MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung rƣợu vang .3 1.1.1 Vài nét rượu vang 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang 1.2 Vi khuẩn lactic 1.2.1 Phân loại kiểu hình vi khuẩn lactic rượu vang .10 1.2.2 Vi khuẩn Oenococcus oeni .11 1.3 Quá trình lên men malolactic .12 1.3.1 Bản chất trình lên men malolactic 12 1.3.2 Vai trò trình lên men malolactic 14 1.3.3 Ảnh hưởng trình lên men malolactic đến thành phần chất lượng rượu vang 15 1.4 Các kỹ thuật nhằm cải thiện trình lên men malolactic 18 1.4.1 Sử dụng chế phẩm vi khuẩn lactic 18 1.4.2 Sử dụng chế phẩm enzim malolactic để chuyển hoá axít malic .19 1.4.3 Sử dụng chủng nấm men tái tổ hợp gen malolactat decacboxylaza sản xuất vang .20 1.5 Các phƣơng pháp lên men malolactic khả ứng dụng để nâng cao chất lƣợng rƣợu vang 21 CHƢƠNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .25 2.1 Nguyên liệu, chủng vi sinh hóa chất .25 2.1.1 Nguyên liệu .25 2.1.2 Vi sinh vật 25 2.1.3 Môi trường phân lập vi sinh vật .25 2.1.4 Hóa chất 26 2.1.5 Dụng cụ máy móc, thiết bị 26 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .26 2.2.1 Phương pháp công nghệ 26 2.2.2 Phương pháp vi sinh vật 27 2.2.3 Phương pháp phân tích lý hóa 28 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang 31 3.1.1 Phân lập chủng vi khuẩn malolactic Ninh Thuận 31 3.1.2 Xác định khả lên men malolactic chủng vi khuẩn phân lập 33 3.1.3 Xác định khả chịu SO2 02 chủng vi khuẩn malolactic phân lập được36 3.2 Nghiên cứu trình lên men malolactic Chủng NT9 Chủng NT12 môi trƣờng rƣợu vang non .37 3.3 Nghiên cứu khả tạo chất thơm chủng vi khuẩn malolactic 42 3.4 Nghiên cứu xác định điều kiện tối ƣu trình lên men malolactic O.oeni NT12 44 3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng chất dinh dưỡng bổ sung đến trình lên men malolactic 44 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic 47 3.4.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang 49 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân tích rượu vang đỏ trước sau ên men ma o actic 15 Bảng 3.1 Đặc tính sinh ý c c chủng vi khuẩn actic phân ập 31 Bảng 3.2 Đặc tính trao đổi chất c c chủng vi khuân actic phân ập 34 Bảng 3.3 Khả n ng ên men ma o actic chủng vi khuẩn phân ập 35 Bảng 3.4 Hàm ượng axít ma ic axít actic trước sau ên men Ma o actic môi trường nước nho axít (AG) su phit hóa với hàm ượng K2S2O5 bổ sung etano tới nồng độ 14%v/v 37 Bảng 3.5 Hàm ượng axít ma ic trước sau qu tr nh ên men ma o actic chủng vi khuẩn ma o actic môi trường rượu vang non 38 Bảng 3.6 Hàm ượng axít actic trước sau qu tr nh ên men ma o actic chủng vi khuẩn ma o actic môi trường rượu vang non 39 Bảng 3.7 Hàm ượng axít axetic trước sau ên men ma o actic chủng vi khuẩn malolactic .40 Bảng 3.8 Hàm ượng diaxety trước sau ên men ma o actic chủng vi khuẩn malolactic 41 Bảng 3.9 Một số chất bay tạo thành sau qu tr nh ên men ma o actic 02 chủng .43 Bảng 3.10 Thành phần dịch vang non sau ên men rượu 45 Bảng 3.11 Hàm ượng axít ma ic (g/ ) phân giải qu tr nh tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng kh c theo thời gian .46 Bảng 3.12 Ảnh hưởng nhi t độ đến s chuyển hóa axít ma o aic thành axít actic qu tr nh ên men ma o actic 48 Bảng 3.13 Thành phần rượu vang sau kết thúc qu tr nh ên men ma o actic .49 Bảng 3.14 Thời gian ên men hàm ượng axít malic, axít lactic sau qu tr nh ên men malolactic c c thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic kh c 51 Bảng 3.15 Rượu etano tạo thành hàm ượng đường sót sau qu tr nh ên men malolactic 52 Bảng 3.16 S tạo thành số chất bay tạo thành sau qu tr nh ên men malolactic 53 DANH MỤC CÁC HÌNH H nh 1.1 H nh dạng chuỗi chủng O.oeni .10 H nh 1.2 Qu tr nh trao đổi chất c c vi khuẩn actic ên men dị h nh .13 H nh 1.3 Cơ chế qu tr nh ên men ma o actic 133 H nh 1.4 C c yếu tố ảnh hưởng đến qu tr nh ên men ma o actic 17 H nh 2.1 Sơ đồ phân ập vi khuẩn ma o actic từ nguồn nguyên i u nho 27 H nh 3.1 So s nh hàm ượng axít ma ic trước sau qu tr nh ên men ma o actic chủng vi khuẩn ma o actic môi trường rượu vang non 38 H nh 3.2 So s nh hàm ượng axít actic trước sau qu tr nh ên men ma o actic chủng vi khuẩn ma o actic môi trường rượu vang non 39 H nh 3.3 So s nh hàm ượng axít axetic trước sau ên men ma o actic chủng vi khuẩn malolactic 41 H nh 3.4 So s nh hàm ượng diaxety trước sau ên men ma o actic chủng vi khuẩn malolactic 42 H nh 3.5 So s nh hàm