BỘ NÔNG NGHIỆP VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN MÃ SỐ ĐỀ TÀI: Cơ quan chủ trì đề tài: Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II Chủ nhiệm đề tài/dự án: ThS Cao Thành Trung TP.HCM – 2014 BỘ NÔNG NGHIỆP VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC THUỘC CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU VI RÚT GÂY BỆNH HOẠI TỬ CƠ QUAN TẠO MÁU VÀ CƠ QUAN LẬP BIỂU MÔ (IHHNV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) NUÔI TẠI KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG VÀ GIẢI PHÁP HẠN CHẾ SỰ LÂY LAN MÃ SỐ ĐỀ TÀI: Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài Th.S Cao Thành Trung Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn TP.HCM - 2014 MỞ ĐẦU Ngành nuôi trồng thủy sản có vai trò quan trọng việc phát triển kinh tế đất nước Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có điều kiện tự nhiên thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm thủy sản Vài năm trở lại đây, tỉnh khu vực phát triển nhanh nghề nuôi tôm thủy sản Tuy nhiên, giá trị kinh tế mang lại ngành nuôi tôm phải đối mặt với nhiều thách thức rủi ro dịch bệnh vi sinh vật gây vi nấm, vi khuẩn virus Đặc biệt phải kể đến bệnh tôm virus gây trở ngại lớn cho phát triển bền vững ngành nuôi tôm giới Việt Nam nói riêng Trong vài thập niên qua, bệnh virus gây lúc đầu có virus (năm 1989) biết đến vài năm sau có 20 virus (năm 1997) phát (Hernández-Rodríguez ctv., 2001), kể đến bệnh đốm trắng WSSV gây thiệt hại nặng nề nghề nuôi tôm sú Penaeus monodon virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (IHHNV) lại gây thiệt hại to lớn cho nghề nuôi tôm Penaeus (Litopenaeus) stylirostris với tỉ lệ tử vong lên tới 90% (Lightner, 1983) Kể từ IHHNV phát Hawaii vào năm 1981, virus lan truyền nhanh chóng ghi nhận nhiều khu vực khác Với nhiều mức độ thiệt hại IHHNV gây báo cáo từ nhiều trang trại nuôi tôm nhiều khu vực giới Bằng chứng cho thấy mức độ thiệt hại virus gây ước tính khoảng 8,5 tỷ USD riêng thiệt hại IHHNV gây ước tính khoảng 0,5 – tỷ USD (Lightner, 2005) Trước ảnh hưởng thiệt hại IHHNV gây trang trại tôm, liệt vào danh mục vào virus gây bệnh nguy hiểm tôm vào năm 2000 Tổ chức Thú y Thế giới (Office Internationnal des Epizooties - OIE) (Lightner ctv., 1997; OIE, 2009) Hơn nữa, Chương trình trang trại nuôi tôm nước mặn Hoa Kỳ (UMSFP) công bố IHHNV tác nhân gây bệnh quan trọng ảnh hưởng đến giá trị kinh tế tôm thương phẩm virus liệt vào danh mục bệnh tổ chức (Lotz ctv., 1995) Sau Shike ctv, (2000) công bố thông tin trình tự gen IHHNV phân lập Hawaii GenBank (AF218226) trình tự gen số chủng IHHNV công bố rộng rãi nhiều nước khác giới Qua nghiên cứu vật liệu di truyền chủng IHHNV phân lập từ nhiều vùng giới, nhà khoa học cho gen IHHNV ổn định (Tang Lightner, 2002) Và nhiều phương pháp chẩn đoán phát triển hỗ trợ phát sớm virus IHHNV Trong đó, tập trung chủ yếu phương pháp phát vật liệu di truyền virus Như phương pháp PCR, Real-time PCR, phương pháp lai chỗ, phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt LAMP giới thiệu cho phép phát IHHNV nhanh chóng tiện lợi (Rai ctv., 2012) Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây, cho thấy trình tự IHHNV có nhiều biến đổi nhiễm tôm sú (Tang ctv 2006; Saksmerprome ctv., 2011) Sự diện type IHHNV A B gắn vào gen tôm sú việc chẩn đoán IHHNV phức tạp biến thể