Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích của công tác chọn giống và nhân giống là cải tiến tiềm năng di truyền của cây trồng, vật nuôi...nhằm nâng cao năng suất, hiệu quả sản xuất nông nghiệp
146 Chương Công nghệ chuyển gen Thực vật I Khái niệm chung Trước đây, để tạo giống nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống để tổ hợp lại gen hai cá thể thực vật tạo lai mang tính trạng mong muốn Phương pháp thực cách chuyển hạt phấn từ sang nhụy hoa khác Tuy nhiên, phép lai chéo bị hạn chế thực cá thể loài (lai gần), lai thể khác loài (lai xa) thường bị bất thụ khơng thể tạo lai Tuy nhiên, lai gần phải nhiều thời gian thu kết mong muốn thơng thường tính trạng quan tâm lại khơng tồn lồi có họ hàng gần Ngày nay, công nghệ chuyển gen cho phép nhà tạo giống lúc đưa vào loài trồng gen mong muốn có nguồn gốc từ thể sống khác nhau, khơng lồi có họ gần mà cịn lồi xa Phương pháp hữu hiệu cho phép nhà tạo giống thực vật thu giống nhanh vượt qua giới hạn kỹ thuật tạo giống truyền thống Cây chuyển gen (transgenic plant) mang nhiều gen đưa vào phương thức nhân tạo thay thơng qua lai tạo trước Những gen tạo đưa vào (gen chuyển) phân lập từ lồi thực vật có quan hệ họ hàng từ loài khác biệt hoàn toàn Thực vật tạo gọi thực vật “chuyển gen” thực tế tất thực vật “chuyển gen” từ tổ tiên hoang dại chúng q trình hóa, chọn lọc lai giống có kiểm sốt thời gian dài Nhìn chung, việc ứng dụng chuyển gen có lợi ích rõ rệt sau: 147 - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những chuyển gen “thế hệ thứ nhất” giúp giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa học hướng đến việc tạo chuyển gen “thế hệ thứ hai” nhằm tăng giá trị dinh dưỡng có đặc điểm thích hợp cho cơng nghiệp chế biến Lợi ích trồng hướng trực tiếp vào người tiêu dùng Chẳng hạn như: - Lúa gạo giàu vitamin A sắt - Khoai tây tăng hàm lượng tinh bột - Vaccine thực phẩm (edible vaccine) ngô khoai tây - Những giống ngơ trồng điều kiện nghèo dinh dưỡng - Dầu ăn có lợi cho sức khoẻ từ đậu nành cải dầu Tuy nhiên, bên cạnh ưu điểm có nguy tiềm ẩn việc phát triển kỹ thuật Bao gồm: - Mối nguy hiểm việc vơ tình đưa chất gây dị ứng làm giảm dinh dưỡng vào thực phẩm - Khả phát tán gen biến nạp trồng sang họ hàng hoang dại - Sâu bệnh có nguy tăng cường tính kháng với chất độc tiết từ chuyển gen - Nguy chất độc tác động tới sinh vật loại sinh vật cần diệt, làm cân sinh thái Nhìn chung, cịn điểm cịn chưa rõ ràng chuyển gen với khả tạo giống trồng có giá trị kinh tế, cơng nghệ có vai trị khơng thể phủ nhận Tuy vậy, số vấn đề đáng lo ngại Để giải vấn đề kết luận thu phải dựa thơng tin tin cậy có sở khoa học 148 Cuối cùng, tầm quan trọng lương thực thực phẩm cho người, nên sách liên quan tới chuyển gen phải dựa tranh luận cởi mở trung thực có tham gia thành phần xã hội Khái niệm thực vật chuyển gen Muốn tạo sinh vật biến đổi gen (genetically modified organism-GMO) cần phải có phương pháp thích hợp để đưa DNA ngoại lai (foreign DNA) vào tế bào chúng Ở vi khuẩn, tế bào xử lý dung dịch muối calcium chloride Ở tế bào nấm men, tiếp nhận DNA tăng lên tế bào tiếp xúc với lithium chloride lithium acetate Tuy nhiên, phần lớn sinh vật bậc cao cần phải có phương pháp khác tinh vi Chuyển gen thực vật phát triển với phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật Nó trở thành phương tiện quan trọng để nghiên cứu sinh học thực vật Ngoài việc mở triển vọng chuyển gen có ý nghĩa kinh tế vào trồng, kỹ thuật cho phép nghiên cứu cấu trúc điều khiển hoạt động gen Quá trình đưa DNA ngoại lai vào genome (hệ gen) sinh vật gọi trình biến nạp (transformation) Những biến nạp gọi biến đổi gen (genetically modified plant-GMP) Ứng dụng công nghệ gen công tác giống trồng đại có nhiều ưu điểm, chẳng hạn như: - Bằng việc biến nạp gen thu mang đặc tính xác định - Rào cản lồi khơng cịn có tác dụng, khơng gen từ thực vật mà từ vi khuẩn, nấm, động vật người chuyển thành công vào thực vật Về nguyên tắc thay đổi vùng điều khiển gen, promoter terminator Tuy nhiên, số trường hợp đòi hỏi thay đổi phù hợp codon Gen khởi động cho trình phiên mã Gen kết thúc trình phiên mã 149 - Những đặc điểm khơng mong muốn thực vật Chẳng hạn, tổng hợp chất độc chất gây dị ứng loại trừ công nghệ gen - Thực vật biến đổi gen lị phản ứng sinh học (bioreactor) sản xuất hiệu protein chất cần thiết dùng dược phẩm thực phẩm - Mở khả nghiên cứu chức gen trình phát triển thực vật trình sinh học khác Vì vậy, thực vật biến đổi gen có ý nghĩa nghiên cứu - Trong lai tạo giống đại, công nghệ gen giúp làm giảm mâu thuẫn kinh tế môi trường sinh thái Bằng việc sử dụng trồng kháng thuốc diệt cỏ giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật Mục đích nơng nghiệp đại khơng tăng suất mà cịn hướng đến lĩnh vực quan trọng sau: + Duy trì mở rộng đa dạng sinh học (biodiversity) + Tăng khả kháng (sức khỏe trồng chống chịu điều kiện bất lợi) + Nâng cao chất lượng sản phẩm + Cải thiện khả tích lũy dinh dưỡng + Tăng cường tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học + Tạo sản phẩm khơng gây hại mơi trường Tóm tắt lịch sử phát triển công nghệ chuyển gen thực vật Lịch sử phát triển công nghệ gen thực vật chắn có nhiều kiện quan trọng Ở nêu lên mốc có ý nghĩa đặc biệt nhằm làm rõ phát triển nhanh lĩnh vực này: - Trước hết, vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens sử dụng làm phương tiện vận chuyển DNA Bình thường vi khuẩn tạo nên khối u thực vật Một phần nhỏ Ti-plasmid có vi khuẩn này, gọi T-DNA, vận chuyển từ Agrobacterium vào hai mầm Năm 1980, lần DNA ngoại lai (transposon Tn7) chuyển vào thực vật nhờ A tumefaciens, nhiên T-DNA chưa thay đổi Năm 1983, nhiều nhóm 150 Từ kết thành cơng số lượng lồi biến nạp ngày tăng Lúc có thêm nhiều phương pháp khác để biến đổi gen: - Năm 1984, biến nạp tế bào trần (protoplast) ngô thực Ở thành tế bào phân giải enzyme, xuất tế bào trần Nhờ polyethylene glycol (PEG) xung điện (electroporation) mà DNA đưa vào tế bào trần - Năm 1985, lần biến đổi gen mơ tả có tính kháng thuốc diệt cỏ Một năm sau, người ta thành công việc tạo thực vật kháng virus Năm 1996, thí nghiệm biến đổi gen phép đưa đồng ruộng - Năm 1987, phương pháp biến nạp phi sinh học sử dụng Ở tế bào thực vật bắn phá hạt vàng wolfram bọc DNA ngoại lai Nhờ phương pháp mà biến nạp thành công mầm quan trọng lúa (1988), ngô (1990) lúa mỳ (1992) Cũng năm 1987, cà chua thuốc kháng côn trùng làm cho công nghệ gen đạt bước phát triển quan trọng Một thành công quan trọng khác điều khiển q trình chín cà chua, sau có tên FlavrSaver Năm 1994, lần cà chua biến đổi gen bán thị trường - Năm 1989, thành công việc chuyển gen mã hóa kháng thể vào thực vật, mà người ta tạo nên sản phẩm gen mong muốn Kết mở khả hoàn toàn mẽ cho việc sản xuất vaccine khả chống bệnh thực vật - Năm 1990, thành công việc tạo biến đổi gen bất dục đực, khơng có khả tạo hạt phấn Loại trồng có ý nghĩa lớn việc sản xuất hạt giống 151 - Từ năm 1991, thành phần carbohydrate thực vật biến đổi năm 1992 acid béo Cùng năm đó, lần thành phần alkaloid loại cà cải thiện, bước quan trọng thực vật việc tổng hợp nhóm hợp chất Những thực vật có ý nghĩa lớn việc thu nhận dược liệu Sau thực vật biến đổi gen xuất hiện, chất nhân tạo phân giải sinh học tổng hợp Điều cho phép hy vọng rằng, tương lai có thực vật có đặc tính mới, sử dụng bioreactor thực vật để sản xuất “nguyên liệu tái sinh” - Năm 1994, cà chua Flavr SavrR trồng biến đổi gen đưa thị trường Năm 1998, giới có 48 giống trồng biến đổi gen sản phẩm thị trường hóa Năm 1999, lúa biến đổi gen đưa với gen biến nạp Đến đầu năm 1999, giới có khoảng 9.000 thí nghiệm đồng ruộng cho phép, khoảng 1.360 EU Cuối cùng, số nhận xét việc thị trường hóa biến đổi gen nơng nghiệp Cho đến năm 1999, diện tích gieo trồng giới đạt 40 triệu Trong 20% ngơ, 50% đậu tương 1/3 diện tích bơng Mỹ Ngồi có 70% diện tích cải dầu Canada trồng với giống biến đổi gen Khoảng 90% thực vật biến đổi gen chống chịu thuốc diệt cỏ sâu bệnh hại Cần ý rằng, Mỹ sản phẩm đậu tương có 20.000 loại thực phẩm khác Điều cho thấy rằng, công nghệ gen ảnh hưởng đến sản xuất thực phẩm II Một số nguyên tắc việc chuyển gen Một số nguyên tắc sinh học Khi đặt mục đích thực thí nghiệm chuyển gen cần ý số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến trình chuyển gen sau: - Khơng phải tồn tế bào thể tính tồn (totipotency) - Các khác có phản ứng khơng giống với xâm nhập gen ngoại lai 152 - Cây biến nạp tái sinh từ tế bào có khả tái