ĐẠI H C QU C GIA HÀ N I TR NG Đ I H C KHOA H C T NHIÊN Nguy n Văn B c NGHIÊN C U PHÁT HI N VI KHU N LAO KHÁNG ĐA THU C B NG K THU T SINH H C PHÂN T LU NăVĔNăTHẠCăSƾăKHOAăH C Hà N iăậ 2010 ĐẠI H C QU C GIA HÀ N I TR NG Đ I H C KHOA H C T NHIÊN KHOA SINH H C Nguy n Văn B c NGHIÊN C U PHÁT HI N VI KHU N LAO KHÁNG ĐA THU C B NG K THU T SINH H C PHÂN T Chuyên ngành: Sinh h c th cănghi m Mưăs : 60 42 30 LU NăVĔNăTHẠCăSƾăKHOAăH C H NGăD NăKHOAăH C:ăPGS TS NghiêmăNg căMinh Hà N iăậ 2010 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Lời cảm ơn! Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, dìu dắt, giúp đỡ thời gian thực tập hoàn thành khóa luận Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y tập thể cán phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho suốt thời gian thực tập hoàn thành khóa luận Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo khoa Sinh học thầy cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh, trường Đại học KHTN hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, xin dành cho người thân gia đình bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, người thân yêu bên tôi, động viên góp ý cho suốt trình học tập hoàn thành khóa luận Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Văn Bắc Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc DANH M C CH VI T T T Bp : Base pairs CNSH :ăCôngăngh ăsinhăh c CTCLQG :ăCh DNA : Acit deoxyribonucleic dNTPs : Deoxyribonucleotide Triphosphate EDR : Extensively drugăresitantă(Kh́ngăthu căm̉ăr ng) EMB : Ethambutol HRS :ăBaălọiăthu căisoniazid,ărifampicin,ăstreptomycin HRSE : B nălọiăthu căisoniazid,ărifampicin,ăstreptomycin ethambutol INH : Isoniazid IPTG : Isopropyl-thio- -D-galactoside Kb : Kilo base LB : Luria - Bertani MDR :ăMultidrugsăresistantă(Kh́ngăđaăthu c) PAS : Paraminosalicylic acid PAZ : Pyrazinamid PCR : Polymerase Chain Reaction RMP : Rifampicin RNA : Acid Ribonucleic RRDR : Rifampin resistance determiningăregionă(Vùngăquy tăđ nhăkh́ngă ngătr̀nhăch ngălaoăqu căgia rifampicin) Taq polymerase : Thermus aquaticus DNA polymerase TCYTTG :ăT̉ăch́căYăt ăTh ăgíi V :ăVolumeă(thểătích) X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc M CL C M Đ U Ch ng ậ T NG QUAN 1.1.ăB NHăLAO 1.2 TÌNH HÌNH LAO KHÁNGăTHU C 1.γ.ăVIăKHU NăLAO 1.3.1 C u t o 1.3.2 C ch gơy b nh 1.3.3 Đặc điểm h gen 1.4.ăC ăCH ăKHÁNGăTHU Că ăVIăKHU NăLAO 1.4.1 Kháng sinh điều tr lao 1.4.2 Nguyên nhơn gơy kháng thu c 10 1.4.3 Rifampicin vƠ c ch kháng 12 1.4.4 Isoniazid vƠ c ch kháng 15 1.5.ăCÁCăPH NGăPHÁPăCH NăĐOÁNăLAOăKHÁNGăTHU C 16 1.5.1 Đặc điểm lơm sƠng vƠ xét nghi m c n lơm sƠng 16 1.5.2 Xác đ nh kiểu hình 18 1.5.3 Xác đ nh kiểu gen 18 1.5.4 K thu t real-time PCR multiplex real-time PCR 19 Ch ng ậ V T LI U VẨ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 23 β.1.ăV TăLI UăNGHIÊNăC U 23 2.1.1 Đ i t ng nghiên c u 23 2.1.2 V t li u thi t b vƠ ḍng c̣ nghiên c u 23 2.1.3 Các cặp m i dùng nghiên c u 24 Luận văn thạc sĩ β.β.ăPH Nguyễn Văn Bắc NGăPHÁPăNGHIÊNăC U 25 2.2.1 S đ nghiên c u 25 2.2.2 PCR nhơn đo n gen đích 26 2.2.3 T o dòng gen 27 2.2.4 Multiplex real-time PCR 28 Ch ng ậ K T QU VẨ TH O LU N 30 γ.1.ăK TăQU ăTÁCHăDọNGăVẨăGI IăTRÌNHăT 30 3.1.1 K t qủ nhơn gen katG rpoB t̀ DNA tách t̀ vi khu n lao 30 3.1.2 K t qủ tách dòng gen 31 3.1.3 K t qủ phơn tích trình t gen katG 34 3.1.4 K t qủ phơn tích trình t gen rpoB 36 γ.β.ăT Iă UăHịAăPH Nă NGăMULTIPLEXăREAL-TIMEăPCRăPHÁTăHI Nă NHANHăVIăKHU NăLAOăKHÁNGăTHU C 41 3.2.1 Thi t k primer probe cho ph̉n ng multiplex real-time PCR 41 3.2.2 K t qủ t i u thƠnh ph n vƠ chu trình ph̉n ng multiplex real-time PCR phát hi n đột bi n liên quan kháng thu c 44 K T LU N 60 KI N NGH 61 TẨI LI U THAM KH O 62 PH L C 69 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc M Đ U B nhălaoăvƠăviăkhu nălaoă(Mycobacterium tuberculosis)ăđưăđ ợcăbi tărõăt ăm tă th ă kỷă nay.ă Hi nă nayă tỷă l ă nhi mă laoă đ ợcă ́cătínhălƠă 1/γă dơnă s ă th ă gíi,ăkho ngă 9ă tri uăng iămắcălaoăḿiăvƠăh năγătri uăng iăch tădoălaoăm iănĕm.ăB nhălaoăđangătr̉ă nênă nghiêmă tr ngă h nă v́iă s ă xuấtă hi nă ćcă ch ngă laoă kh́ngă đaă thu că (Multi-Drugs Resistant - MDR),ă t́că lƠă thểă laoă v́iăviă khu nă kh́ngă ítănhấtă haiă lọiă thu că ch ngă laoă ṃnhănhấtălƠăisoniazidă(INH)ăvƠărifampicină(RMP).ăTheoăs ăli uăth ngăkêăc aăch tr̀nhăch ngălaoăQu căgiaănĕmăβ007,ăth ăgíiăcóăkho ngă511.000ătr kh́ngă đaă thu c,ă trongă đóă cóă h nă 1γ0.000ă tr ngă ngăhợpănhi mălaoă ngă hợpă tửă vong.ă Doă nh ngă khóă khĕnă trongăvi căđiềuătr ănh ngăb nhănhơnămangăćcăch ngălaoăkh́ngăthu căph̉ăr ngăvƠăđaă kh́ngămƠăvi căph́tăhi năśmăćcăch ngălaoăkh́ngăđaăthu căs ătr̉ănênărấtăquanătr ngă trongăđiềuătr ăb nhălao Hi nă nayă nhiềuă n iă ch nă đónă viă khu nă laoă kh́ngă thu că v nă d aă vƠoă ph ngă ph́pănuôiăcấyăviăkhu năvƠălƠmăkh́ngăsinhăđ ălƠăch ăy u,ătuyănhiên,ăvi cắngăd ngăsinhă h căphơnătửăcũngăđangăṭoăraănh ngăđ tăph́ătrongăph́tăhi năviăkhu nălaoăkh́ngăthu c.ă C ăch ă kh́ngă thu că ̉ă viă khu nă laoă lƠă doă trongă qúă tr̀nhă ti nă hóa,ă cóă nhiềuă đ tă bi nă xuấtăhi nătrongăm tăs ăgenăch́cănĕng,ătr ́căh tălƠẳăgenărpoB katG.ăTh iăgianăch nă đónăcóăthểărútăngắnăchỉăcònăvƠiăngƠy,ăv́iăđ ănḥyăvƠăđ ăđặcăhi uăcao,ăṭoăđiềuăki nă choăkiểmăsótăb nhălaoăd ădƠngăh n.ăĆcănghiênăćuăvềăsinhăh căphơnătửătrongăch nă đónălaoăkh́ngăthu căđưăchỉăraărằngăm iălọiăkh́ngăthu călƠădoăxuấtăhi năćcăđ tăbi nă trênăgenăt ngắngăch uătŕchănhi m.ăChínhăv̀ăv yăvi căx́căđ nhăćcătr laoăkh́ngăthu căth ngăhợpănhi mă ngăđiăkèmăv́iănh ngăch năđónăph́tăhi năđ tăbi năgenăđ iăv́iăćcă ch ngălaoăph́tăhi năđ ợc.ăĆcăch ngăvi khu nălaoăkh́ngăisoniazidălƠădoăcóăliênăquană t́iăđ tăbi năṭiăcodon 315 gen katG,ăđ iăv́iăćcăch ngăkh́ng rifampicinădoăxuấtă hi năcác đ tăbi nẳăm t vùng nóng g măβ7ăcodonănằmăg nătrungătơmăc aăgenărpoB Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Xuấtă ph́tă t ă nh ngă lỦă doă trên,ă chúngă tôiă ti n hƠnhă đềă tƠi:ă “Nghiên cứu phát vi khuẩn lao kháng đa thuốc kỹ thuật sinh học phân tử” V́iă m că tiêuă nghiênă ću: phát nhanh chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định vị trí đột biến liên quan kháng thuốc gen katG rpoB phương pháp giải trình tự kỹ thuật multiplex real-time PCR Đểă đ̣tă đ ợc m că tiêuă c aă đềă tƠi,ă chúngă tôiă ti nă hƠnh m tă s ă n iă dungă nghiênă ćuănh ăsau: X́căđ nhătr̀nhăt ăgenărpoB katG Phân tích đặcăđiểmăphơnătửăc aăćcăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngăthu c phân l păṭiăVi tăNam trênăc ăs̉ătr̀nhăt ănucleotideăc aăhaiăgenărpoB katG T iă uă hóaă thƠnhă ph nă vƠă chuă tr̀nh b ă kit multiplex real-time PCR phát hi nănhanhăviăkhu nălaoăkh́ngăthu c Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Ch ng ậ T NG QUAN 1.1.ăB NHăLAO Lao (Tuberculosis) m tă b nhă truyềnă nhi mă ṃn tính,ă lƠă t̀nhătṛngă nhi mă viă khu nă Mycobacterium tuberculosis,ă th h ̉ngăđ năh ăth năkinhătrungă kê),ăx ngă gặpă nhấtă ̉ă ph̉iă nh ngă cũngă cóă thểă nhă ngă(laoămƠngănưo),ăh ăḅchăhuy t,ăh ătu năhoƠnă(laoă ngăvƠăkh́p.ăB nhălaoăgắnăliềnăv́iăs ăph́tătriểnăc aăxưăh iăloƠiăng iăt ăhƠngă ngƠnănĕmănay,ătrênăth ăgíiăch aăbaoăgi ăvƠăkhôngăm tăqu căgiaănƠo,ăm tăkhuăv cănƠo,ă m tădơnăt cănƠoăkhôngăcóăng iămắcăvƠăch tăv̀ăb nhălao.ăTr căkhu nălaoăl năđ uătiênă đ ợcăb́căsƿăRobertăKochăđưăph́tăhi năvƠo ngày 24/3/1882 Trongăth iăgianănƠyẳăMỹă vƠăchơuăÂu,ăćă7ăng iăth̀ăcóă1ăng iăch tăv̀ălao,ădoăv y,ăph́tăhi năc aăRobertăKochălƠă m tăb ́căngoặtăquanătr ngătrongăvi căkh ngăch ăvƠălọiătr ăcĕnăb nhănƠy.