ượng axit axetic tạo thành sau qu tr nh ên men ma o actic chủng 43 H nh 3.6 Hàm ượng axít ma ic phân giải qu tr nh tàng trữ có bổ sung dinh dưỡng kh c theo thời gian 46 H nh 3.7 So s nh s tạo thành rượu etano sau qu tr nh ên men malolactic 52 H nh 3.8 So s nh s tạo thành số chất bay sau qu tr nh ên men ma o actic 53 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AG Acid Grape - Nước nho axít CoA Coenzyme A CFU Colony forming unit - Đơn vị h nh thành khuẩn lạc HDL High density lipoprotein - Lipoprotein có tỷ trọng cao LAB Lactic acid bacteria - Vi khuẩn lactic MRS De Man, Rogosa and Sharp - Môi trường MRS NAD+ Nicotinamit Adenin Dinucleotide NADH Nicotinamit Adenin Dinucleotide Hydrogen EO Chế phẩm Essentia oenos OD Optical density - Mật độ quang MLF Melolactic fermentaeion - Lên men ma o actic MỞ ĐẦU Rượu vang đồ uống có cồn sản xuất từ qu tr nh ên men dịch nói chung mà phổ biến từ nho Do nho oại có thành phần ho học thích hợp cho nấm men ph t triển có hương thơm đ p ứng yêu cầu cho sản xuất rượu vang chất ượng cao Trải qua ịch sử h nh thành ph t triển âu đời, rượu vang nho với nồng độ rượu vừa phải từ 10-14%v đồ uống có ợi cho sức khỏe người với gi trị dinh dưỡng cao, hương vị thơm ngon ưa chuộng khắp nơi giới Từ nhiều n m nay, rượu vang nho trở thành thức uống phổ biến nước ta Thị trường rượu vang nước ph t triển, nhiên chưa đ p ứng yêu cầu chất ượng Theo số i u Tổng cục thống kê, kể từ n m 2010 đến nay, rượu vang nhập t ng khoảng 25%/ n m Trong đó, Ninh Thuận biết đến vùng trồng nho có sản ượng ớn nước, hi n trồng chủ yếu giống nho Red Cardinal thường dùng để n tươi để ên men rượu v cho màu sắc nhạt, không hấp dẫn Do vậy, chất ượng rượu vang Vi t Nam hi n chưa thật cao so s nh với rượu vang nhập hương vị sản phẩm chưa đạt tiêu chuẩn, màu sắc dễ bị nâu ho , sản phẩm bị ắng cặn…Với tiềm n ng thị trường ớn nước ta, vi c cải tiến công ngh để sản xuất rượu vang nho vấn đề quan tâm Nhiều nước giới giải vấn đề nghiên cứu hoàn thi n công ngh sản xuất rượu vang nho sâu àm rõ c c chế như: s chuyển hóa c c thành phần nho thành c c chất thơm rượu vang, t c động điều ki n môi trường đến s sinh trưởng ph t triển vi khuẩn ma o actic qu tr nh ên men ma o actic[26, 27]…Qu tr nh ên men rượu vang qu tr nh ên men th c hi n chủ yếu nhờ nấm men phần vi khuẩn actic có mặt nho thiết bị àm rượu Nấm men sử dụng h enzym m nh để chuyển hóa g ucoza số đường kh c thành rượu c c sản phẩm phụ kh c (rượu bậc cao, este, c c axít hữu ), vi khuẩn actic chuyển hóa axít ma ic thành axít actic CO2 qu tr nh ên men ma o actic Lên men ma o actic đóng vai trò quan trọng sản xuất rượu vang đỏ số oại vang trắng, qu tr nh thiếu vi c àm biến đổi c c thành phần hóa học, mang ại cho rượu vang hương vị đặc trưng Với điều ki n, công ngh sản xuất rượu vang Vi t Nam hi n nay, vi c phân ập tuyển chọn số chủng vi khuẩn actic để tối ưu hóa qu tr nh ên men ma o actic cần thiết Điều giúp c c nhà sản xuất rượu vang kiểm so t qu tr nh sản xuất rượu vang tốt hơn, giảm rủi ro tạo c c sản phẩm hỏng có chất ượng không ổn định, đồng thời àm đa dạng c c chủng oại rượu vang phục vụ cho nhu cầu người tiêu dùng Từ mở hướng nghiên cứu cho công ngh sản xuất rượu vang nho chất ượng cao Vi t Nam giải vấn đề th c tiễn ngành sản xuất rượu vang nước.V vậy, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn malolactic ứng dụng công nghệ sản xuất rượu vang” CHƢƠNG – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung rƣợu vang 1.1.1 Vài nét rượu vang Rượu vang thức uống có cồn sản xuất phương ph p ên men không chưng cất từ dịch nho Nhờ t c nhân ên men ( ên men giai đoạn) nhờ nấm men vi khuẩn actic ( ên men hai gian đoạn) tạo cho rượu vang có hương vị đặc trưng, gi trị dinh dưỡng cao hẳn c c oại rượu kh c Thuật ngữ “Rượu vang”- tiếng a tinh “vinum”, bắt nguồn từ chữ “vinea”, có nghĩa nho Trước tiên vi c sản xuất rượu vang tiến hành c ch ép dịch nho, sau ên men hoàn toàn t nhiên c c hang đ Người La Mã có công truyền b nghề trồng nho àm rượu sang Ph p Marsei es từ kỉ II, sau vùng Champagne Monse e Va ey vào khoảng kỉ IV Ph p bắt đầu xuất rượu vang sang Anh Đức vào kỉ XII Vào n m 1857, ần ịch sử, Louis Pasteur công bố nghiên cứu qu tr nh ên men, x c định rõ vai trò quan trọng nấm men qu tr nh ên men rượu s biến đổi ho sinh qu tr nh ên men nấm men [8] Đến có hàng tr m oại rượu vang kh c đ p ứng nhu cầu đa dạng người tiêu dùng Phân oại rượu