sinh khả thu nhận gen biến nạp vào genome - Mô thực vật hỗn hợp quần thể tế bào có khả khác Cần xem xét số vấn đề như: có số tế bào có khả biến nạp tái sinh Ở tế bào khác có hai trường hợp xảy ra: số tế bào tạo điều kiện phù hợp trở nên có khả năng, số khác hồn tồn khơng có khả biến nạp tái sinh - Thành phần quần thể tế bào xác định loài, kiểu gen, quan, giai đoạn phát triển mô quan - Thành tế bào ngăn cản xâm nhập DNA ngoại lai Vì thế, chuyển gen vào tế bào có thành cellulose thông qua Agrobacterium, virus bắn gen phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gen phương pháp xung điện, siêu âm vi tiêm - Khả xâm nhập ổn định gen vào genome không tỷ lệ với biểu tạm thời gen - Các DNA (trừ virus) xâm nhập vào genome tế bào vật chủ chưa đảm bảo liên kết ổn định với genome - Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào sang tế bào kia, nơi mà đưa vào - Trong đó, DNA virus xâm nhập vào genom chủ lại không liên kết với genome mà chuyển từ tế bào sang tế bào khác ngoại trừ mô phân sinh (meristem) Phản ứng tế bào với q trình chuyển gen Mục đích chuyển gen đưa đoạn DNA ngoại lai vào genome tế bào vật chủ có khả tái sinh biểu ổn định tính trạng Nếu trình biến nạp xảy mà tế bào không tái sinh thành cây, tái sinh diễn mà không kèm theo biến nạp thí nghiệm biến nạp chưa thành cơng Ở nhiều lồi thực vật, điều khó khăn phải xác định cho kiểu tế bào có khả tiếp nhận biến nạp Hạt phấn hay tế bào nỗn sau biến nạp dùng để tạo biến nạp hoàn toàn, thơng qua q trình thụ tinh bình 153 Từ nhiều thập kỷ qua người ta biết rằng, tính tồn thể tế bào thực vật tạo điều kiện cho tái sinh hoàn chỉnh in vitro qua trình phát sinh quan (hình thành chồi) hay phát sinh phôi Các chồi bất định hay phôi hình thành từ tế bào đơn hoạt hóa phận dễ dàng tiếp nhận biến nạp có khả cho biến nạp hồn chỉnh (khơng có tính khảm) Các bước chuyển gen Từ người ta khám phá thí nghiệm chuyển gen thực nhờ loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, nhà khoa học tin Agrobacterium chuyển gen vào tất trồng Nhưng sau kết thực tế cho thấy chuyển gen Agrobacterium thực ngũ cốc (một mầm) hàng loạt kỹ thuật chuyển gen khác phát triển kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bắn gen vi đạn (bombardement/gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation), silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gen qua ống phấn (pollen tube) Đến nay, nhờ cải tiến vector chuyển gen nên kỹ thuật chuyển A tumefaciens thành công ngũ cốc đặc biệt lúa Kỹ thuật trở nên kỹ thuật đầy triển vọng chuyển gen thực vật Quá trình chuyển gen thực qua bước sau : - Xác định gen liên quan đến tính trạng cần quan tâm - Phân lập gen (PCR sàng lọc từ thư viện cDNA từ thư viện genomic DNA) - Gắn gen vào vector biểu (expression vector) để biến nạp - Biến nạp vào E coli - Tách chiết DNA plasmid 154 - Biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác kể - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp - Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gen (PCR Southern blot) đánh giá mức độ biểu chúng (Northern blot, Western blot, ELISA thử nghiệm in vivo khác ) Nguyên liệu để thực biến nạp tế bào thực vật riêng lẽ, mơ hồn chỉnh Cản trở lớn tiếp nhận DNA phần lớn sinh vật thành tế bào Muốn làm thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzyme điều kiện thích hợp người ta tạo tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận DNA nói chung dễ dàng Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, tế bào đặt xung điện ngắn, xung điện làm xuất lỗ tạm thời màng tế bào, phân tử DNA vào bên tế bào Sau biến nạp người ta tách enzyme phân giải tế bào phát triển, thành tế bào tạo nên Các tế bào biến nạp nuôi cấy môi trường nhân tạo thích hợp với chất kích thích sinh trưởng để tạo nên hồn chỉnh Sau phương pháp phân tích genome PCR, Southern blot, Northern blot thực để tìm xác biến đổi gen Bên cạnh phương pháp biến nạp Agrobacterium xung điện, có hai phương pháp khác thường sử dụng để đưa DNA vào tế bào Phương pháp thứ vi tiêm: với pipet nhỏ người ta đưa phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp Phương pháp sử dụng tế bào động vật, sau người ta sử dụng cho tế bào thực vật Phương pháp thứ hai bắn