo thời điểm khác phản chitinase, U ứng, μg/mẫu 1h 2h 4h 6h 8h 2.4 U 285.0 541.5 980.4 1336.7 1624.5 4.8 U 584.0 1109.6 2009.0 2739.0 3328.8 7.2 U 822.0 1561.8 2827.7 3855.2 4685.4 9.6 U 1068.0 2029.2 3673.9 5008.9 6087.6 12 U 1230.0 2337.0 4231.2 5768.7 7011.0 91 Bảng 14 Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ khác lượng cellulase xúc tác Chitosan, Lượng đường khử đo thời điểm khác phản ứng, mg/ml μg/mẫu 1h 2h 4h 6h 8h 0.182 179.08 340.24 616.02 839.8618 1020.73 0.455 349.51 664.06 1202.30 1639.178 1992.18 0.909 561.93 1067.66 1933.02 2635.428 3202.97 1.818 838.57 1593.27 2884.66 3932.87 4779.82 2.727 1009.00 1917.09 3470.94 4732.187 5751.27 3.636 1154.73 2193.98 3972.25 5415.66 6581.93 4.545 1235.00 2346.50 4248.40 5792.15 7039.50 Bảng 15 Kết đo lượng đường khử tạo thành phản ứng thủy phân chitosan nồng độ khác nhau, xúc tác lượng cellulase khác (Lượng đường khử dịch thủy phân xác định thời điểm h kể từ bắt đầu phản ứng) Nồng độ Lượng đường khử đo sau h thủy phân, phản ứng lượng chitosan, chitinase khác xúc tác, μg/mẫu mg/ml 0.96U 1.92U 2.88U 3.84U 4.80U 0.182 41.2 91.3 135.3 185.5 251.9 0.455 94.7 189.0 283.7 381.1 523.4 0.909 158.5 313.6 474.9 615.4 753.5 1.818 232.3 451.7 652.4 821.3 979.8 2.727 276.0 526.2 753.6 954.0 1114.1 3.636 301.9 575.0 821.3 1035.1 1209.8 4.545 321.7 611.3 868.6 1094.5 1287.0 92 Bảng 16 Tổng kết kết nghiên cứu mối phụ thuộc Vm vào nồng độ enzyme thời gian đo lượng đường khử dịch thủy phân Giá trị Vm, µg Nồng độ enzyme, Giá trị Vm, µg Thời U/ml gian E3 & E2 E1 E3 E2 E1 đo ĐK E3 E2 E1 0.05 0.096 455 44 476 1h 833 93 1429 0.1 0.192 769 76 769 2h 1667 154 2500 0.2 0.288 1667 149 1111 4h 3333 286 5000 0.3 0.384 2000 204 1429 6h 5000 370 10000 0.4 0.48 2500 250 1667 8h 5000 417 10000 8000 7000 6000 5000 4000 E3 0.2mg §K, mcg/mÉu 1h 2h 4h 6h 8h §K, mcg/mÉu 9000 3000 E3 1mg 2mg 3mg 4mg 5mg 2000 4000 0.5mg 3000 1000 2000 1000 E, U/mÉu Hình Dạng tuyến tính đồ thị hình 3.5 (hình trái) 700 600 500 400 2h 350 4h 300 6h 8h 250 400 200 300 150 200 100 100 E, U/mÉu 0 Hình Dạng tuyến tính đồ thị hình 3.13 (hình trái) t, h Hình Dạng tuyến tính đồ thị hình 3.6 E2 1h §K, mcg/mÉu 800 10 §K, mcg/mÉu 10 0.2mg E2 0.5mg 1mg 2mg 3mg 4mg 5mg 50 0 t, h Hình Dạng tuyến tính đồ thị hình 3.14 93 6000 5000 8000 2h 4h 7000 6h 6000 8h §K, mcg/mÉu 7000 E1 1h §K, mcg/mÉu 8000 5000 4000 4000 3000 3000 2000 2000 0.182mg 0.455mg E1 0.909mg 1.818mg 2.727mg 3.636mg 4.545mg 1000 1000 E, U/mÉu 0 10 Hình Dạng tuyến tính đồ thị hình 3.21 (hình trái) 12 0 t, h Hình Dạng tuyến tính đồ thị hình 3.22