vang d a màu sắc: vang màu vang trắng, c c oại vang màu th rượu vang đỏ có gi trị cao Ngày nguyên i u chế biến rượu vang mở rộng c c oại nguyên i u kh c nhau, phong phú màu sắc chất ượng Trải qua nhiều kỷ, rượu vang khẳng định vai trò với sức khỏe người Louis Pasteur nhiều ần khẳng định: “Rượu vang oại đồ uống v sinh có ợi cho sức khoẻ” Khoa học hi n ph t hi n rượu vang đỏ có chứa chất trans-resveratro chất chống oxi hóa, gặp vỏ nho đỏ (vỏ chứa khoảng 2µg trans-resveratrol) C c po ypheno Chất có t c dụng trung hòa c c t c nhân oxi hóa, chẳng hạn c c gốc t tạo thành qu tr nh trao đổi chất b nh thường tế bào C c gốc t gây hư hại mô không nhanh chóng oại bỏ Chính t c dụng nói trans-resveratro góp phần àm giảm nguy tử vong b nh nhồi m u tim người [30] 1.1.2 Công nghệ sản xuất rượu vang [7, 8, 12] Lên men qu tr nh trao đổi chất t c dụng c c enzyme tương ứng Tùy theo sản phẩm tích tụ sau qu tr nh ên men mà người ta chia c c kiểu ên men kh c Có hai h nh thức ên men ên men yếm khí ên men hiếu khí Lên men rượu qu tr nh ên men yếm khí với s có mặt nấm men, chúng chuyển hóa đường thành ethano CO2 Th c chất qu tr nh oxi ho khử có mặt c c enzyme nấm men N ng ượng sinh phục vụ cho hoạt động sống nấm men bị tiêu hao dạng nhi t [7] S thay đổi nhi t độ qu tr nh ên men dẫn tới sốc nhi t àm ảnh hưởng tới hoạt tính nấm men Do giữ nhi t độ ổn định qu tr nh ên men yếu tố quan trọng giúp qu tr nh ên men hoàn thành Nấm men nhạy cảm với nhi t độ giai đoạn đầu ph t triển nhân ên trở nên chống chịu tốt giai đoạn sau Do ên men rượu vang th giai đoạn đầu qu tr nh ên men nên tr nhi t độ 18-22oC sau cho phép t ng dần ên [7, 12] Nhi t độ ên men ban đầu qu cao nguyên nhân gây hi n tượng cuối qu tr nh ên men Qu tr nh ên men rượu chia àm hai thời kỳ chính: - Thời kỳ ph t triển sinh khối: giai đoạn với s có mặt oxy, tế bào nấm men ph t triển sinh khối - Thời kỳ ên men chuyển đường thành rượu CO2: giai đoạn nấm men hấp thụ c c chất dinh dưỡng sử dụng c c enzyme sẵn có m nh th c hi n xúc t c sinh học qu tr nh trao đổi chất để tr s sống, tạo thành rượu CO2 Sản phẩm thu hồi qu tr nh ên men phức tạp Ngoài ethano nhiều chất kh c este, rượu bậc cao, c c axit hữu cơ, g ycero , dầu fuse Tỷ c c sản phẩm phụ phụ thuộc vào điều ki n môi trường ên men Trong qu tr nh này, nấm men chuyển hóa đường thành rượu giải phóng CO2 t c dụng xúc t c enzyme nấm men tạo theo đường Eno pyruvat [7] Nho đỏ Nghiền/chà t ch cuống SO2 Cuống Su fite hóa Ngâm T ch dịch nho rỉ T ch cặn Nấm men Hi u chỉnh thành phần dich nho Hoạt hóa nấm men Lên men Vi khuẩn actic Lên ma o actic Cặn Ủ rượu Ổn định rượu Làm Rót sản phẩm Rượu Vang Cặn Bảng 3.11 Hàm lƣợng axít malic (g/l) đƣợc phân giải trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác theo thời gian Ngày 10 15 20 25 g/l 2,15 1,8 1,6 1,2 0,8 0,55 0,025 g/l 2,15 1,7 1,4 0,12 0,1 0,05 g/l 2,15 1,6 1,3 0,9 0,12 0,1 0,075 g/l 2,15 1,5 1,25 0,86 0,12 0,1 Nồng độ EO Ghi chú: Mẫu mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos Mẫu có bổ sung Essentials Oenos (EO) Hình 3.6 Hàm lƣợng axít malic đƣợc phân giải trình tàng trữ có bổ sung dinh dƣỡng khác theo thời gian Kết minh họa bảng 3.11 h nh 3.6 cho thấy có s kh c bi t rõ ràng mẫu đối chứng không bổ sung Essentials Oenos c c mẫu thí nghi m bổ sung Essentia s Oenos khả n ng phân giải axít ma ic thời gian ên men Ớ mẫu đối chứng, điều ki n dịch vang non không bổ sung dinh dưỡng, hàm 46 ượng axít ma ic ngày thứ 25 0,55 g/ , chứng tỏ qu tr nh ên men ma o actic chưa hoàn thành Tiếp tục cho mẫu ên men ngày hàm ượng axít ma ic giảm xuống không đ ng kể, 0,52 g/ (số i u không tr nh bày) Trong đó, mẫu bổ sung Essentia s Oenos, qu tr nh ên men ma o actic kết thúc 20 ngày, với hàm ượng axít ma ic ại thấp, 0,12 g/ S kh c mẫu thể hi n hai mẫu có nồng độ Essentia s Oenos cao (0,05 0,075 g/ ) th s khởi động vi khuẩn lactic ngày đầu nhanh phải cần đến 20 ngày th s phân giải axít ma ic gần cạn ki t (0,12 g/ ) V vậy, a chọn nồng độ Essentia s Oenos thấp 0,025 g/ để bổ sung cho qu tr nh ên men ma o actic 3.4.