ăTr ́căđơy,ă laoăđ ợcăxemălƠăm tătrongănh ngăcĕnăb nhătruyềnănhi mănguyăhiểmănhấtătrênăth ăgíi,ă l uăhƠnhăv́iătỷăl ămắcăb nhăkh́ăcao,ăđặcăbi tẳăćcăn ́căthu căchơuăPhiăvƠăkhuăv că chơuăÁ,ătrongăđóăcóăVi tăNam Vi tă Namă đ́ngă th́ă 12 trongă ββă n ́că cóă s ă b nhă nhơnă laoă caoă trênă toƠnă c u.ă Trongă khuă v că Tơyă Th́iă B̀nhă D ng,ă Vi tă Namă đ́ngă th́ă baă sauă Trungă Qu că vƠă Philippinesăvềăs ăb nhănhơnălao,ăcũngănh ăs ăb nhănhơnălaoăxuấtăhi năhằngănĕm.ăHi nă nayănguyăc ănhi mălaoẳăn ́cătaăhằngănĕmăđ ợcă ́cătínhălƠă1,5%ădơnăs ă(̉ăćcătỉnhă phíaă Namă lƠă β%,ă ̉ăćcă tỉnhăphíaă Bắcă lƠă 1%).ă Trênă th că t ă chỉă s ă nguyă c ănhi mă laoă hƠngănĕmăcóăthểăcaoăh nă1,5%,ănh ăv y,ăćcăconăs ănêuătrênăcònăcóăthểăĺnăh n.ăĐiềuă đóăs ătĕngăthêmăs ăkhóăkhĕnăđ iăv́iăcôngăt́căphòngăch ngălaoăkhôngănh ngătrongăćcă nĕmăt́iămƠăcóăthểă trongăth iăgianăkh́ădƠi,ăcóăthể đ năhƠngăch cănĕm,ăngayăc ă khiẳă thiênăniênăkỷăḿiă[3, 35] 1.β.ăTÌNHăHÌNHăLAOăKHÁNGăTHU C B nhă laoă ngƠyă cƠngă tr̉ă nênă ph́că ṭpă vƠă cóă nhă h ̉ngă nặngă nềă khiă xuấtă hi nă thêmăviăkhu nălaoă kh́ngăthu căṭoă nênă m tăḍngăb nhăkhóăphòngă ch ng.ăĆcăch ngă Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc lao kháng thu căđ ợcăchiaălƠmăhaiăthể,ăđóălƠălaoăkh́ngăđaăthu că(Multi-drugs resistant - MDR)ăvƠălaoăkh́ngăthu căph̉ăr ngă(Extensively drug resistant - XDR),ănh ngăch ngă viăkhu nălaoăkh́ngăthu cănƠyălƠăngu nălơyănhi măvƠălƠăm iăđeăd aăchoăścăkh eăc aă c ngăđ ng.ăTheo ́cătínhăc aăT̉ăch́căYăt ăth ăgíiă(WHO),ătrênăth ăgíiăcóăkho ngă4βă ṿnă ng iă mắcă laoă kh́ngă đaă thu c,ă chi mă s ă l ợngă ĺnă nhấtă lƠă ̉ă khuă v că Tơyă Th́iă B̀nhăD ngăcóă15ăṿnătr ngăhợp,ăk ăđ nălƠăkhuăv căĐôngăNamăÁăvƠăsauăđóălƠăkhuă v căChơuăPhiăvƠăĐôngăÂu.ăM tăs ăch ngălaoăv aăkh́ngăđaăthu căv aăkh́ngăthu căph̉ă r ng,ă cóă thểă coiă lƠă lọiă siêuă kh́ngă thu c [17].ă T̀nhă h̀nhă laoă siêuă kh́ngă thu că cũngă ngƠyăcƠngătr̉ănênătr mătr ng,ădoăv yăt ăth́ngă11/β004ăđ nă11/β005,ăWHOăvƠăTrungă tơmăKiểmăsótăB nhăHoaăKỳăđưăphơnătích 17.890ăm uăđ măgửiăt ă40ăqu căgiaătrênătoƠnă th ăgíi,ăvƠăthấyărằngăcóăβ0%ătr ngăhợpălƠăkh́ngăđaăthu căvƠăβ%ătr thu căph̉ăr ng.ă ăVi tăNam,ătheoănghiênăćuăc aăCh có 32,5%ăćcătr ngăhợpălƠăkh́ngă ngătr̀nh Ch ngălaoăQu căgiaă ngăhợpăb nhălaoăḿiămangăviăkhu nălaoăkh́ngăthu că[1, 3] Viăkhu nălaoăkh́ngăthu călƠăm tăth́chăth́căĺn,ăđeăd aăcôngăcu căphòngăch ngă laoă trênă toƠnă c u,ă v̀ă ćcă thu că ch ngă laoă cóă hi uă qu ă hi nă nayă đangă b ă viă khu nă laoă kh́ngăḷiănhấtălƠăkh́ngăđaăthu că[10].ăThu căch ngălaoăcóănhiềuălọi,ăt́căd ngăc aăm iă thu cătrênătr căkhu nălaoăkhôngăgi ngănhau.ă Hi nănayăng iătaăchiaăthu căch ngălaoă thƠnhă haiă lọi:ă (1)ă ćcă thu că ch ngă laoă ch ă y uă (cònă g iă lƠă ćcă thu că ch ngă laoă lọiă m t,ăthu căch ngălaoăhƠngăđ u),ă(β)ăćcăthu căch ngălaoăth́ăy u (cònăg iălƠăćcăthu că ch ngălaoălọiăhai,ăthu căch ngălaoăhƠngăth́ăhai).ăTrongăkhiăćcăthu căch ngălaoălọiă m tălƠănh ngăthu căcóăhi uăqu ănhấtăvƠăcũngăítăđ cătínhănhất,ăth̀ăćcăthu căch ngălaoă hƠngăth́ăhaiălƠănh ngăthu căcóăt́căd ngăkémăh năḷiăcóăđ cătínhăcaoăvƠăgíăthƠnhărấtă đắt.ă ăNewăYork,ăchiăphíăđiềuătr ăb nhănhơnănḥyăv́iăthu căchỉămấtăβ.000ăUSDătrongă khiă đóă điềuă tr ă b nhă nhơnă kh́ngă thu că h tă β50.000ă USD.ă Hi nă nayă s ă tửă vongă hƠngă nĕmădoălaoătrênăth ăgíiăcònăĺnăh năs ătửăvongădoăHIV,ăs tărétăvƠăćcăb nhănhi tăđ́iă c ngăḷi.