vào tế bào vi đạn (microprojectile), thường vàng wolfram, bao bọc DNA Phương pháp gọi phi sinh học sử dụng thành công nhiều loại tế bào khác Ở động-thực vật chuyển gen, sản phẩm cuối thường tế bào biến nạp, mà thể biến nạp hoàn toàn 155 Phần lớn thực vật tái sinh dễ dàng nuôi cấy mô tế bào Tuy nhiên, tái sinh mầm ngũ cốc loại cỏ khác gặp vài khó khăn Từ tế bào biến nạp người ta tạo chuyển gen, tế bào mang DNA ngoại lai tiếp tục chuyển cho hệ sau sau nở hoa tạo hạt III Các hướng nghiên cứu số thành tựu lĩnh vực tạo thực vật chuyển gen Các hướng nghiên cứu Trong năm qua, phương pháp biến nạp gen thực vật có nhiều tiến Hiện nay, phịng thí nghiệm cơng nghệ gen bắt tay vào việc cải thiện đặc điểm di truyền cho số lồi trồng có giá trị nhờ công cụ sinh học tế bào sinh học phân tử Trong vài trường hợp đặc biệt (đậu tương, lúa, ngô bông) phương pháp biến nạp gen bị giới hạn genotype Một số trồng quan trọng khác, cần thiết cho nhu cầu sử dụng người dân nước phát triển ý Cơng nghệ di truyền thực vật bước ngoặt định Một số trồng quan trọng biến nạp gen; vài vấn đề kỹ thuật tồn tại, chúng bước giải Để có kết cần phải thay đổi sang phạm vi khác, phát tạo dịng gen mang tính trạng đa gen (multigenic traits) Một điều quên vấn đề nhận thức xã hội dự báo nguy tác động xấu đến môi trường sản phẩm có nguồn gốc từ cơng nghệ DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology) mang lại Hiện nay, công nghệ chuyển gen quan tâm thông qua quỹ tài trợ quan quốc tế chương trình Rockefeller Foundation (Mỹ), vấn đề thảo luận nhiều cần phải xác định phương thức tốt để chuyển lợi ích cơng nghệ biến nạp gen mang lại đến nước phát triển Cây biến nạp gen thu vào năm 1983 Điều cho phép nhận xét hai thập niên, công cụ công nghệ DNA tái tổ hợp sinh học tế bào giúp ích nhiều cho nhà tạo giống thực vật Việc lựa chọn phương thức sử dụng 160 Việc sử dụng marker kháng kháng sinh chống chịu thuốc diệt cỏ cho chuyển gen thường mối lo ngại công chúng lý phản đối công nghệ Các nhà khoa học Trung tâm Khoa học Thực vật Umeo (Thụy Điển) xây dựng hệ thống marker ưu việt để xác định trồng biến đổi gen mà không phụ thuộc vào marker truyền thống cách phát triển biện pháp dựa gen dao1, gen mã hóa D amino acid oxidase (DAAO) DAAO tác nhân làm trình tạo nhóm amin oxy hóa dãy D-amino acid, phương thức chọn lọc dựa mức độ độc tính Damino acid khác trao đổi chúng thực vật Mặc dù nghiên cứu thực Arabidopsis thaliana, người ta tin tưởng phương pháp chọn lọc sử dụng loại nông nghiệp quan trọng khác 1.10 L àm đất ô nhiễm Cây mù tạt Ấn Độ chuyển gen (GM) hút lượng selen dư thừa cánh đồng California Đây thử nghiệm thực địa số loại GM chống ô nhiễm Selen nguyên tố hóa học, gây độc thực vật hàm lượng chúng cao đất Đất canh tác số vùng bang California tưới tiêu mạnh nước hịa tan selen có đá phiến sét Khi nước bốc mặt đất, senlen tích tụ ngày nhiều Cây mù tạt Ấn Độ (Brassica juncea) vốn có khả kháng hấp thụ selen qua rễ Tuy nhiên, Terry cs (Đại học California) thúc đẩy thêm khả mù tạt cách bổ sung số gen tạo enzyme đói selen Kết loại thực vật GM hấp thụ selen cao gấp 4,3 lần so với mù tạt Ấn Độ dạng hoang dại, chúng thu hoạch 45 ngày sau trồng C uộc thử nghiệm thực địa nói tiến hành cẩn thận để đảm bảo khơng có họ hàng mù tạt Ấn Độ sinh trưởng xung quanh Hoa mù tạt GM hái chúng xuất 161 Hiện việc xử lý đất ô nhiễm mang tính thô sơ, chủ yếu đào đất chơn nơi khác rửa đất Cả hai phương pháp tốn kém, làm giảm chất lượng đất Việc sử dụng thực vật để loại bỏ chất nhiễm khỏi đất tốn song nhiều năm Chẳng hạn, dương xỉ Trung Quốc (Pteris vittata) sử dụng để hút thạch tín khỏi đất Nhưng dùng chuyển gen giúp tăng tốc tiến trình dọn nhiễm Tuy nhiên, khả GM lai với loại hoa màu khác điều đáng lo ngại Theo Rugh (Đại học Michigan) chuyển gen hấp thụ nhiều kim loại vào dùng để xử lý nhiễm, phải đảm bảo gen khơng xâm nhập vào hoa màu Nếu không, hoa màu hút nhiều kim loại, ảnh hưởng tới sức khỏe người tiêu dùng 1.11 L àm thức ăn chăn nuôi Một hệ trồng chuyển gen mới, thiết kế đặc biệt cho ngành chăn nuôi phát triển Những loại trồng thiết kế với thay đổi quan trọng hàm lượng thành phần (ví dụ: protein amino acid) hay thành phần thứ yếu (ví dụ: loại vitamin khống chất) Vì loại