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình lên men malolactic Theo Henick - K ing nhiều t c giả, qu tr nh ên men ma o actic không đơn qu tr nh chuyển axít ma ic thành axít actic mà có ảnh hưởng ớn đển chất ượng cảm quan rượu vang Chất ượng cảm quan rượu cao hay thấp không phụ thuộc vào qu tr nh ên men rượu mà phụ thuộc nhiều vào qu tr nh ên men ma o actic, phải kể đến c c yếu tố chủng vi khuấn a chọn, điều ki n qu tr nh ên men [33] Nhi t độ có ảnh hưởng ớn đến tiến tr nh ên men ma o actic Tiến hành thí nghi m với mẫu ên men ma o actic bổ sung vi khuẩn actic c c điều ki n nhi t độ kh c Kết thời gian ên men ma o actic s h nh thành số tính chất quan trọng rượu vang tr nh bày bảng 3.12 Kết bảng 3.12 cho thấy ên men ma o actic nhi t độ 15°C không phù hợp v sau 45 ngày ên men, hàm ượng axít ma ic ại kh nhiều rượu vang (1,45 g/ ) Số ượng quần thể vi khuẩn ma o actic đạt từ đầu qu tr nh ên men có ý nghĩa quan trọng ên men ma o actic Nhi t độ thấp 15°C không thúc đẩy s ph t triển vi khuẩn không đủ sinh khối tạo enzym chuyển hóa axít ma ic thành axít actic 47 Bảng 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến chuyển hóa axít malolaic thành axít lactic trình lên men malolactic Nhiệt độ lên men (0C) Axit malic (g/1) Axit lactic (g/1) Axít bay (g/1) axít axetic) Thời gian lên men malolactic (ngày) 15 1,45 0,92 0,28 45 20 0,12 1,80 0,30 23 25 0,12 1,81 0,35 20 30 0,11 1,82 0,46 19 Từ bảng 3.12 cho thấy tất c c mẫu ên men từ 20 - 30°C có khả n ng chuyển ho axít ma ic thành axít actic tương đối tri t để, kh c thời gian ên men ma o actic Điểm kh c bi t ớn ên men 20, 25 30°C thời gian ên men ma o actic nhanh ngày Tuy nhiên, s kh c bi t h nh thành c c axít bay ại kh ớn mẫu Lên men nhi t độ 20°C cho hàm ượng axít bay thấp (0,30 g/1) nhi t độ 30°C, hàm ượng axít 0,46 g/1 Mặc dù ên men ma o actic nhi t độ thấp 20°C àm chậm thời gian so với 25°C ngày rõ ràng axít ma ic chuyển hóa tri t để, hàm ượng axít bay tạo ại giảm nhiều Chỉ tiêu axít bay biểu thị mạnh mẽ độ giảm chất ượng rượu vang Mặt kh c, theo nhiều nghiên cứu, ên men nhi t độ thấp àm giảm nguy bị nhiễm Do vậy, nhi t độ qu tr nh ên men ma o actic chọn 20°C Tiến hành ên men ma o actic điều ki n nhi t độ 20°C, có bổ sung chế phẩm Essentia s Oenos nồng độ 0,025 g/1, sau x c định thành phần rượu vang kết tr nh bày bảng 3.13 Kết bảng 3.13 cho thấy rõ ràng hàm ượng axít tổng số giảm đi, hàm ượng axít bay t ng ên không nhiều, axít ma ic axít actic hai thành phần bị thay đổi nhiều nhất, dư ượng axít ma ic ại dịch ên men không đ ng kể hàm ượng axít actic ại t ng ên đến 1,78 g/1 Điều góp 48 phần quan trọng vào tính chất cảm quan sản phẩm, àm rượu trở nên mềm mại ổn định Bảng 3.13 Thành phần rƣợu vang sau kết thúc trình lên men malolactic Trƣớc lên men malolactic Sau lên men malolactic Etanol (%v/v) 12,8 12,3 Axít tổng số (g/1 H2SO4) 5,39 4,9 Axít bay (g/1 axít axetic) 0,23 0,28 Axít ma ic (g/1) 2,04 0,12 Axít actic (g/1) 0,45 1,78 pH 3,4 3,5 Thành phần Từ kết thu được, đưa kết uận sau Qu tr nh ên men ma o actic chủng môi trường rượu vang non đạt hi u cao với hàm ượng axít ma ic ại 0,12 g/1 điều ki n bổ sung chế phẩm Essentia s Oenos nồng độ 0,025 g/1, nhi t độ ên men 20°C thời gian ên men 23 ngày 3.4.3 Ảnh hưởng thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic đến chất lượng rượu vang Theo Henick-Kling nhiều t c giả, qu tr nh ên men ma o actic không đơn qu tr nh chuyển axít malic thành axít lactic mà có ảnh hưởng lớn đến chất ượng cảm quan rượu vang Chất ượng cảm quan rượu cao hay thấp không phụ thuộc vào qu tr nh ên men rượu mà phụ thuộc nhiều vào qu trinh ên men nia o actic, phải kể đến c c yếu tố chủng vi khuẩn l a chọn, điều ki n qu tr nh ên men [33] Để qu tr nh ên men ma o actic thành công, thời điểm x c để bổ sung vi khuẩn lactic quan trọng Xung quanh vấn đề có nhiều quan điểm tranh cãi C c ý kiến t n thành cho vi c bổ sung vi khuẩn lactic đầu qu tr nh ên men rượu cho vi khuẩn ph t triển tốt với nguồn dinh dưỡng dồi điều cho 49 phép qu tr nh ên men ma o actic kết thúc trước qu tr nh ên men rượu (Beelman, 1982, 1985) Tuy nhiên, Ga ander Lafon-Lafourcade lại b o c o vi khuẩn ph t triển chậm sir khử axít malic trở nên s tương t c nấm men S cấy vi khuẩn lactic vào giai đoạn kết thúc qu tr nh ên men cồn có bất lợi như: môi trường dinh dưỡng cạn ki t, hàm ượng rượu etanol cao Cả hai điều ki n àm chậm trễ qu tr nh ên men ma o actic (Lafon-Lafourcade, 1983) Một quan điểm kh c t n thành vi c bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điêm ên men rượu phần với ý vi khuẩn vừa tận dụng nguồn dinh dưỡng môi trường mà không ảnh hưởng đến tiến tr nh ên men rượu (Fornairon, 2001) Thí nghi m tr nh bày c c kết qu tr nh ên men ma o actic th c hi n với c c thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic kh c Qu tr nh ên men th c hi n mục 2.2.1 nho sau nghiền xử ý với K2S2O5 enzym Pectinex, ên men với chủng nấm men S.cerevisiae SH09, vi khuẩn lactic J cho vào c c thời điểm trước, sau qu tr nh ên men rượu, cụ thể: Mẫu F: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic đầu qu tr nh ên men rượu Mẫu M: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic qu tr nh ên men rượu 48h Mẫu E: Lên men MLF, cấy vi khuẩn lactic qu tr nh ên men rượu vừa kết thúc Mẫu ĐC: Lên men MLF t ph t, không bổ sung malolactic Qu tr nh ên men ma o acti th c hi n điều ki n nhi t độ 20°C Kết s chuyển ho axít Ma ic thời gian ên men ma o actic tr nh bày bảng 3.14 50 Bảng 3.14 Thời gian lên men hàm lƣợng axít malic, axít lactic sau trình lên men malolactic thời điểm bổ sung vi khuẩn lactic khác Mẫu Axít malic (g/1) Axít lactic (g/1) Thời gian lên men (ngày) ĐC 0,10 1,64 23 F 0,09 1,68 14 M 0,09 1,66 12 E 0,09 1,69 14 Kết bảng 3.14 cho thấy: Khả phân giải axít malic - Mẫu ĐC hàm ượng axít ma ic dư dịch ên men cao (0,10 g/l) - Mẫu F, M, E hàm ượng axít ma ic dư dịch ên men ại (0,09 g/l) Khả tạo Axít lactic - Mẫu ĐC hàm ượng axít actic dư dịch ên men thấp (1,64 g/l) - Mẫu M hàm ượng axít actic dư dịch ên men (1,66 g/ ) - Mẫu F hàm ượng axít actic dư dịch ên men (1,68 g/ ) - Mẫu E hàm ượng axít actic dư dịch ên men cao (1,69 g/l) Mẫu đối chứng (ĐC) ên men t ph t có thời gian ên men ma o actic dài tất c c mẫu nghiên cứu Sau qu tr nh ên men rượu kết thúc, đến ngày thứ t m, qu tr nh ên men ma o actic bắt đầu kết thúc vào thời điểm 16 ngày sau Tổng qu tr nh ên men ma o actic 23 ngày Mẫu M, bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h qu tr nh ên men rượu, hàm ượng đường khử giảm xuống khoảng 25% có thời gian ên men ma o actic nhanh nhất, 12 ngày sau kết thúc qu tr nh ên men rượu mẫu phù hợp 51 Mẫu E, bổ sung vi khuẩn lactic vào giai đoạn cuối qu tr nh ên men rượu có thời gian ên men ma o actic 14 ngày Tuy nhiên, v bổ sung lactic c c giai đoạn kh c qu tr nh ên men rượu nên có s tương t c nấm men vi khuẩn, ảnh hưởng đến qu tr nh ên men rượu, đặc bi t đến s tạo thành etano hàm ượng đường sót, s ảnh hưởng tr nh bày bảng 3.15 h nh 3.7 Bảng 3.15 Rƣợu etanol đƣợc tạo thành hàm lƣợng đƣờng sót sau trình lên men malolactic Mẫu Etanol (%v/v) Đƣờng sót (g/1) ĐC 12,8 5,9 F 12,1 7,2 M 12,9 5,9 E 12,8 5,9 Hình 3.7 So sánh tạo thành rƣợu etanol sau trình lên men malolactic Kết quả, bảng 3.15 h nh 3.7 cho thấy mẫu bổ sung vi khuẩn lactic vào thời điểm đầu qu tr nh ên men rượu khiến cho qu tr nh ên men cồn th c 52 hi n không hoàn toàn, thể hi n hàm ượng đường sót tương đối cao (7,2 g/1), hàm ượng cồn tạo thành tương đối thấp Tuy nhiên, hàm ượng cồn thấp mẫu vi khuẩn lactic tiêu thụ phần đường để ên men Mẫu bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h ên men (mẫu M) có hàm ượng cồn tạo hàm ượng đường sót tương t c c mẫu ên men cồn mà s tham gia vi khuẩn lactic (mẫu ĐC mẫu E) Vi c bổ sung lactic c c giai đoạn kh c qu tr nh ên men rượu nên có s tương t c nấm men vi khuẩn, ảnh hưởng đến qu tr nh ên men rượu, ảnh hưởng đến s tạo thành c c chất bay hơi, s ảnh hưởng tr nh bày bảng 3.15 h nh 3.8 Bảng 3.16 Sự tạo thành số chất bay đƣợc tạo thành sau trình lên men malolactic Mẫu ĐC F M E Axít bay (g/1) 0,47 0,42 0,26 0,43 Hình 3.8 So sánh tạo thành số chất bay sau trình lên men malolactic 53 Kết bảng 3.16 h nh 3.8 cho thấy qu tr nh ên men ma o actic t ph t tạo hàm ượng axít bay cao (0,47 g/1) Ở mẫu cấy vi khuẩn lactic sau 48 h th hàm ượng axít bay giảm đ ng kể (0,26 g/1) Ở hai mẫu ại, cấy vi khuẩn actic vào giai đoạn đầu cuối qu tr nh ên men rượu th hàm ượng axít bay tạo trung b nh, 0,41 0,43 g/1 tương ứng C c axít bay yếu tố tiêu c c rượu, hàm ượng, rượu vang t ng ên chứng tỏ chất ượng rượu vang giảm Đã x c định c c điều ki n tối ưu qu tr nh ên men ma o actic cho chủng NT 12 môi trường rượu vang non quy tr nh sản xuất rượu vang đỏ: Nồng độ Essentials Oenos thấp 0,025 g/ để bổ sung cho qu tr nh ên men malolactic.Nhi t độ ên men 200C Thời gian ên men 23 ngày Bổ sung bổ sung vi khuẩn lactic sau 48 h qu tr nh ên men rượu, hàm ượng đường khử giảm xuống khoảng 25% 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Từ kết thu được, rút số kết luận sau đây: Từ 20 chủng vi khuẩn actic phân ập từ vùng trồng nho Ninh Thuận, chủng có khả n ng chuyển hóa axit ma ic thành axit