ăT̉ăch́căYăt ăTh ăgíiăđưănh năđ nhăb nhălaoăhi nănayăđưăquayătr̉ăḷiăvƠătr̉ă nênăt iăt ăh năb̉iăs ăkh́ngăthu căc aăviăkhu nălaoă[17] Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc K T LU N K tăqu ăgi iătr̀nhăt ăgenăkatG c aă8βăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngăthu c,ătrongăđóă 64ăch ngăkh́ngăisoniazid, 46 ch ngăkháng rifampicin choăthấy,ă65/82 (79,3%) m uăx yăraăđ tăbi n gen katG,ăđ tăbi năcóăthểăx yăraẳăm tăđiểmăhoặcănhiềuă điểmătrênăđọnăgenăquanătơm,ă47/64ă(7γ,4%)ăch ngăkh́ngăINHăx yăraăđ tăbi nă ṭiăcodonăγ15 Đ iăv́iăgenărpoB, 51/82 (62,2%) ch ngăkh́ngăthu căchoăthấyăđ tăbi năṭiăm tă s ăv ătríăriêngăbi tătrongăvùngănóngă81ăbp Trongăt̉ngăs ă51ăch ngăkh́ngăthu că x yăraăđ tăbi năṭi vùngănóngă81ăbpăchoăthấyăđ tăbi năx yăraăm tăs ăv ătríăcodonă kh́că nhau,ă trongă đóă th ngă gặpă nhấtă ṭiă v ă tríă codonă 5γ1 (37,5%) sauă codon 526 (22,2%) Ćcăm uănḥyăc măv́iă thu căkh́ngăsinhăvƠăch ngăchu nă qu căt ăHγ7Rvăđềuăkhôngăph́tăhi năđ tăbi nănƠoătrênăgenănghiênăću T iă uă hóaă thƠnhă côngă multiplexă real-timeă PCRăph́tă hi n nhanhă viă khu nă laoă kh́ngăthu c K tăqu ăthửănghi măph nắngămultiplexăreal-time PCR phát hi nă đ tă bi nă liênă quană kh́ngă thu că cóă đ ă t ngă đ ngă 100%ă soă v́iă ph pháp x́căđ nhăđ tăbi năbằngăćchăgi iătr̀nhăt ăgen 60 ngă Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc KI N NGH C nă nghiênă ćuă v́iă s ă l ợngă ch ngă viă khu nă laoă ĺnă h nă đểă cóă thểă đ́nhă gíă chínhăx́căh nătỷăl ,ăv ătrí,ăvƠăt ngăquanăkh́ngăthu căc aăćcăđ tăbi năcóăthểă x yăraătrênăgenărpoB katG Thửă nghi mă quiă tr̀nhă multiplex real-timeă PCRă ph́tă hi nă đ ngă th iă γă đ tă bi nă (katG315, rpoB526 rpoB531) để ph́tă hi nă viă khu nă laoă kh́ngă thu că (isoniazidăvƠărifampicin)ăchoăćcăc ăs̉ăkh́căđểănơngăcaoăhi uăqu ăch năđónălaoă trongăn ́c 61 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc TẨI LI U THAM KH O Ti ng Vi t Đặngă Đ́că Anhă (β001),ă Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch số thể bệnh lao,ăLu nắnăTi năsƿăsinhăh c Nguy năĐ̀nhăB ngă(199β),ăVi sinh vật y học, NhƠăxuấtăb năH căvi năQuơnăy B ă Yă t ,ă Trungă tơmă phòngă ch ngă laoă qu că giaă (β006),ă Báo cáo tổng kết chương trình chống lao quốc gia năm 2005, NhƠăxuấtăb năYăh c,ăHƠăN i Nguy nă Th ă Chính,ă Tr ngăTh ă Hòaă (β005),ă Vi sinh vật y học, NhƠă xuấtă b nă Đ̣iă h căQu căgiaăHƠăN i,ăHƠăN i Nguy nă Lơnă Dũng,ă Nguy nă Đ̀nhă Quy n,ă Pḥmă Vĕnă Tyă (β00γ),ă Vi sinh vật học, NhƠăxuấtăb năGíoăd c,ăHƠăN i Nguy nă Vĕnă H ngă (β001),ă Nghiên cứu số đặc điểm sinh học Mycobacterium tubeculosis phân lập Viện lao Bệnh phổi,ăLu nắnăTi năsỹă Yăh c Tr năVĕnăŚngă(1999),ăVi khuẩn lao kháng thuốc cách phòng điều trị,ăNhƠăxuấtă b năGíoăd c,ăHƠăN i PḥmăHùngăVơnă(β009),ăPCR real-time PCR, vấn đề áp dụng thường gặp,ăNhƠăxuấtăb năYăh c,ăThƠnhăph ăH ăChíăMinh Ti ng Anh Ahmad,ă S.,ăFares,ă E.,ă Araj,ă G.F.,ă Chugh,ă T.D.,ă Mustafa,ă A.S.ă (β00β),ă ”Prevalenceă of S315T mutation within the katG gene in isoniazid-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis isolatesă fromă Dubaiă andă Beirut”, International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 6(10), pp 920-926 62 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 10 Ahmad,ăS.,ăMokaddas,ăE.ă(β009),ă“Recentăadvancesăin the diagnosis and treatment of multidrug-resistantătuberculosis”,ăRespir Med, 103(12), pp 1777-1790 11 Ambur, O.H., Davidsen, T., Frye, S.A., Balasingham, S.V., Lagesen, K., Rognes, T., Tønjum, T.ă (β009),ă “Genomeă dynamicsă ină majoră bacterială pathogens”,ă FEMS Microbiol Rev, 33(3), pp 453-470 12 Ani,ă A.E.ă (β008),ă “Advancesă ină theă laboratoryă diagnosisă ofă Mycobacterium tuberculosis”,ăAnn Afr Med, 7(2), pp 57-61 13 Argekar, A.P., Kunjir, S.S., Purandare, K.S (1996), “Simultaneous determination of rifampicin, isoniazid and pyrazinamid by high performance thin layer chromatography”,ăJ Pharm Biomed Anal., 14, pp 1645-1650 14 Asgharzadeh,ă M.,ă Kafil,ă H.S.ă (β007),ă ”Currentă trendsă ină moleculară epidemiologyă studies of Mycobacterium tuberculosis”, Biotechnol Mol Biol Rev., 2(5), pp 108-115 15 Aslan, G., Tezcan, S., Serin, M.S., Emekdas, G.