trồng chuyển gen dùng với mục đích làm thức ăn chăn nuôi nên khác với loại trồng bình thường, tiến trình chuẩn y loại trồng cần có thêm đánh giá an toàn chúng để người vật nuôi tiêu dùng Các sản phẩm tiềm tàng bao gồm loại đậu tương ngô chuyển gen, có hàm lượng dầu cao cung cấp nhiều lượng cho bò, lợn gia cầm Các nhà nghiên cứu tạo loại đậu tương ngô có hàm lượng loại amino acid khơng thay cao Ngoài ra, nghiên cứu khác tiến hành nhằm làm tăng hàm lượng phosphore thức ăn chăn nuôi Một số thành tựu lĩnh vực tạo thực vật chuyển gen 162 Nói chung, hầu hết lồi thực vật biến nạp gen Thông thường, hiệu biến nạp gen khác tùy thuộc vào loại trồng, dĩ nhiên q trình biến nạp gen cịn bị hạn chế nhiều loài Ở giới thiệu kết biến nạp gen thành công giống trồng quan trọng Bảng 5.1 Một số loại trồng chuyển gen quan trọng Sản phẩm Đặc điểm Cải dầu Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng laurate cao, hàm lượng oleic acid cao Ngô Chống chịu chất diệt cỏ, kháng côn trùng Bông Chống chịu chất diệt cỏ, kháng côn trùng Khoai tây Kháng côn trùng, kháng virus Đậu tương Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng oleic acid cao Bí Kháng virus Cà chua Chín chậm Lúa Chống chịu chất diệt cỏ, sản xuất vitamin A Đu đủ Kháng virus 2.1 Các trồng quan trọng phát triển Cây ngô Hiện nay, ngô biến đổi gen để mang tính trạng kháng trùng chống chịu thuốc diệt cỏ Dùng phôi ngô nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi để tái sinh hữu thụ mang gen bar biến nạp Sử dụng phương pháp bắn gen chọn lọc thuốc diệt cỏ bialaphos cho kết mô callus phát sinh phôi biến nạp gen Các biến nạp gen hữu thụ tái sinh, ổn định di truyền biểu gen 163 Gần đây, kết biến nạp gen gián tiếp ngô nhờ Agrobacterium thông báo Các thể biến nạp gen dịng ngơ lai gần (inbredline) A188 tái sinh sau đồng nuôi cấy (cocultivation) binary vector với phôi non Tần số biến nạp thông báo dòng A188 khoảng 5-30% Các thể lai hệ thứ dòng A188 dòng lai gần khác biến nạp với tần số khoảng 0,4-5,3% (tính theo số biến nạp gen độc lập/phơi) Cây lúa Chuyển gen lúa tập trung vào tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ sản xuất vitamin A Kết tái sinh lúa biến nạp gen xung điện PEG thông qua nuôi cấy protoplast thông báo lần cách khoảng 10 năm Các nghiên cứu sau sử dụng hai kỹ thuật để biến nạp gen vào protoplast phục hồi biến nạp gen hữu thụ Tuy nhiên, hạn chế hai phương pháp phải xây dựng phương thức tái sinh từ tế bào đơn Mặc dù phương thức dùng cho số giống lúa thuộc loài phụ japonica (ví dụ: Taipei 309) hầu hết giống japonica ưu tú phần lớn giống indica khó tái sinh từ protoplast Phương pháp bắn gen cho phép thực biến nạp gen hiệu lúa kiểu gen độc lập, 40 giống biến nạp gen thành công Mẫu vật sử dụng phôi non callus có nguồn gốc từ hạt trưởng thành Hygromycin B marker chọn lọc thường dùng cho lúa Tần số biến nạp cao tới 50% (tính theo số biến nạp gen có nguồn gốc độc lập/số mẫu bắn gen) Gần đây, kỹ thuật biến nạp gen lúa thông qua Binary vector: vector hai nguồn, vector trước hết lắp ghép vào tế bào E coli sau chuyển tồn vào tế bào Agrobacterium phương thức giao phối ba (triparental matting) để tự nhân lên tồn Agrobacterium 164 Cây lúa sản sinh hợp chất caroteoid chuyển thành vitamin A phận có màu xanh cây, nhiên hạt gạo mà người dùng lại hợp chất Chính thiếu hụt vitamin A thường xảy nơi sử dụng gạo làm lương thực Gạo vàng TM loại ngũ cốc chuyển gen có khả nâng cao hàm lượng vitamin A bữa ăn hàng ngày Loại gạo có khả sản sinh lưu giữ chất βcarotene Nó đặt tên gạo vàng TM nội nhũ (chất bột bên hạt gạo) có màu vàng nhạt, chất β-carotene tạo Cây đậu tương Đậu tương loại trồng lâu đời trồng Trung Quốc từ năm 3.000 trước công nguyên Đây loại chứa dầu đem lại lợi ích kinh tế to lớn giới Hạt đậu tương có chứa tỷ lệ amino acid không thay nhiều thịt, đậu tương loại trồng lương thực quan trọng giới Đậu tương biến đổi gen để mang tính trạng khả chống chịu thuốc diệt cỏ có hàm lượng oleic acid cao Những cố gắng đậu tương biến nạp gen tập trung việc tái sinh từ protoplast nuôi cấy dịch huyền phù phát sinh phôi Mặc dù có thành cơng ban đầu, tiến triển cơng việc chậm việc thu hồi chuyển gen cịn gặp nhiều khó khăn Cơng nghệ chuyển gen đậu tương có triển