di truyền virus khu vực địa lý khác tương đồng lớn vật liệu di truyền type IHHNV Bên cạnh chèn trình tự IHHNV type lây nhiễm ngẫu nhiên vào gen tôm sú thường xảy mà cặp mồi OIE kít thương mại bắt cặp với trình tự chèn trình tự đích Dẫn đến kết chẩn đoán dương tính giả sử dụng qui trình (Saksmerprome ctv., 2010; 2011) Hiện nay, có nhiều nghiên cứu trái ngược tác động virus lên tăng trưởng tôm sú, số nghiên cứu cho thấy, tôm sú nuôi có tượng dị dạng còi cọc, chậm lớn, phát triển có kích thước không nhiễm IHHNV (Primavera & Quinitio., 2000; Rai ctv., 2009) Một số nghiên cứu khác cho việc nhiễm IHHNV tác động lớn phát triển tôm nuôi, số lượng trứng đẻ tỷ lệ nở trứng từ tôm mẹ nhiễm hay không nhiễm sản lượng nuôi (Withyachumnarnkul ctv., 2006; Flegel, 1997) Sự lan truyền virus nhiều nghiên cứu cho chúng lan truyền theo trục dọc lẫn trục ngang, mức độ lây nhiễm virus trở nên nhanh chóng Sự lan truyền theo trục dọc khả truyền bệnh từ bố mẹ mang mầm bệnh truyền cho hệ sau chúng (Mottle ctv., 2003), lan truyền theo trục ngang tập tính ăn thịt lẫn hay nguồn nước bị nhiễm (Lightner ctv., 1983a,b) Mặc dù, có nhiều nghiên cứu lan truyền theo trục dọc theo trục ngang IHHNV loài tôm he P stylirostris, P vannamei có nghiên cứu lan truyền IHHNV tôm sú Penaeus monodon Ở Việt Nam tôm nhiễm virus xảy hàng năm IHHNV xuất tôm nuôi Việt Nam, chủ yếu lây nhiễm tôm sú tôm thẻ chân trắng Khảo sát 307 mẫu tôm sú thu từ miền Trung, tây Nam Bộ Đông Nam Bộ cho thấy có đến 52% mẫu nghiên cứu nhiễm type IHHNV khác (Hùng ctv., 2009) Trong hiểu biết virus tôm sú Việt Nam không nhiều có nghiên cứu IHHNV hậu tiêu cực loại vius gây cho ngành công nghiệp nuôi tôm cảnh báo toàn giới Chỉ có vài tổ chức tập trung ứng dụng qui trình chẩn đoán PCR OIE công bố để phát triển kít thương mại để chẩn đoán virus Một nghiên cứu Hùng ctv (2009) cho thấy trình tự chủng IHHNV có quan hệ gần với chủng IHHNV Đài Loan (AY 355307) Thái Lan Chưa có nghiên cứu lây nhiễm IHHNV tôm sú cách cho ăn hay sống chung với tôm bệnh, lây nhiễm từ mẹ sang con, hay lây nhiễm cá thể tôm mang IHHNV cá thể quần đàn Cũng đánh giá diện chúng tôm sú nuôi mô hình ương nuôi khác Do đó, nghiên cứu nhằm khảo sát có hay không diện chủng mang di truyền khác chủng IHHNV, để qua nhằm góp phần làm rõ thêm thông tin chủng IHHNV nhiễm tôm sú Đồng Bằng Sông Cửu Long phát triển công cụ chẩn đoán, đề xuất giải pháp hạn chế lây lan có biện pháp phòng trị tôm sú nuôi ĐBSCL TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình nuôi tôm dịch bệnh Đồng Sông Cửu Long 2.1.1 Tình hình nuôi tôm Trong năm gần đây, ngành thủy sản với phát triển không ngừng trở thành ngành kinh tế đóng vai trò quan trọng việc xuất Việt Nam với lợi bờ biển dài chạy dọc theo địa lý từ Bắc chí Nam nên có tiềm to lớn cho phát triển ngành thủy sản nước mặn nước lợ Trong đó, nuôi tôm nước lợ chiếm vị trí vai trò quan trọng ngành thủy sản Ngoài giá trị kinh tế mang lại việc xuất thu nguồn ngoại tệ lớn, ngành nuôi tôm nước ta góp phần vào việc giải công ăn việc làm cho đông đảo người lao động Theo Tổng cục thống kê (2010) cho thấy vào năm 2000 nước có khoảng 324.000 diện tích nuôi tôm vòng khoảng 10 năm trở lại diện tích nuôi tôm tăng lên gần gấp đôi khoảng 629.000 vào năm 2008 diện tích nuôi trồng có xu hướng mở rộng vào năm sau (năm 2013 652.612 ha) Ở Việt Nam, giống tôm nuôi chủ yếu có