ă (β008),ă ”Genotypică analysisă ofă isoniazid and rifampicin resistance in drug-resistant clinical Mycobacterium tuberculosis complexăisolatesăinăsouthernăTukey”,ăJpn J Infect Dis., 61(4), pp 255-60 16 Bahrmand, A.R., Titov, L.P., Tasbiti, A.H., Yari, S., Graviss, E.A (2009), “Highlevel rifampin resistance correlates with multiple mutations in the rpoB gene of pulmonaryă tuberculosisă isolatesă fromă theă Afghanistană borderă ofă Iran”, J Clin Microbiol., 47(9), pp 2744-2750 17 Balganesh,ăT.S.,ăAlzari,ăP.M.,ăCole,ăS.T.ă(β008),ă“Risingăstandardsăforătuberculosisă drugădevelopment”.ăTrends Pharmacol Sci., 29(11), pp 576-581 18 Barry, C.E., Boshoff, H.I., Dartois, V., Dick, T., Ehrt, S., Flynn, J., Schnappinger, D.,ă Wilkinson,ă R.J,ă Young,ă D.ă (β009),ă “Theă spectrumă ofă latentă tuberculosis:ă 63 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc rethinking the biology and interventionăstrategies”, Nat Rev Microbiol., 7(12), pp 845-855 19 Borrell,ăS.,ăGagneux,ăS.ă(β009),ă“Infectiousness,ăreproductiveăfitnessăandăevolutionă of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis”,ă Int J Tuberc Lung Dis., 13(12), pp 1456-1466 20 Campbell, E.A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair, S., Goldfarb, A., Darst,ăS.A.ă(β001),ă”Structurală mechanismăforărifampicinăinhibitionă ofăbacteriaă RNAăpolymerase”,ăJ Cell 104, pp 901-912 21 Caws M., Duy, P.M., Tho, D.Q., Lan, N.T.N., Hoa, D.V., Farrar, J (2006), ”Mutationsă prevalentă amongă rifampicină andă isoniazidă resistantă Mycobacterium tuberculosis isolatesă fromă aă hospitală ină Vietnam”,ă J Clin Microbiol., 44, pp 2333-2337 22 Cavusoglu, C., Hilmioglu, S., Guneri, S., Bilgic, A (β00β),ă ”Characterization of rpoB mutations in rifampin ậ resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis fromă Turkeyă byă DNAă sequencingă andă lineă probeă assay”.ă J Clin Microbiol 40, pp 4435-4438 23 Chan, E.D., Bai, X., Kartalija, M., Orme, I.M., Ordway, D.J (2010),ă“Hostăimmuneă response to rapidly-growing mycobacteria, an emerging cause of chronic lung disease”,ăAm J Respir Cell Mol Biol., [Epub ahead of print] 24 Cooksey,ăR.,ăMorlock,ăG.,ăGlickman,ăS.,ăCrawford.ăJ.ă(1997),ă“Evaluationăofăaălineă probe assay kit for characterization of rpoB mutations in refampin resistant Mycobacterium tuberculosis isolatesăfromăNewăYorkăcity”,ăJ Clin Microbiol., 35(5), pp 1281-1283 64 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 25 Dale, J.W., Nor, R.M., Ramayah, S., Tang, T.H., Zainuddin, Z.F (1999), “Moleculară epidemiology ofă tuberculosisă ină Malaysia”,ă J Clin Microbiol., 37(5), pp 1265-1268 26 de Viedma, D.G., Infantes, S.M.D., Lasala, F., Chaves, F., Alcala, L., Bouza, E (β00β),ă “Newă real-time PCR able to detect in a single tube multiple rifampin resistance mutations and high-level isoniazid resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”,ăJ Clin Microbiol., 40, pp 988-995 27 Espasa, M., González-Martín J., Alcaide, F., Aragón, L.M., Lonca, J., Manterola, J.M., Salvadó, M., Tudó, G., Orús, P., Coll, P.ă (β005),ă “Directă detectionă ină clinical samples of multiple gene mutations causing resistance of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampicină usingă fluorogenică probes”.ăJ Antimicrob Chemother., 55(6), pp 860-865 28 Espitia, C., Laclette, J.P., Mondragón-Palomino, M., Amador, A., Campuzano, J., Martens, A., Singh, M., Cicero, R., Zhang, Y., Moreno, C (1999),ă “Theă PEPGRS glycine-rich proteins of Mycobacterium tuberculosis: a new family of fibronectin-bindingăprotein”,ăMicrobiology, 145, pp 3487-3495 29 Hahn,ă Y.,ă Shin,ă S.