actic Tuyển chọn chủng NT12 có khả n ng phân giải malolactic tốt hàm ượng axít ma ic dư dịch sau ên men malolactic 0,12 g/ Đã x c định c c điều ki n tối ưu qu tr nh ên men ma o actic cho chủng NT12 môi trường rượu vang non quy tr nh sản xuất rượu vang đỏ: - Nồng độ Essentia s Oenos thấp 0,025 g/ để bổ sung cho qu tr nh ên men ma o actic - Nhi t độ ên men 200C - Thời gian ên men 23 ngày - Bổ sung bổ sung vi khuẩn actic sau 48 h qu tr nh ên men rượu, hàm ượng đường khử giảm xuống khoảng 25% Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu x c định thêm số điều ki n tối ưu cho chủng NT 12 để ứng dụng sản xuất thử nghi m rượu vang đỏ chất ượng cao Vi t Nam 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2005), Các phương pháp phân tích ngành công nghệ lên men, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Lê Đ nh Hùng, Trần Thị Minh Hà, Ngô Anh Tuấn, Yoshihiro Komiyama (2007), Nghiên cứu ứng dụng SO2 nâng cao độ ổn định chất lượng rượu vang trình bảo quản, Tạp chí Công nghi p, Bộ Công nghi p, số 3/2007, tr.22-25 Lại Quốc Phong (2007), “Nghiên cứu phân ập tuyển chọn chủng vi khuẩn Oenococcus oeni cho ên men ma o actic rượu vang đỏ”, Các công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học - công nghiệp thực phẩm giai đoạn 20012005, Nhà xuất Lao động-Xã hội, tr.196-202 Lê Thị Liên Thanh (1997), Nghiên cứu số đặc tính sinh lí hóa sinh Leuconostoc oenos ứng dung sản xuất rượu vang, Luận n Tiến sĩ khoa học, Đại học B ch khoa Hà Nội Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Quang Hào (2003), Nghiên cứu hiệu sử dụng enzym chất phụ gia sản xuất vang Việt Nam chất lượng cao, B o c o khoa học, Hội nghị công ngh sinh học toàn quốc 2003, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr.569-572 Tiêu chuẩn Vi t Nam (2002), Rượu vang - Quy định kỹ thuật, Trung tâm tiêu chuẩn Vi t Nam TCVN:7045:2002 Trương Hương Lan, Lại Quốc Phong, Trần Thị Minh Hà, Ngô Anh Tuấn, Taillandier Patricia, Lonvaud Aline (2010), Nghiên cứu công nghệ sản xuất rượu vang chất lượng cao Việt Nam B o c o tổng hợp, tr 12-24 56 Tiếng Anh Amerine M.A and Cruess W.V (2003), The technology of wine making, The AVI Publishing Company Inc., Connecticut AOAC Oficial Method of Analyis (1995), 27, pp 2651-2659 10 Asmundson RV, Kelly WJ (2000), “The effect of temperature and etanol concentration on the growth of Leuconostoc oenos”, In: Williams PJ, Davidson D, Lee TH (Eds), Proceedings of the seventh Australian wine industry technical conference, 14-16 August 1989, Adelaide, S.A Winetitles, pp 251-252 11 Bartowsky E.J., and Henschke P.A., (2004), “The “buttery” attribute of winediacetyl- desirability, spoilage and beyond”, Int J Food Microbiol., 96, pp 235-252 12 Boutlton R.B., V.L Singleton, L.F Bisson, and R.E Kunkee (2006), “Malolactic fermentation”, In: Principles and practices of winemaking, Chapman & Hall, Aspen Publishers, Maryland 13 Britz TJ, Tracey RP (1990), “The combination effect of pH, S02, etanol and temperature on the growth of Leuconostoc oenos”, J Appl Bacteriol., 68, pp 23-31 14 Carreté R, Teresa Vidal M, Bordons A, Constanti M (2002), “Inhibitory effect of sulphur dioxide and other stressvcompounds in wine on the ATPase activity of Oenococcus oeni”, FEMS Microbiol Lett 211, pp.155-159 15 Collin C.H., Lyne M., Grange J.M (1989), Microbiological methods, Sixth Edition, Butterworth and Co (Publishers) Ltd London, pp.169- 233 16 Chu-Ky s, Tourdot-Marechal R, Marechal PA, Guzzo J (2005), “Combined cold, acid, etanol shocks in Oenococcus ami: Effects on membrane fluidity and cell viability”, Biochimica et Biophysica Acta.,1717, pp.118-124 17 Davis C.R., D Wibowo, T.H Eschenbruch, and G.H Fleet (1985), “Practical implications of malolactic fermentation: A review”, Am J Enol Vitic., 36, pp.290-301 18 Delore A., Kraeva B., Martin M., Hunter J.J (2005), “Sugar loading and 57 phenolic accumulation as affected by ripeness of Syrah R99 grapes”, Confference XIV International GESCO Viticulture Congress Geisenheim, Germany 23-27, August, 2005 19 Edwards CG, Beelman CE, McConnell AL (2000), “Production of decanoic acid and other volatile compounds and the growth of yeast and malolactic bacteria during vinification”, Am J Enol Vitic 41, pp 48-56 20 European Brewing Convention (1999), “Dertermination of sulfite content in vin”, Analytical EBC Methods 9-12, pp 31-132 21 Garde-Cerdan