nguồn gốc tự nhiên tôm sú, tôm chì, tôm sắt, tôm nghệ tôm thẻ nhập vào nước ta thập niên gần Tuy nhiên, tôm sú (Penaeus monodon) loài quan trọng nông dân lựa chọn nuôi nhiều Việt Nam từ nhiều năm qua Theo Tổng cục Thủy sản Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn (2011) đến năm 2011 nước thả nuôi 656.425 tôm nước lợ diện tích nuôi tôm sú 623.377 Trong nhiều năm tôm sú xem giống giúp đưa Việt Nam vào danh sách nước cung cấp tôm quan trọng giới Năm 2011, tôm sú giữ vị trí chủ đạo cấu xuất tôm Việt Nam với tổng giá trị xuất tôm năm 2011 đạt 2,396 tỷ USD xuất tôm sú đạt 1,43 tỷ USD, chiếm gần 60 % tổng giá trị Phần lớn diện tích nuôi tôm sản lượng tôm tập trung từ Nam Bộ đặc biệt số tỉnh ĐBSCL có điều kiện tự nhiên thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm he Theo điều tra Tổng cục Thủy sản Bộ Nông nghiệp - Phát triển nông thôn (2011), tổng diện tích thả nuôi tôm 602.416 chiếm 91,8 % diện tích nuôi tôm nước, có diện tích nuôi tôm sú lên tới 588.419 Các tỉnh có diện tích nuôi tôm lớn Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Kiên Giang… 2.1.2 Tình hình dịch bệnh Mặc dù ngành nuôi tôm mang lại nhiều thuận lợi kinh tế xã hội gặp phải nhiều khó khăn thách thức cho ngành Đó tình hình dịch bệnh vi sinh vật gây ra, đặc biệt virus tôm diễn biến phức tạp khó lường Tình hình gia tăng nhanh diện tích nuôi trồng kéo theo vấn đề xử lý ao nuôi, nguồn nước đặc biệt giống đầu vào không kiểm soát chặt chẽ dẫn đến dịch bệnh tôm thường xảy thường xuyên Những dẫn chứng cụ thể từ năm 1999 đến năm 2003, dịch bệnh tràn lan bùng phát mạnh làm nhiều diện tích nuôi tôm trắng tôm chết hàng loạt Do đó, gây nhiều thiệt hại to lớn tài sản kinh tế người nuôi Qua nghiên cứu tìm hiểu cho thấy tác nhân gây bệnh cho tôm nuôi có nguồn gốc từ virus Các bệnh virus gây dẫn đến nhiều thiệt hại nặng nề kinh tế cho ngành nuôi tôm thâm canh phải kể đến bệnh hoại tử gan tụy Hepatopancreatic Parvovirus (HPV), bệnh còi Monodon Baculovirus (MBV), bệnh đốm trắng virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV), bệnh đầu vàng virus gây hội chứng đầu vàng (YHV - Yellow head virus), năm gần (từ 2011 đến nay) bệnh hoại tử gan tụy cấp (AHPNS - Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) Vibrio parahaemolyticus mang gen độc gây khiến tôm chết hàng loạt vùng nuôi tôm nước (ở Đồng Bằng Sông Cửu Long tỉnh Miền Trung) Gần đây, Việt Nam xuất thêm bệnh virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (IHHNV) nhiên chưa ghi nhận thiệt hại virus gây tôm nuôi Những dấu hiệu bệnh lâm sàng virus cho thấy không rõ ràng, bệnh không gây chết tôm sú nuôi thông tin tìm hiểu nghiên cứu virus Việt Nam chưa có nhiều 2.2 Bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (infectious hypothermal and hemotopoietic necrosis) Bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô có tác nhân gây bệnh virus hypothermal and hemotopoietic necrosis (IHHNV) có tên khoa học PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus), số bệnh nguy hiểm tôm Litopenaeus stylirostris Bệnh IHHN lần mô tả hệ thống nuôi siêu thâm canh tôm L stylirostris Hawaii năm 1981 (Lightner ctv., 1983) Khi mắc bệnh này, tôm L stylirostris có tỷ lệ chết lên đến 90% Sau phát Hawaii, bệnh IHHN tiếp tục phát phân bố rộng rãi Mỹ vùng nuôi ven bờ biển Thái Bình Dương Ngay sau phát IHHNV tôm L stylirostris nhà khoa