ă (β001),ă “Electrochemicală behavioră andă diffenrentială pulseă polarographic determinationă ofă rifampicină ină pharmaceuticală preparations”,ă Arch Pharma Res., 24(2), pp 100-104 30 Hillemann, D., Weizenegger, M., Kubica, T., Richter, E., Niemann, S (β005),ă“Useă of the genotype MTBDR assay for rapid detection of rifampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis complexăisolates”,ăJ Clin Microbiol., 43(8), pp 3699-3703 31 Marín, M., García de Viedma D., Ruíz-Serrano, M.J., Bouza, E.ă (β004),ă “Rapidă Direct Detection of Multiple Rifampin and Isoniazid Resistance Mutations in 65 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Mycobacterium tuberculosis in Respiratory Samples by Real-Timeă PCR”.ă Antimicrob Agents Chemother., 48(11), pp 4293-4300 32 Matsiota-Bernard,ăP.,ăVrioni,ăG.,ăandăMarinis,ăE.ă(1998),ă“CharacterizationăofărpoB Mutations in Rifampin-Resistant Clinical Mycobacterium tuberculosis Isolates fromăGreece”,ăJ Clin Microbiol., 36, pp 20ậ23 33 Miotto, P., Piana, F., Penati, V., Canducci, F., Migliori, G.B., Daniela Maria Cirillo, D.M.ă(β006),ă“Use genotype MTBDR assay for molecular detection of refampin and isoniazid resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical strains isolatesăinăItaly”,ăJ Clin Microbiol., 44, pp 2485-2491 34 Mokrousov, I., Otten, T., Vyshnevsky, B., Narvskaya, O (β00γ),ă “Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis ină sputumă smears”,ă Antimicrob Agents Chemother, 47, pp 22312235 35 Musser,ă J.M.ă (1995),ă “Antimicrobială agentă resistanceă ină Mycobacteria:ă Moleculară GeneticăInsights”,ăClinical Microbiology Review, 8(4), pp 496-514 36 Naga, S., Urvashi, B.S., Jyoti, A., Jitendra, N.P., Pradeep, S., Jyotish, C.S (2006), “Rapid detection of rifampicin-resistant Mycobacterium tuberculosis by inhouse,ă reverseă lineă blotă assay”,ă Diagn Microbio Infect Dis., 56(2), pp 133140 37 Noordhoek, G.T., Kaan, J.A., Mulder, S., Wilke, H., Kolk, A.H (1995),ă“Routineă application of the polymerase chain reaction for detect of Mycobacterium tuberculosis inăclinalăsamples”,ăJ Clin Pathol., 48, pp 810-814 38 Palomino, J.C., Leao, S.C., Ritacco, V (2007), Tuberculosis 2007 - from basic science to patient care www.tubercuosistextbook.com 66 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 39 Qian, L., Abe, C., Lin, T.P., Lin, T.P., Yu, M.C., Cho, S.N., Wang, S., Douglas, J.T.ă (β00β),ă “rpoB genotypes of Mycobacterium tuberculosis Beijing family isolatesăfromăEastăAsianăcountries”ăJ Clin Microbiol., 40, pp 1091-1094 40 Ramaswamy,ă S.,ă andă Musser,ă J.M.ă (1998),ă “Moleculară genetică basisă ofă antimicrobial agent resistance in Mycobacterium Tuberculosis” Tuber Lung Dis., 79(1), pp 3-29 41 Rattan,ă A.,ă Kalia,ă A.,ă Ahmad.ă (1998),ă ”Multidrugă - resistant Mycobacterium tuberculosis”ăEmerg Infect Dis., 4(2), pp 195-209 42 Sajduda, A., Brzostek, A., Poplawska, M., Augustynowicz-Kopee, E., Zwolska, Z., Niemann, S., Dziadek, J., Hillemann, D (2004), ”MolecularăCharacrerizationăofă Rifampin and Isoniazid-Resistant Mycobacterium tuberculosis Strains Isolated inăPoland”,ăJ Clin Micobiol, pp 2425-2431 43 Schecter, G.F., Scott, C., True, L., Raftery, A., Flood, J., Mase, S (2010), “Linezolidăinătheătreatment of multidrug-resistantătuberculosis”,ă J Clin Infect Dis 50(1), pp 49-55 44 Scholossberg, D (2006), Tuberculosis and nontuberculus Mycobacteria infections, Fifth edition McGraw-Hill, Medical Publishing Division 45 Shin, S.S., Naroditskaya, V., Sloutsky, A., Werner, B., Timperi, R., Bayona, J., Farmer, P.E., Becerra, M.C (2005),ă”rpoB gene mutations in clinical isolates of multidrug resistance in Mycobacterium tuberculosis ină Northernă Lima,ă Peru”,ă Microb Drug Resist, 11(1), pp 26-30 46 Shitrit,ăD.,ăVertenshtein,ăT.,ăShitrit,ăA.B.,ăShlomi,ăD.,ăKramer,ăM.R.,ă(β005),ă“Theă role of routine culture for