vọng nhờ phát triển tối ưu hóa kỹ thuật bắn gen (vi đạn) Thực tế, đậu tương dùng mơ hình để phát triển kỹ thuật cho nhiều lồi trồng khó áp dụng công nghệ di truyền Kết đậu tương thu hồi thành công chuyển gen nhờ Agrobacterium Phương thức dựa vào phát sinh chồi từ mầm giống Peking chọn lọc cho tính mẫn cảm với Agrobacterium Các mẫu mầm xâm nhiễm với 165 Để biến nạp gen vào giống đậu tương khác người ta phối hợp hai yếu tố: genotype đơn giản-phương thức tái sinh độc lập (dựa sở tăng sinh cụm chồi từ vùng chung quanh mô phân sinh trụ phôi) với tăng gia tốc vi đạn (particle) có phóng điện để phân phối DNA ngoại lai Hàng trăm đậu tương có nguồn gốc độc lập thu kết biến nạp cho nhiều phenotype khác Nói chung, dịng đậu tương chuyển gen có nhiều gen biến nạp (số khoảng từ 1-50 thường thay đổi từ 2-10) Phân tích Southern blot hệ sau gen phức cho thấy tất tách rời, thể biến nạp sơ cấp diện kết biến nạp độc lập tái tổ hợp thống không xuất thường xuyên Cây Cây loại cung cấp sợi chủ yếu, chiếm tới nửa số lượng vải sợi giới Ngồi ra, lượng nhỏ hạt bơng dùng nguồn thực phẩm, thức ăn gia súc dầu ăn cho người vật nuôi Dầu hạt tinh chế trước dùng để loại bỏ chất gossypol độc hại cho người tiêu hóa động vật Phương thức biến nạp gián tiếp thông qua Agrobacterium tumefaciens kỹ thuật sử dụng để biến nạp gen vào giống Coker 312 (Umbeck 1987) Cây biến nạp gen giống thu hồi sau bắn gen vào dịch huyền phù nuôi cấy phát sinh phôi (Finer McMullen 1990) Hầu hết giống bơng có giá trị kinh tế khác tái sinh từ giai đoạn callus Một số giống tái sinh q trình thiên biến dị dịng vơ tính (somaclonal variation) Phương thức phân phối gen ngoại lai trực tiếp vào mô phân sinh trụ 166 “ACCELL ” phát triển người ta thu hồi thành công biến nạp gen Cây cải dầu Cây cải dầu biến đổi gen với mục đích cải thiện chất lượng dinh dưỡng, đặc biệt hàm lượng chất béo hòa tan loại Cây cải dầu đựơc trồng chủ yếu vùng phía tây Canada Ontario tây bắc Thái Bình Dương, trung tâm phía bắc vùng đơng nam nước Mỹ Ngoài ra, cải dầu trồng nước khác châu Âu Australia Cây cải dầu biến đổi gen mang tính trạng chống chịu thuốc diệt cỏ, có hàm lượng laurate oleic acid cao Khoai tây Khoai tây xem lương thực quan trọng thứ tư giới, với sản lượng hàng năm lên đến 300 triệu trồng 18 triệu hecta Hiện nay, phần ba sản lượng khoai tây giới nước phát triển Sau Liên Xô tan rã Trung Quốc trở thành nước sản xuất khoai tây lớn giới Ấn Độ đứng thứ tư Mặc dù sản lượng khoai tây châu Âu giảm xuống từ đầu năm 1960, bù vào sản lượng khoai tây châu Á nam Mỹ lại tăng lên sản lượng khoai tây giới ngày tăng Khoai tây biến đổi gen mang tính trạng khả kháng côn trùng kháng virus Cà chua Cà chua coi loại vườn phổ biến Cà chua thường dễ trồng số giống cho vụ mùa bội thu Chất lượng cà chua chín vượt xa tất loại khác có mặt thị trường chí mùa vụ Cây cà chua ACCELL Technology: công nghệ phân phối gen dựa sở thay đổi cường độ phóng điện thơng qua giọt nước nhỏ tạo thay đổi áp suất khơng khí lớn làm tăng gia tốc viên đạn vàng bọc DNA 167 Hình 5.1: Cà chua chuyển gen kháng vật ký sinh (bên phải) cà chua đối chứng (bên trái) Cây bí đỏ Bí đỏ mùa hè loại mềm hợp với khí hậu ấm áp, trồng nhiều nơi giới Bí đỏ mùa hè khác bí đỏ mùa thu mùa đơng chỗ chọn thu hoạch trước vỏ cứng chín Khơng mọc lan bí đỏ bí ngơ mùa thu mùa đơng, bí đỏ mùa hè mọc thành bụi rậm Một số khỏe có sức đề kháng tốt cho sản lượng cao Bí đỏ biến đổi gen kháng virus đặc biệt virus khảm dưa hấu (WMV) virus khảm vàng zucchini (ZYMV) Đu đủ Đu đủ loại trồng quan trọng khu vực Đông Nam Á, dùng làm thức ăn phổ biến hộ nông dân sản xuất 168 giống đu đủ chuyển gen kháng virus phát triển nước thuộc khu vực Đơng Nam Á Hình 5.2 : Ðu đủ chuyển gen kháng virus (trên) đu đủ đối chứng (dưới) 169 2.2 Các loại trồng phát triển Táo Trên giới có 6.000 loại táo Táo loại trái ưa thích khơng hương vị thơm mà cịn tốt cho sức khỏe Các nghiên cứu cho thấy ăn táo giảm nguy mắc bệnh ung thư, bệnh tim mạch béo phì Hiện nay, táo nghiên cứu biến đổi gen để mang tính trạng làm chậm q trình chín kháng sâu bệnh Chuối Trong số loại trồng nhiệt đới, chuối ưa thích hương vị hấp dẫn Ngồi ra, chuối cịn loại trái đa dụng, người ta chế biến thành nhiều sản phẩm khác Hiện