T., Rodriguez-Mozaz S., and Ancin-Azpilicueta C., (2002), “Volatile composition of aged wine in used barrels French oak and of American oak”, Food Research International, 35, pp 603-610 22 Gerbaux C.V., Villa A., Monamy C., and Bertand A (1997), “Use of lysozyme to inhibit malolactic fermentation and stabilize wine after malolactic fermentation”, Am J Enol.Vitic., 48, pp 49-54 23 Graca Da Silveira M, Golovina EA, Hoekstra FA, Rombouts FM, Abee T (2003), “Membrane fluidity adjustments In etanol-stressed Oenococcus oeni cells”, Appl Environ Microbiol 69, pp 5826-5832 24 Guzzo J, Jobin MP (1998), “Increase of sulphite tolerance in Oenococcus oeni by means of acidic adaptation”, FEMS Microbiol Lett 160, pp 43-47 25 Gvilang H, Winge M, Korch c (1998), “Regulation of S02 formation during fermentation”, European Brewery convention In: Proceedings of the 22nd Congress, Zurich, pp 347-354 26 Henick-Kling T (2005), “pH and regulation of malolactic activity in Leuconostoc oenos”, In: Actualités Orelogiques 89 Comptes rendus du 4e Symposium International d’Oenologie (Bordeaux, 1989), 320-325, Institut d’OEnologie Université de BordeauxDun.od, Paris 27 Henick-Kling T (2003), “Phage infection of malolactic fermentation”, In: Lee T H., (Ed) Malolactic fermentation Pro Semina, 16 August 1984, Melbourne The Australian Wine Research Institute, Glen Osmond, South Australia, pp 58 128-143 28 Henick-Kling T (2007), “Malolactic fermentation”, In: Fleet G H., (Ed) Wine microbiology and biotechnology, Harwood Academic Publishers, pp 289-326 29 Henick-Kling T., and Park H Y (1994), “Considerations for the use of yeast and bacterial starter cultures: SO2 and timing of inoculation”, Am J Enol Vitic., 45, pp 464-469 30 Ho m, E.H., Nissen, P (2003), “Red wine extract creates ong- ife fruit”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 18, pp 728-824 31 Jackson R.S (1994) Wine Science, Principles and Applications, Academic Press, San Diego 32 Laurent M H., T Henick and T E Acree (2004), “Changes in the aroma and odour of Chadonnay wine due to malolactic fermentation”, Vitic Enol Sci., 49, pp.3-10 33 Liu S.-Q (2002), “Malolactic fermentation in wine - beyond acidification”, J Appl.Microbiol., 92, pp 589-601 34 Liu JWR and Gallander J.F (2001), “Effect of pH and sulphur dioxide on the rate of malolactic fermentation in red table wines”, Am J Enol Vitic., 34, pp 44-46 35 Lonvaud-Funel A, Joyeux A, Dessens c (2001), “Inhibition of malolactic fermentation of wines by products of yeast metabo ism”, J Sci Food A OTIC.,44, pp 183-191 36 Nelson Somogy, (1992), “Dertemination of ruducing surgar in beer”, J Biol Chem., 25, pp 151-255 37 Nielsen J C., and M Richekieu, (1999), “Control of flavour development in wine during and after malolactic fermentation”, Appl Environ Microbiol., 65, pp 470- 475 38 P Ribéreau-Gayon, Y Glories, A Maujean and D Dubourdieu (2000), “Handbook of Enology”, Volume 2: The chemistry of wine and stabilization and treatments, John Wiley & Sons Ltd, pp 43 59 39 Ramos A A., J S Lolkema, W N Konings, and H Santos (1995), “Enzymebasis for pH regulation of citrate and pyruvat metabolism by Leuconostoc oenos”, Appl Environ Microbiol., 61, pp 1303-1310 40 Rapp A., Mandery H., (1986), “Wine aroma”, Experientia, 42, pp 873-884 41 Ribéreau-Gayon J., Peynaud E., Sudraud P and Ribéreau-Gayon P ,(1982), “Sciences et Techniques du Vin” , Vol 1: Analyse et Contrôle du Vin, 2nd edn Dunod, Paris 42 Romano P., Suzzi G., Domizio P and Fatichenti F (1997), “Secondary products formation as a tool for discrimination non-Saccharomyces wine strains”, Antonie van Leeuwenhoek, 71, pp 239-242 43 Swiegers J.H and Pretorius I.S (2005), “Yeast modulation of wine f avor”, Adv Appl Microbiol., 57, pp 131-175 44 Todd B.E.N (1995), “Enhancing the sensory properties of wine using glycosidase activity of wine micro-organisms”, Aust Grapegrow Winemaker 382, pp 22-23 45 Van Vuuren, H J J., and L M T Dicks (1991), “Leuconostoc oenos: A review”, Am J Enol Vitic., 44, pp 99-112 46 Vaughan-Martini A and Martini A (1995), “Facts, myths and legends on the prime industrial microorganism”, J Indust Microbiol., 14, pp 514- 522 47 Wibowo D, Fleet GII.Lee TH, Eschenbrush RE (1988), “Factors affecting the induction of malolactic fermentation in red wines with Leuconostoc oenos”, J Appl Bacteriol 64, pp 421-428 48 Zoecklein B W., Fugelsang K C., Gump B H., Nury F S (1989), “Sampling, fermentation, and production ana ysis”, In: Zoecklein B W., Fugelsang K C., Gump B H., Nury F S., (Eds), Production wine analysis Van Nostrand Reinhold, New York, pp 9-181 60 [...]