tuberculosis during bronchoscopy in a nonendemic area:ăanalysisăofăγ00ăcasesăandăreviewăofătheăliterature”,ăInfect Control 33(10), pp 602-605 67 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 47 Telenti, A., Imboden, P., Marchesi, F., Lowrie, D., Cole, S., Colston, M.J., Matter, L., Schopfer, K., Bodmer, T (199γ),ă ”Detectionă ofă rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis”,ăLancet 341, pp 647-650 48 W.H.Oă(β004),ă“Anti-tuberculosis drugăresistantăinătheăworld”, WHO Report No 2, http://www.who.int/tb/piblication/who_htm_tb_2004_343/en/ 49 W.H.O., (2007),ă“Globalătuberculosis controlăsurveillance,ăplanning,ăfinancing”,ă WHO Report 2007 50 Wada, T., Maeda, S., Tamaru, A., Imai, S., Hase, A., Kobayashi, K (β004),ă“DualProbe Assay for Rapid Detection of Drug-Resistant Mycobacterium tuberculosis by Real-TimeăPCR” J Clin Microbiol, 42(11), pp 5277-5285 51 Woodford,ă N.,ă Ellington,ă M.J.ă (β007),ă “Theă emergenceă ofă antibiotică resistanceă byă mutation”,ăJ Clin Microbiol Infect., 13(1), pp 5-18 52 Zhang,ăY.,ăYew,ăW.W.ă(β009),ă“MechanismsăofădrugăresistanceăinăMycobacterium tuberculosis”, Tuberc Lung Dis., 13(11), pp 1320-1330 53 Zhu, X., Chang, S., Fang, K., Cui, S., Liu, J., Wu, Z., Yu, X., Gao, G.F., Yang, H., Zhu, B., Wang,ăJ.ă(β009),ă“MyBASE:ăaădatabaseăforăgenomeăpolymorphismăandă gene function studies of Mycobacterium”, BMC Microbiol, pp 9: 40 68 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc PH L C Pḥ ḷc Các công trình khoa h c có liên quan t i lu n văn đư công b Nghiêmă Ng că Minh,ă Nguy nă Vĕnă Bắc,ă Nguy nă H uă C ng,ă Nguy nă Trungă Nam,ăChuăHoƠngăHƠ,ăNguy năTh́iăS nă(β009)ăCh năđónăćcăch ngăviăkhu nă laoă kh́ngă rifampicină bằngă ph ngăph́pă x́că đ nhă đ tă bi nă trênă genă rpoB Tạp chí Công nghệ Sinh học 7(2): 251-256 Nguy năVĕnă Bắc,ăNguy nă H u C ng,ăChuă HoƠngăHƠ,ăLưă DuyăAnh,ăNguy nă Th́iăS n,ăNghiêmăNg căMinhă(β009)ăX́căđ nhăćcăch ngăviăkhu nălaoăkh́ngă isoniazidă bằngă ph ngă ph́pă x́că đ nhă đ tă bi nă trênă genă katG.ă H iă ngh ă Côngă ngh ăsinhăh cătoƠnăqu că749-752 Nguy nă Vĕnă Bắc,ă Cungă Th ă Ng că Mai,ă Nghiêmă Ng că Minhă (β010)ă Đặcă điểmă phơnă tửă c aă ćcă ch ngă viă khu nă laoă kh́ngă isoniazidă phơnă l pă ṭiă miềnă Namă ậ Vi tăNam.ăTạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A): 741-745 NghiêmăNg căMinh,ăNguy năVĕnăBắc (β010)ăViăkhu nălaoăkh́ngăthu căvƠăćcă ph ngăph́păph́tăhi n.ăTạp chí Công nghệ Sinh học 8(2): 133-144 69 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Pḥ ḷc Danh sách m u DNA tách t̀ ch ng vi khu n lao H c vi n Quơn Y cung c p DANHăSÁCHăM UăDNAăTÁCHăT ăCH NGăVIăKHU NăLAO - B NHăVI Nă LAO-B NHăPH IăTRUNGă NG Các ch ng kháng đ n thu c STT Mã DNA KQăKSĐ Mã ch ng 10 11 12 13 14 15 ĐO1-02 ĐOβ-02 ĐOγ-02 ĐO4-02 ĐO5-02 ĐO6-02 ĐO7-02 ĐO8-02 ĐO9-02 ĐO10-02 ĐO11-02 ĐO1β-02 ĐO1γ-02 ĐO14-02 ĐO15-02 H H H H H H H S S S S S S S S TB02-53 TB02-54 TB02-56 TB02-51 TB02-52 TB02-55 TB02-57 TB02-68 TB02-71 TB02-75 TB02-76 TB02-77 TB02-79 TB02-80 TB02-81 Các ch ng kháng đa thu c STT Mã DNA KQăKSĐ ĐA1-02 ĐAβ-02 ĐAγ-02 ĐA4-02 ĐA5-02 ĐA6-02 ĐA7-02 ĐA8-02 ĐA9-02 HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS HRS Mã ch ng TB02-101 TB02-105 TB02-107 TB02-110 TB02-111 TB02-112 TB02-113 TB02-115 TB02-116 70 N ngăđ DNA (ng/ul) 9,8 13,0 34,8 6,0 20,7 30,8 10,4 11,7 18,5 20,0 19,7 20,7 9,3 22,8 32,3 OD260/280 N ngăđ DNA (ng/ul) 44,0 7,2 6,8 18,5 8,2 8,0 36,3 5,7 5,2 OD260/280 1,83 2,06 1,70 2,79 1,67 1,64 1,65 1,84 1,79 1,72 1,80 1,79 1,91 1,76 1,74 1,89 2,1 2,06 1,94 1,8 2,1 1,76 1,89 1,98 Luận văn thạc sĩ ĐA10-02 ĐA11-02 ĐA1β-02 ĐA1γ-02 ĐA14-02 ĐA15-02 10 11 12 13 14 15 Nguyễn Văn Bắc HRS HRS HRS HRS HRSE HRSE TB02-117 TB02-118 TB02-122 TB02-124 TB02-130 TB02-133 6,9 14,0 