có khoảng 1.000 loại chuối khác nhau, loại trái giàu dinh dưỡng khơng có chất béo có chứa hàm lượng kali chất xơ cao, nguồn cung cấp vitamin C chống oxy hóa Chuối nghiên cứu biến đổi gen để mang tính trạng kháng virus, giun trịn nấm có khả làm chín chậm Chuối loại dự kiến dùng làm vaccine thực phẩm (edible vaccine) để phòng chống nhiều loại bệnh dịch khủng khiếp nước phát triển Dứa Có nguồn gốc từ Trung Mỹ Nam Mỹ xem loại trái nhiệt đới bán rộng rãi nhất, chiếm tới 44% tổng kim ngạch bn bán trái nhiệt đới Tính tới tháng 1/2001, toàn giới trồng khoảng 12 triệu dứa Trong vòng 30 năm qua, sản lượng dứa hàng năm giới tăng lên gấp ba lần Hiện nay, số tổ chức nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền dứa Bên cạnh đó, người ta biến đổi gen dứa để tăng khả kháng sâu bọ virus, bổ sung tính trạng làm chậm chín Khoai lang 170 Khoai lang loại lương thực dễ trồng có vai trị quan trọng nước phát triển Trong điều kiện khí hậu bất lợi khơng cần đầu tư nhiều, sản lượng khoai lang hecta đem lại nguồn lượng dinh dưỡng cao trồng khác Cây trồng phát triển điều kiện khơ hạn nhiều tháng liền Khoai lang nghiên cứu biến đổi gen để kháng loại bệnh virus phá hoại (SPVDsweetpotato viral diseases) Dừa Sản phẩm có giá trị dầu dừa chiết xuất từ cùi dừa Hai nước sản xuất nhiều dầu dừa Indonesia Philippin với sản lượng cùi dừa khô thu năm 1999 2,91 triệu 1,37 triệu Ngồi ra, cịn có nhiều nước trồng dừa châu Á, châu Phi, nam Thái Bình Dương, Ấn Độ Dương, nam Mỹ vùng Caribê Chất làm cho dầu dừa trở nên hấp dẫn hàm lượng lauric acid cao Nhu cầu lượng acid lauric cao sử dụng để làm mứt, dầu ăn, mỹ phẩm, chất tẩy, bơ thực vật, dầu gội đầu xà Do vậy, giới nhu cầu dầu dừa luôn cao Ngành công nghiệp chế biến dừa bị de dọa phát triển số loại trồng biến đổi gen cho nhiều dầu, hạt cải dầu Việc nghiên cứu thúc đẩy phát triển sản xuất dầu dừa có ý nghĩa vơ quan trọng ngành công nghiệp chế biến dừa Tình hình trồng biến đổi gen trồng thương mại toàn cầu Cho đến nay, diện tích trồng biến đổi gen (GM) tồn cầu tiếp tục gia tăng mức 12-15% Trong giai đoạn năm kể từ năm 1996 tới năm 2003, diện tích trồng GM tồn cầu tăng gấp 40 lần (từ 1,7 triệu ha/1996 lên 67,7 triệu ha/2003), diện tích trồng nước phát triển tăng đáng kể Khoảng phần ba diện tích trồng GM tồn cầu năm 2004 (tương đương 20 triệu ha) diện tích trồng nước phát triển, nơi có mức tăng lớn 171 Trong giai đoạn 1996-2003, đặc tính chống chịu thuốc diệt cỏ trồng biến đổi gen liên tục giữ vị trí hàng đầu, đặc tính kháng sâu bệnh Năm 2003, đặc tính chống chịu thuốc diệt cỏ triển khai đậu tương, ngô, cải dầu (canola) bông, chiếm 73% (49,7/67,7 triệu tổng diện tích trồng biến đổi gen toàn cầu), 12,2 triệu (18%) dùng cho trồng Bt Diện tích trồng bơng ngơ có gen chống chịu thuốc diệt cỏ kháng sâu bệnh tiếp tục tăng, chiếm 8% (5,8 triệu ha) tăng so với 4,4 triệu năm 2002 Hai trồng giữ vị trí hàng đầu năm 2003 đậu tương chống chịu thuốc diệt cỏ, trồng với diện tích 41,4 triệu chiếm 61% tổng diện tích tồn cầu trồng nước; ngơ Bt với diện tích 9,1 triệu ha, tương đương với 13% diện tích trồng biến đổi gen giới trồng nước Diện tích trồng ngơ Bt tăng mạnh Mỹ Đáng ý năm 2004 Nam Phi trồng 84.000 ngô trắng Bt dùng làm thực phẩm, tăng 14 lần so với lần loại ngô giới thiệu Nam Phi vào năm 2001 Diện tích trồng ngơ bơng Bt/chống chịu thuốc diệt cỏ tăng mạnh, cho thấy xu hướng gen biến đổi chiếm tỷ lệ lớn diện tích trồng biến đổi gen phạm vi tồn cầu 3.1 Tiềm đóng góp trồng biến đổi gen Lý thuyết phục công nghệ sinh học mà cụ thể trồng biến đổi gen khả đóng góp chúng lĩnh vực sau: - Nâng cao sản lượng trồng góp phần đảm bảo an ninh lương thực, thức ăn gia súc chất xơ toàn cầu - Bảo toàn đa dạng sinh học cơng nghệ tiêu tốn đất có khả đem lại sản lượng cao - Sử dụng cách có hiệu yếu tố đầu vào đáp ứng yêu cầu phát triển bền vững nông nghiệp môi trường - Tăng khả ổn định sản xuất làm giảm thiệt hại phải gánh chịu điều kiện khó khăn 172 - Cải thiện lợi ích kinh tế xã hội loại bỏ tình trạng đói nghèo nước phát triển Kinh nghiệm năm từ 1996-2003, tổng diện tích 300 triệu trồng biến đổi gen trồng 21 nước toàn cầu, đáp ứng mong mỏi hàng triệu hộ nông dân lớn nhỏ nước công nghiệp phát triển Năm 2003, có chứng