học phát virus có mặt tôm thẻ chân trắng Penaeus vannamei từ khu vực phát IHHNV tôm L stylirostris khu vực này, tôm thẻ vật mang virus không biểu bệnh tích (Lightner ctv, 1983; Bell Lightner, 1984) Các nghiên cứu sau cho thấy IHHNV nguyên nhân gây biến dạng lớp vỏ kitin chủy, râu, vùng đốt ngực vùng bụng tôm thẻ chân trắng gọi hội chứng dị dạng còi cọc (Runt-deformity Syndrome, RDS) Tác động IHHNV lên tôm thẻ gây ảnh hưởng giá trị thương mại tôm chậm lớn, có kích thước nhỏ, biến dạng vỏ kitin IHHNV không gây chết nghiêm trọng tôm nhiễm virus Bệnh hoại tử quan tạo máu quan thành lập biểu mô bệnh virus gây nguy hiểm cho ngành nuôi tôm Virus xâm nhiễm vào tôm gây hoại tử máu nhiễm trùng vỏ Tôm nuôi giai đoạn postlarvae juvenile với mật độ cao dễ nhiễm virus Tôm nhiễm virus có biểu ăn, lừ đừ, nước, xoay tròn chết từ từ – tuần Các loài tôm khác nhiễm bệnh có dấu hiệu khác Loài P monodon, nhiễm IHHNV hấp hối có màu xanh lơ hệ vân phần bụng bị mờ đục, chậm lớn (Rai ctv., 2009) Loài P vannamei, bị bệnh dạng mãn tính thể số đặc điểm còi cọc, dị dạng, chùy đầu bị uốn cong bị dị dạng, râu bị nhăn nhúm lại, vỏ kitin bị sùi Tôm ăn dẫn đến phân đàn cao Loài P stylirostris, bị nhiễm cấp tính gây chết tôm giai đoạn ấu niên, ấu trùng hậu ấu trùng nhiễm bệnh không phát bệnh, sau 35 ngày trở bệnh bộc phát Ở mức độ nặng tôm sẻ ăn, có thay đổi trạng thái diện mạo, tôm bơi lội chậm chạp chết sau vài giờ, xuất vùng trắng hay vàng sẫm lớp biểu bì kitin, đặc biệt khớp nối làm thể tôm xuất vùng vằn vện (Lightner Bell, 1984) 2.3 Virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (infectious hypothermal and hemotopoietic necrosis virus – IHHNV) 2.3.1 Tên khoa học phân loại Virus gây bệnh hoại tử quan tạo máu quan lập biểu mô (IHHNV) virus có kích thước nhỏ phát lần tôm Penaeus (Litopenaeus) stylirostris Do đó, IHHNV có tên khoa học PstDNV (Penaeus stylirostris densovirus) (Shike ctv., 2000) Virus có kích thước từ 20 – 22 nm, có cấu trúc khối đa diện vỏ Dựa kích thước hình thái học, hóa sinh IHHNV xếp vào họ Parvoviridae thành viên chi Brevidensovirus (Bonami, 1990) 2.3.2 Bộ gen chức protein Virus mang vật liệu di truyền DNA mạch đơn, kích thước khoảng 4,1 kb chứa trình tự ORF (1, 2, 3) (Nunan ctv 2000, Shike ctv 2000) hình 2.1 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc gen chủng IHHNV phân lập Mỹ (AF273215, Shike ctv., 2000) Ba khung đọc mở (ORF trái, ORF giữa, ORF phải ) khung với vị trí chúng Vị trí cho (donor-D1) nhận (ReceptorA1, A2 A3) giả định thể hình tam giá P2, P11 P61 vị trí vùng promotor (Bổ sung Dhar ctv., 2010) Trong gen IHHNV, ORF bên trái hay gọi ORF1 có kích thước 2001 nucleotide (nt), chiếm 50% trình tự gen dự đoán mã hóa cho chuỗi peptide 666 amino acid với trọng lượng phân tử 75.77 kDa, sở tương đồng trình tự với virus Brevidensoviruses muỗi, trình tự amino acid dự đoán non-structural protein (NS1) Trình tự acid amin mã hóa ORF1 chứa motif đặc trưng cho IHHNV Bao gồm motif nhân tố khởi đầu chép có tính bảo tồn cao (RCR – motifs) chứa motif I (ở vị trí a.a 258 đến a.a 266) motif II (ở vị trí a.a 307 đến a.a 314) protein khởi đầu chép vùng NTP – binding helicase (ATPase motifs) chung cho tất parvoviruses (Rai ctv., 2011; Shike ctv., 2000) So sánh tương đồng trình tự a.a chủng nhiều vùng giới cho thấy, có khác biệt trình tự, có nhiều thay đổi tìm thấy 200 a.a