7,2 10,1 9,8 6,8 1,91 1,85 1,80 1,92 2,06 1,77 DANHăSÁCHăM UăDNAăTÁCHăT ăCH NGăVIăKHU NăLAO- B NHăVI Nă TRUNGă NGăHU Các ch ng kháng đ n thu c STT Mã DNA KQăKSĐ Mã ch ng N ngăđ OD260/280 DNA (ng/ul) ĐO1-05 S TB05-49 15.19 1.64 ĐOβ-05 H TB05-79 16,9 1,84 ĐOγ-05 S TB05-84 6,5 1,39 ĐO4-05 S TB05-109 39,5 1,71 ĐO5-05 S TB05-110 33,3 1,75 ĐO6-05 S TB05-116 41,5 1,74 ĐO7-05 H TB05-130 12.0 1.79 ĐO8-05 H TB05-214 20.1 1.91 ĐO9-05 S TB05-223 38.4 1.79 10 ĐO10-05 H TB05-231 84.2 1.69 11 ĐO11-05 S TB05-237 129.7 1.52 12 ĐO1β-05 S TB05-243 53.2 1.75 13 ĐO1γ-05 H TB05-266 30.0 1.58 14 ĐO14-05 S TB05-278 22.0 2.14 15 ĐO15-05 S TB05-283 74.8 1.83 71 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Các ch ng kháng đa thu c STT Mã DNA KQăKSĐ 10 11 12 13 14 15 ĐA1-05 ĐAβ-05 ĐAγ-05 ĐA4-05 ĐA5-05 ĐA6-05 ĐA7-05 ĐA8-05 ĐA9-05 ĐA10-05 ĐA11-05 ĐA1β-05 ĐA1γ-05 ĐA14-05 ĐA15-05 HS HS HRSE HRS HRS HS HRSE HRSE HRSE HS HS HRS HS HRSE HR Mã ch ng TB05-1 TB05-77 TB05-97 TB05-108 TB05-117 TB05-138 TB05-146 TB05-147 TB05-172 TB05-199 TB05-213 TB05-220 TB05-221 TB05-225 TB05-254 N ngăđ DNA (ng/ul) 46,3 5.21 3,6 49,2 24,3 28.93 110,4 77,6 10.86 7.75 18.7 28.9 73.3 26.4 28.2 OD260/280 1,55 2.02 1,37 1,69 1,60 1.41 1,59 1,59 1.52 2.11 1.59 2.01 2.00 2.06 1.68 DANHăSÁCHăM UăDNAăTÁCHăT ăCH NGăVIăKHU NăLAO- B NHăVI N PHẠMăNG CăTHẠCH Các ch ng nh y c̉m v i thu c kháng sinh Stt Mã DNA N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 KQ Kháng sinhăđ Mưăch ng TB06-140 TB06-143 TB06-144 TB06-145 TB06-146 TB06-147 TB06-148 72 N ngăđ ă DNA (ng/ul) 66.9 82.3 67.8 60.9 38.5 32.7 4.7 OD260/280 1.72 1.89 1.96 2.0 1.85 1.94 1.79 Luận văn thạc sĩ 10 Nguyễn Văn Bắc N8 N9 N10 Các ch ng kháng đ n thu c Stt Mã KQ Kháng DNA sinhăđ 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ĐO1 ĐOβ ĐOγ ĐO4 ĐO5 ĐO6 ĐO7 ĐO8 ĐO9 ĐO10 ĐO11 ĐO1β ĐO1γ ĐO14 ĐO15 S H S S H S R S H S H H S S S Các ch ng kháng đa thu c Stt Mã KQ Kháng DNA sinhăđ 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 ĐA1 ĐAβ ĐAγ ĐA4 ĐA5 ĐA6 ĐA7 ĐA8 ĐA9 ĐA10 ĐA11 HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSRE HSR HSRE HSRE HSR TB06-149 TB06-150 TB06-151 19.1 57.8 62.0 1.96 1.86 1.98 Mưăch ng N ngăđ ă DNA (ng/ul) 52.8 50.6 10.8 3.6 13.0 304 4.5 6.1 8.2 120.6 6.7 57.4 31.4 3.5 66.5 OD260/280 N ngăđ ă DNA (ng/ul) 13.4 8.9 4.9 5.0 12.0 3.8 3.4 4.5 10.3 72.9 7.7 OD260/280 TB06-105 TB06-107 TB06-113 TB06-115 TB06-121 TB06-128 TB06-133 TB06-134 TB06-141 TB06-142 TB06-157 TB06-161 TB06-162 TB06-164 TB06-165 Mưăch ng TB06-22 TB06-23 TB06-26 TB06-27 TB06-28 TB06-31 TB06-33 TB06-35 TB06-36 TB06-37 TB06-38 73 1.74 1.59 1.76 2.25 1.68 1.85 2.89 2.36 2.2 1.91 2.01 1.85 1.90 1.46 1.91 1.89 1.82 1.86 1.8 1.8 2.08 1.56 1.75 1.99 1.77 1.98 Luận văn thạc sĩ 37 38 39 40 ĐA1β ĐA1γ ĐA14 ĐA15 Nguyễn Văn Bắc HSRE HSRE HSRE HSRE TB06-39 TB06-41 TB06-51 TB06-82 Các ch ng siêu kháng thu c Stt Mã KQăKh́ngăsinhăđ DNA Kháng dòng Kháng dòng 8.0 36.8 43.9 5.5 1.9 1.73 1.74 1.91 Mưăch ng N ngăđ ă DNA (ng/ul) OD260/280 41 42 43 S1 S2 S3 HSRE HSRE HSRE 44 S4 HSRE Ofx,Eto TB06-30 103.2 1.85 45 S5 HSRE Ofx, Th TB06-32 12.9 1.52 46 S6 HSRE TB06-34 14.0 1.83 47 48 S7 S8 HSRE HSRE TB06-40 TB06-204 26.7 18.9 1.57 1.83 49 S9 HSRE TB06-205 19.7 1.92 50 S10 HSRE TB06-217 4.7 2.12 51 S11 HSRE TB06-218 4.8 2.88 52 S12 HSRE TB06-219 19.3 2.07 53 S13 HSRE TB06-221 17.3 1.84 54 S14 HSRE TB06-222 28.2 1.85 55 S15 HSRE Ofx,Eto,Km, PAS Ofx Ofx,Cs,Eto, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, PAS Ofx,Cs,Km, PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Eto,Cs, Km,PAS Ofx,Th,Cs,K m,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS Ofx,Th,Eto, Cs, Km,PAS TB06-223 14.4 2.07 PAS Ofx Cs TB06-24 TB06-25 TB06-29 88.1 14.1 3.8 1.83 1.95 1.75 74