cho thấy trồng GM trồng thương mại hóa tiếp tục đem lại lợi ích đáng kể mặt kinh tế, môi trường xã hội cho hộ nông dân lớn nhỏ nước phát triển, diện tích trồng biến đổi gen toàn cầu tiếp tục tăng 10%, mức tăng hàng năm hai số Số hộ nông dân thu lợi từ trồng GM ngày nhiều đạt triệu người năm 2003, tăng so với triệu năm 2002 Đáng ý năm 2003, 85% tổng số triệu người trồng thu lợi từ trồng GM nông dân nghèo trồng Bt, chủ yếu tỉnh Trung Quốc nông dân nghèo Makhathini Flats, thuộc tỉnh KwaZulu Natal Nam Phi 3.2 Trị giá trồng biến đổi gen toàn cầu Năm 2003, trị giá thị trường trồng biến đổi gen toàn cầu ước tính đạt từ 4,5 tới 4,75 tỷ đơla, tăng so với số tỷ đôla năm 2002, chiếm 15% tổng trị giá 31 tỷ đôla thị trường bảo vệ trồng toàn cầu chiếm 13% tổng trị giá 30 tỷ đôla thị trường hạt giống toàn cầu Trị giá thị trường trồng GM toàn cầu dựa giá bán hạt giống biến đổi gen cộng với khoản chi phí công nghệ áp dụng khác Giá trị thị trường trồng GM toàn cầu dự kiến đạt tỷ đôla vào năm 2005 3.3 Nhận định trồng GM triển vọng chúng tương lai Mặc dù tranh cãi trồng biến đổi gen tiếp tục diễn Liên minh châu Âu người ta lạc quan tin diện tích số người trồng biến đổi gen toàn cầu tiếp tục gia tăng năm sau Với tất yếu tố có diện tích trồng GM tồn cầu vịng năm 173 nam Bán cầu Ấn Độ, Brazil tăng diện tích trồng Bt đậu tương chống chịu thuốc diệt cỏ Một số nước Uruguay chuẩn y sản phẩm ngô GM, loại ngô triển khai trồng nước khác Các sản phẩm chuyển gen mang đặc tính góp phần tạo tăng trưởng ổn định, bao gồm gen Bt (cry1Ac cry1Ab) hai đặc tính đưa vào ngơ Bắc Mỹ gen cry3Bb1 dùng để kiểm sốt sâu đục thân ngơ gen cry1Fa2 dùng để kiểm soát tốt sâu bọ cánh phấn giới thiệu Mỹ năm 2003 Ngoài ra, sản phẩm Bt gen ngô kháng côn trùng dự kiến đưa vòng năm tới Do vậy, diện tích trồng ngơ biến đổi gen tồn cầu với tính trạng kháng trùng chống chịu thuốc diệt cỏ đặc tính tổng hợp tăng đáng kể thời gian ngắn tới Với việc chuẩn y trồng đậu tương biến đổi gen Brazil vụ 2003/2004, diện tích trồng đậu tương biến đổi gen toàn cầu dự kiến có mức tăng trưởng cao thời gian tới Năm 2003, ba nước đông dân châu Á Trung Quốc, Ấn Độ Indonesia (tổng dân số 2,5 tỷ người GDP ba nước 1,5 nghìn tỷ đơla), ba kinh tế lớn châu Mỹ Latinh Argentine, Brazil Mexico (dân số 300 triệu người GDP 1,5 nghìn tỷ đơla) kinh tế lớn châu Phi Nam Phi (dân số 45 triệu người GDP 130 tỷ đôla) tất thức trồng trồng biến đổi gen Tổng số dân nước 2,85 tỷ người với GDP 3.000 tỷ đôla, người nhận lợi ích đáng kể mà trồng biến đổi gen đem lại Mười nước trồng biến đổi gen đứng đầu giới, nước trồng 50.000 năm 2003, có tổng dân số xấp xỉ tỷ người, gần nửa dân số giới GDP 13 nghìn tỷ đơla, khoảng nửa mức GDP toàn cầu 30 nghìn tỷ đơla Trong 174 Bán cầu châu Á, châu Phi, Mỹ La-tinh, bắc Mỹ, châu Âu châu Đại Dương Do vậy, bất đồng trồng biến đổi gen diện tích số lượng người trồng loại năm tiếp tục tăng hai số kể từ chúng giới thiệu vào năm 1996, năm 2003 có triệu nơng dân thu lợi từ công nghệ Tài liệu tham khảo Bains W 2003 Biotechnology from A to Z Oxford University Press, Inc New York, USA Birch RG 1997 Plant Transformation: Problems and strategies for practical applications Annual Review of Plant Physiology Plant Molecular Biology 48: 297-326 Chrispeels MJ and Sadava DE 2003 Plants, Genes, and Crop Biotechnology.2nd Edition Jones and Bartlett Publishers, Massachusetts, USA Ratledge C and Kristiansen B 2002 Basic Biotechnology Cambridge University Press, UK Walker JM and Rapley R 2002 Molecular Biology and Biotechnology 4th Edition The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK Website: http://www.biotechvn.com ... để biến nạp - Biến nạp vào E coli - Tách chiết DNA plasmid 154 - Biến nạp vào mô tế bào thực vật phương pháp khác kể - Chọn lọc thể biến nạp môi trường chọn lọc - Tái sinh biến nạp - Phân tích...147 - Tăng sản lượng - Giảm chi phí sản xuất - Tăng lợi nhuận nông nghiệp - Cải thiện môi trường Những chuyển gen “thế hệ thứ nhất” giúp giảm chi phí sản xuất Ngày nay, nhà khoa... thu hồi thành công biến nạp gen Cây cải dầu Cây cải dầu biến đổi gen với mục đích cải thiện chất lượng dinh dưỡng, đặc biệt hàm lượng chất béo hòa tan loại Cây cải dầu đựơc trồng chủ yếu vùng