motif đặc trưng IHHNV bảo tồn (Shike ctv., 2000; Tang Lightner, 2003) Tương tự parvovirus khác, ORF (ORF2) nucleotide 56 tính theo chiều ngược có đoạn chồng lấp trình tự với ORF1, có kích thước 1092 nt, có khả mã hóa cho vùng N – terminal chuỗi peptide mang 343 a.a gọi protein không cấu trúc (NS2) Cuối cùng, ORF bên phải (ORF3) chồng lấp trình tự với ORF2 (56 nucleotide), có kích thước 990 nt mã hóa cho chuỗi peptide chứa 329 a.a (Dhar ctv., 2007; Nunan ctv, 2000, Shike ctv, 2000) Bằng phân tích SDS-PAGE có bốn protein cấu trúc khác phát từ thể virus IHHNV tinh chúng có trọng lượng phân tử 74, 47, 39 37,5 kD (Bonami ctv., 1990; Mari ctv., 1993) Trong protein có kích thước 47 kD xác định có nguồn gốc từ ORF3 2.3.3 Sự đa dạng di truyền IHHVN 2.3.3.1 Phân loại kiểu gen Cho đến nay, có nhiều gen hoàn chỉnh chủng IHHNV khác giải trình tự mô tả chi tiết Bao gồm số chủng Hawaii Mỹ (trên Genbank có kí hiệu AF218266) có kích thước 3909 bp; Ấn Độ (GQ411199) có kích thước 3908 bp (Rai ctv., 2011); Hàn Quốc (JN377975) có kích thước 3914 bp (Kim ctv., 2011) Trung Quốc (EF633688) có kích thước 3833 bp a Thử nghiệm điều kiện chuẩn .101 b Thử nghiệm nhiệt độ ủ 101 c Thử nghiệm nồng độ MgSO4 dNTPs 102 d Thử nghiệm thời gian ủ .104 e Thử nghiệm qui trình sau khảo sát 104 Thiết kế mồi cho qui trình multiplex PCR 105 4.1 Thiết lập qui trình Multiplex PCR phát IHHNV chủng lây nhiễm 107 4.2 Khảo sát điều kiện phản ứng .108 4.3 Giới hạn phát .109 4.4 Kết hợp mồi nội phản ứng Multiplex PCR 110 4.5 So sánh qui trình Multiplex PCR với qui trình khác 111 4.6 Độ đặc hiệu phản ứng 113 4.7 Ứng dụng kiểm tra IHHNV type lây nhiễm mẫu thực .114 NỘI DUNG III: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH PHƯƠNG THỨC TRUYỀN LAN THEO TRỤC DỌC VÀ TRỤC NGANG CỦA IHHNV TRÊN TÔM SÚ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 115 Lây nhiễm theo trục dọc 115 Lây truyền theo trục ngang .118 4.8 Kết sàng lọc tôm sú tôm thẻ cho IHHNV cho thí nghiệm .118 4.9 Lây truyền ngang loài .119 4.10 Kết thí nghiệm lây nhiễm theo trục ngang khác loài 122 4.11 Biểu lâm sàng tôm lây nhiễm 127 NỘI DUNG IV: NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ HIỆN DIỆN, TRUYỀN LAN VÀ CÁC GIẢI PHÁP HẠN CHẾ IHHNV TRÊN TÔM SÚ 130 Thông tin ao nuôi tôm mô hình 130 Sự diện IHHNV tôm nuôi mô hình nuôi 131 VI 1.1 Mô hình quảng canh Bạc Liêu Cà Mau .131 1.2 Mô hình nuôi bán thâm canh Bạc Liêu Trà Vinh 133 1.3 Điều tra thu mẫu tôm thẻ chân trắng nuôi bán thâm canh Bến Tre137 1.4 Mô hình nuôi thâm canh 140 1.5 Trang trại sản xuất giống 144 Sự diện IHHNV tôm bố mẹ tự nhiên 148 Xác định tỷ lệ nhiễm IHHNV tôm sú theo độ tuổi 150 Đánh giá ảnh hưởng IHHNV lên trọng lượng kích thước 152 Đề xuất giải pháp hạn chế lây lan 154 VIII KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 156 5.1 Kết Luận .156 5.2 Đề nghị 158 TÀI LIỆU THAM KHẢO .159 VII DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc gen chủng IHHNV phân lập Mỹ (AF273215, Shike ctv., 2000) Hình 2.2 Tôm sú (P monodon) 50 ngày tuổi bị nhiễm IHHNV với kích thước khác (Rai ctv., 2009) 18 Hình 2.3 Một lát cắt mô học tôm sú nhiễm IHHNV nhuộm với H& E 19 Hình 6.1 Sơ đồ vị trí thiết kế mồi genome IHHNV type lây nhiễm thu nhận Đồng Bằng Sông Cửu Long 39 Hình 6.2 Cấu trúc mồi khuếch đại phương pháp LAMP (Eiken Genome) 45 Hình 6.3 Cấu trúc sản phẩm phương pháp LAMP (Eiken