... oài vi khuẩn ma o actic sử dụng trong sản xuất rượu vang nhưng O oeni vẫn à oài vi khuẩn được a chọn bởi đa số c c nhà sản xuất rượu vang O oeni có tên gọi trước đây à Leuconostoc oenos, à một oài hiếu khí tùy ti n và có thể sinh trưởng trên môi trường có pH thấp (pH 4,2-4,8) được bổ sung nước cà chua hoặc nước nho [26] Ở c c vùng sản xuất rượu nho, nó có mặt trong dịch hèm cũng như trong rượu vang. .. X c định hàm ượng axít L-malic, L- actic và axít axetic bằng phương ph p kit chuẩn enzim (Boehringer M nnhein, Đức) 30 CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn malolactic cho sản xuất rƣợu vang 3.1.1 Phân lập các chủng vi khuẩn malolactic tại Ninh Thuận C c vi khuẩn có khả n ng phân giải axít ma ic trong rượu vang được gọi à vi khuẩn ma o actic Để phân ập được c c chủng... nhiên, c c oài vi sinh vật ban đầu này xuất hi n rất ít trong rượu vang mà phần ớn à c c oại vi khuẩn nhiễm tạp từ c c dụng cụ àm rượu trong c c giai đoạn kh c nhau diễn ra trong qu tr nh bơm dịch nước nho vào thùng ên men Mặc dù người ta có thể bắt gặp trong c c oại rượu vang một số vi khuẩn t nhiên từ quả nho, nhưng chủ yếu vẫn à c c vi khuẩn có nguồn gốc từ c c thiết bị trong hầm rượu Tương t như... chúng [4] Chính pH axít, hàm ượng êtano và c c thành phần kh c của rượu vang tạo ra p c chọn ọc đối với c c vi khuẩn actic Chỉ có một số oài rất nhỏ có khả n ng t ph t triển trong c c oại dịch đường và rượu vang C c oài thường gặp trong sản xuất rượu vang chủ yếu thuộc c c giống sau: Pediococcus, Leuconostoc, Oenococcus và Lactobacillus S xuất hi n của c c oại vi khuẩn actic này trên bề mặt quả nho à... Hương của rượu trở nên quyến rũ hơn Rượu trở nên mềm mại hơn do s khử gần như hoàn toàn axit ma ic thành axít actic Kết thúc qu tr nh ên men ma o actic, hương và vị của rượu đầy đủ hơn nhưng ại thanh hơn [7] 1.3.3.4 Các chất ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn malolactic và quá trình lên menmalolactic Thành phần rượu vang, phương ph p sản xuất và mối tương t c giữa vi khuẩn ma o actic và c c vi sinh vật... sử dụng chủng giống vi khuẩn thuần khiết có khả n ng ên men ma o actic mạnh trong qu tr nh sản suất rượu vang Để sử dụng c c chế phấm này một c ch hi u 18 quả, c c nhà sản xuất khuyến c o không nên cấy tr c tiếp chế phẩm vào vang non mà trước tiên phải nhân giống bằng môi trường có bổ xung dịch nước quả và axít malic cho vi khuẩn từ từ lấy lại hoạt tính ên men ma o actic rồi sau đó mới cấy vào rượu vang. .. t cho vi c nhập khuẩn rượu [7] 21 Sản xuất vang theo truyền thống th ên men ma o actic diễn ra t ph t trong suốt qu tr nh bảo quản vang non trong thời gian vài th ng hoặc nhiều n m Vi khuẩn có nguồn gốc trên vỏ quả nho hoặc ở thùng gỗ Tuy nhiên, trong công ngh sản xuất vang hi n đại với qu tr nh chế biến sạch hơn và thời gian bảo quản cần giảm tối thiểu th qu tr nh ên men như vậy qu chậm chạp và không... điểu ki n thuận ợi cho c c vi khuẩn Đây à t c nhân quyết định chính tới số ượng của quần thể c c vi khuẩn và đối với s ph t triển của chúng trong giai đoạn đầu của qu tr nh ên men Trong qu tr nh sản xuất rượu vang, có ên men ma o actic, quần thể vi khuẩn t nhiên ph p triển trải qua rất nhiều pha kh c nhau Trong những ngày đầu tiên của qu tr nh ên men rượu, c c oại vi khuẩn và nấm men t ph t triển Nhưng... do tỉ vi khuẩn trong dịch ên men qu ít hoặc do hàm ượng SO2 qu cao đã ức chế vi khuẩn [2] Tuy nhiên, phương ph p này cũng có hạn chế: đó à à s cạnh tranh không ành mạnh chất dinh dưỡng và quan h đối kh ng giữa vi khuẩn và nấm men S chuyển hóa đường của vi khuẩn actic để sinh ra axit actic gây ảnh hưởng đến hi u suất qu tr nh ên men rượu của nấm men và chất ượng rượu vang Bên cạnh đó, khi vi khuẩn lactic... o actic, cấy vi khuẩn actic khi qu tr nh ên men rượu được 48h 26 Mẫu E: Lên men ma o actic, cấy vi khuẩn actic khi qu tr nh ên men rượu vừa kết thúc 2.2.2 Phương pháp vi sinh vật - Phương ph p phân ập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên i u quả, nho Hình 2.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn malolactic từ nguồn nguyên liệu quả và lá nho - Phương ph p x c định khả n ng ên men của chủng vi khuẩn malolactic Lấy