Genome) 45 Hình 6.4 Sơ đồ vị trí nucleotide mồi thiết kế bắt genome IHHNV type lây nhiễm 47 Hình 6.5 Vị trí vùng thu mẫu tôm sú nuôi mô hình nuôi Đồng Bằng Sông Cửu Long 61 Hình 7.1 A Kết điện di sàng lọc mẫu không nhiễm virus IHHNV type lây nhiễm 68 Hình 7.1B Kết sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B với quy trình cặp mồi MG831F/R, IHHNV ABF/R 68 Hình 7.2 Kết kiểm tra dòng tế bào JM109 chứa vector pGEM T-easy-DNA IHHNV type A/B (1200 bp) 69 Hình 7.3 Kết điện di kiểm tra plasmid sau tinh 70 Hình 7.4 Trình tự nucleotide phần gen IHHNV type A từ mẫu thu nhận ĐBSCL/Việt Nam 70 Hình 7.5 Kết di truyền IHHNV type A từ mẫu thu nhận ĐBSCL 72 Hình 7.6 Kết sàng lọc mẫu IHHNV type lây nhiễm với quy trình cặp mồi: 77012F/77353R; 309F/R 279F/940R 73 Hình 7.8 Trình tự a.a protein khởi đầu chép I II với vùng NTP liên kết enzyme helicase A, B C protein mã hóa ORF1 81 VIII Hình 7.9 Kết phân tích so sánh trình tự chủng IHHNV thu nhận tỉnh ĐBSCL, Vũng tàu tỉnh khác Miền Trung 84 Hình 7.10 Trình tự thay đổi nucleotide (in đậm đỏ) vị trí nt 462 gen so với chủng IHHNV đoạn OFR2, vị trí A tô đậm vàng 89 Hình 7.11 Cấu trúc ORF trình tự gen chủng IHHNV – VT6 Ba khung đọc mở (ORF1, ORF2, ORF3) với vị trí chiều dài chúng 90 Hình 7.12 Cấu trúc ORF trình tự gen chủng IHHNV – NT22 Ba khung đọc mở (ORF1, ORF2, ORF3) với vị trí chiều dài chúng 90 Hình 7.13 Trình tự thay đổi nucleotide (in đậm đỏ) vị trí nt 1118 so với chủng IHHNV-NT22 đoạn OFR1 91 Hình 7.14 Cây di truyền so sách trình tự nucleotide đoạn 2,9 kb chủng IHHNV thu nhận tỉnh ĐBSCL, Vũng Tàu, Ninh Thuận với chủng IHHNV 93 Hình 7.15 Kiểm tra khuẩn lạc mang DNA IHHNV type lây nhiễm PCR 95 Hình 7.16 Kết điện di plasmid sau tinh Giếng plasmid: Plasmid pGEM T-easy - IHHNV type lây nhiễm sau tinh có kích thước 5604 bp M: thang DNA 100 bp 96 Hình 7.17 Kết thử nghiệm điều kiện chuẩn quy trình LAMP phát IHHNV (He Xu, 2011) 97 Hình 7.18 Kết thử nghiệm nồng độ Mg2+ Giếng (+): Mẫu tôm nhiễm IHHNV; Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV 98 Hình 7.19 Kết thử nghiệm nồng độ dNTPs 99 Hình 7.20 Kết thử nghiệm nhiệt độ phản ứng Giếng (+): Mẫu DNA IHHNV; Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV 100 Hình 7.21 Kết thử nghiệm điều kiện chuẩn quy trình LAMP thiết kế phát IHHNV 101 Hình 7.22 Kết thử nghiệm nhiệt độ ủ Giếng (+): DNA IHHNV; Giếng (-): mẫu tôm không nhiễm IHHNV 102 Hình 7.23 Kết phản ứng LAMP khảo sát nồng độ dNTPs 103 IX Hình 7.24 Kết khảo sát Mg2+ phản ứng LAMP DNA IHHNV (+) mẫu nước (-) 103 Hình 7.25 Kết thử nghiệm thời gian ủ (15, 30, 45, 60 75 phút) Giếng (+): Mẫu DNA IHHNV; Giếng (-): nước 104 Hình 7.26 Kết thử nghiệm qui trình LAMP thiết kế sau tối ưu hóa 104 Hình 7.27 So sánh trình tự mồi thiết kế với trình tự IHHNV type A B phần mềm ClustalW2 106 Hình 7.28 Kết điện di khảo sát hoạt động mồi thiết kế vnIHF/R kết hợp mồi vnIHF/R & 309F/R 108 Hình 7.29 Kết tối ưu nồng độ dNTP Mg2+ phản ứng multiplex PCR 109 Hình 7.30 Kết khảo sát độ nhạy lần quy trình multiplex PCR 110 Hình 7.31 Kết khảo sát độ nhạy lần quy trình multiplex PCR chẩn đoán virus IHHN 111 Hình 7.32 Kết so sánh độ nhạy quy trình multiplex PCR 112 Hình 7.33 Kết so sánh độ nhạy quy trình multiplex PCR 112 Hình 7.34 Kết điện di sản phẩm khuếch đại thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu quy trình multiplex PCR tối ưu 113 Hình 7.35 Kết phân tích multiplex PCR mẫu trứng giai đoạn ấu trùng tôm mẹ 115 Hình 7.36 Kết sàng lọc tôm sú tôm thẻ nhiễm IHHNV với quy trình multiplex PCR 118 Hình 7.37 Bể bố trí thí nghiệm lây nhiễm loài khác loài 119 Hình 7.38 Biểu đồ kết lây nhiễm tôm sú loài sau 7, 14, 21 28 ngày 120 Hình 7.38: Kết phân tích multiplex PCR mẫu tôm lây nhiễm Sản phẩm sau khuếch đại có kích thước 997 309 bp 121 Hình 7.40 Kiểm tra IHHNV multiplex PCR với mẫu tôm thí nghiệm lây nhiễm khác loài 123 X Hình 7.41 Biểu đồ so sánh tỉ lệ nhiễm IHHNV (%) nhóm thí nghiệm sau 14, 21 28 ngày lây nhiễm 125 Hình 7.42 Quan sát, biểu hình thái tôm sau lây nhiễm 14 ngày 128 Hình 7.43 Lát cắt mô học phần mang tôm sú đối chứng nhiễm IHHNV sau 28 sau 128 ngày 129 Hình 7.44 Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV mô hình tôm sú nuôi quảng canh Cà Mau Bạc Liêu 132 Hình 7.45 Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV mô hình tôm nuôi bán thâm canh Trà Vinh Bạc Liêu 134 Hình 7.46 Tỷ lệ nhiễm IHHNV tôm nuôi ao nuôi bán thâm canh Bạc Liêu Trà Vinh năm 2012 135 Hình 7.47 Tỷ lệ nhiễm IHHNV tôm nuôi ao nuôi bán thâm canh Bạc Liêu Trà Vinh năm 2013 135 Hình 7.48 Tôm thẻ chân trắng bị nhiễm IHHNV mô hình nuôi bán thâm canh Bến Tre 138 Hình 7.49 Đồ thị tỷ lệ nhiễm IHHNV tôm thẻ nuôi mô hình bán thâm canh Bến Tre 140 Hình 7.50 Tỷ lệ nhiễm IHHNV tôm sú nuôi mô hình thâm canh năm 2012 Kiên Giang Sóc Trăng 141 Hình 7.51 Biểu đồ tỷ lệ nhiễm IHHNV giai đoạn ấu trùng mẹ từ trại ương khác Miền Nam Miền Trung 145 Hình 7.52 Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm IHHNV (%) nhóm tuổi 151 Hình 7.53 Sơ đồ thể tương quang nhóm không nhiễm (-) nhiễm IHHNV (+) lên trung bình trọng lượng chiều dài tôm độ tuổi khác (M±SD) 154 XI DANH MỤC BẢNG Bảng 6.1 Mồi thiết kế công bố tạp chí giới .27 Bảng 6.2 Giả định kết sàng lọc mẫu nhiễm IHHNV type A/B 29 Bảng 6.3 Trình tự cặp mồi để khuếch đại gen IHHNV type lây nhiễm để giải trình tự Công ty Nam Khoa cung cấp .31 Bảng 6.4 Mồi sử dụng nghiên cứu 39 Bảng 6.5 Trình tự mồi thiết kế để khuếch đại gen IHHNV type lây nhiễm 47 Bảng 6.6 Phương pháp lây nhiễu IHHNV tôm sú với mẫu bệnh phẩm tôm sú nhiễm IHHNV tôm thẻ nhiễm IHHNV 57 Bảng 6.7 Số lượng mẫu mô hình nuôi khu vực thu mẫu 62 Bảng 6.8 Phân loại quy mô trại sản xuất giống 63 Bảng 7.1 Kết thu nhận mẫu tôm sú khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long tỉnh khác 66 Bảng 7.2a Mức độ tương đồng (%) trình tự acid amin giả định mã hóa ORF chủng IHHNV Kiên Giang với chủng khác Genbank .82 Bảng 7.2b Sự thay đổi a.a protein vỏ dịch mã từ ORF3 chủng IHHNV Kiên Giang với chủng IHHNV từ GenBank có tương đồng trình tự gần .84 Bảng 7.2 Trình tự tương đồng nucleotide 2,9 kb gen chủng thu nhận tỉnh ĐBSCL, Vũng tàu tỉnh khác Miền Trung với số chủng nước khác giới 86 Bảng 7.3 Tóm tắt thành phần nucleotide trình tự gen chủng IHHNV 88 Bảng 7.4 Kết đo OD plasmid pGEMT-easy-IHHNV type lây nhiễm .96 Bảng 7.5 Kết phân tích multiplex PCR mẫu trứng giai đoạn ấu trùng thu từ cá thể tôm mẹ nhiễm không nhiễm IHHNV 116 Bảng 7.6 So sánh thống kê số lượng Nauplii nở từ tôm mẹ nhiễm không nhiễm IHHNV 117 Bảng 7.7 Thông tin chi tiết mô hình nuôi 130 XII Bảng 7.8 Tỷ lệ nhiễm IHHNV mẫu tôm nuôi mô hình Quảng canh Cà Mau Bạc Liêu .133 Bảng 7.9 Tỷ lệ nhiễm IHHNV ao tôm nuôi sú mô hình bán thâm canh Trà Vinh Bạc Liêu năm 2013 137 Bảng 7.10 Tỷ lệ nhiễm IHHNV tôm thẻ mô hình bán thâm canh Bến Tre .138 Bảng 7.11 Kết phân tích IHHNV nhiễm mẫu tôm nuôi Kiên Giang Sóc Trăng năm 2012 .142 Bảng 7.12 Tỷ lệ nhiễm IHHNV ao tôm nuôi thẻ mô hình thâm canh Bến Tre, Sóc Trăng Kiên Giang 143 Bảng 7.13 Phân loại qui mô trại sản xuất giống .144 Bảng 7.14 Kết phân tích PCR mẫu tôm thu trại giống lớn nhỏ Miền Trung Miền Nam 146 Bảng 7.15 Tỷ lệ nhiễm IHHNV quần đàn tôm sú Việt Nam nhập từ Ấn Độ Dương Thái Bình Dương phát Mutiplex PCR chân bơi tôm sú 149 Bảng 7.16 Kết theo dõi tôm sú phát triển trọng lượng kích thước nhóm tôm nhiễm không nhiễm IHHNV theo ngày tuổi 153 XIII DANH MỤC VIẾT TẮT Aa: Acid amin Bp: Base pair ĐBSCL: Đồng sông Cửu Long DNA: Deoxynucleotide acid MrNV XSV: Macrobrachium rosenbergii Nodavirus Extra small virus NS protein: Non-structural protein: Protein không cấu trúc Nt: Nucleotide NTP – binding: Nucleoside triphosphate OIE: Office Internationnal des Epizooties ORF: Operon reading frame Peneaus sp.: Penaeus sp PCR: Polymerase Chain Reaction PL: Postlarvae: Hậu ấu trùng RCR – motifs: Rolling circle replication – motifs: Motifs khởi đầu chép cuộn vòng RDS: Runt deformity syndrome: Hội chứng dị dạng còi RT – PCR: Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction: PCR phiên mã ngược SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacralamide gel electrophoresis: Điện di gel polyacralamide UMSFP: Chương trình trang trại nuôi tôm nước mặn Hoa Kỳ WSSV: White spot symdrome virus: Virus gây hội chứng đốm trắng Ppt: parts per thousand: phần ngàn XIV PHỤ LỤC Phụ lục Kết kiểm tra diện IHHNV tôm lây nhiễm vào ngày thứ 7, 14, 21 28 ngày loài Nghiệm thức Nhóm Nhóm Nhóm Số bể thí nghiệm Số tôm nhiễm sau ngày Số tôm nhiễm sau 14 ngày Trung bình Trung bình Bể Bể Bể (%)± SD Bể Bể Bể (%)± SD 4 8 40,0±10,0 60,0±15,28 30,0±26,46 46,67±20,82 7 53,33±23,09 66,67±17,32 Số tôm nhiễm sau 21 ngày Số tôm nhiễm sau 28 ngày 63,33±11,55 10 86,67±25,17 56,67±25,17 6 60,0±20,0 70,0±20,0 7 9 76,67±5,8 0 0 0 0 Nhóm Nhóm Nhóm Đối chứng Nhóm 1: tôm sống chung tôm bệnh; Nhóm 2: cho ăn tôm bệnh ngày liên tục; Nhóm 3: tôm sống chung tôm bệnh cho ăn tôm bệnh ngày liên tục Đối chứng: nghiệm thức tương tự nghiệm thức gây nhiễm sử dụng khỏe ăn sống chung Phụ lục Kết kiểm tra diện IHHNV tôm lây nhiễm vào ngày thứ 7, 14, 21 28 ngày Nghiệm thức Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Nhóm Đối chứng Số bể thí nghiệm Số tôm nhiễm sau ngày Số tôm nhiễm sau 14 ngày Trung bình Trung bình Bể Bể Bể (%)± SD Bể Bể Bể (%)± SD 30,0±20,0 3 33,33±5,77 20,0±20,0 2 26,67±11,55 23,33±15,28 30,00±10,0 Số tôm nhiễm sau 21 ngày Số tôm nhiễm sau 28 ngày 4 36,67±5,77 7 66,67±5,77 2 26,67±11,55 4 40,00±0,0 6 56,67±5,77 10 80,00±20,0 0 0 0 0 XV Phụ lục Bảng tổng hợp tỷ lệ nhiễm IHHNV tôm sú tôm thẻ mô hình nuôi trại giống Khu vực Loại tôm Năm Hình thức nuôi Cà mau Sú 2012 Quảng canh Bạc Liêu Sú 2012 Quảng canh 2012 Bán thâm canh 2013 Bán thâm canh Trà Vinh Sú Đợt Tổng Tổng Tổng Tổng Tổng Bạc Liêu 2012 Bán thâm canh 2013 Bán thâm canh Sú Kiên Giang trại Sú 2012 Thâm canh Kiên Giang trại Sú 2012 Thâm canh Tổng Tổng Tổng XVI Mẫu Tỉ lệ Mẫu phân nhiễm (%) nhiễm tích (P≤0,005) 22 9,09±12,0% 22 40,9±120,5% 22 11 50,00±20,9% 22 19 86,36±14,3% 88 41 46,59±10,4% 19 10,53±13,8% 20 10,00±13,1% 22 10 45,45±20,8% 22 13 59,09±20,5% 83 27 32,53±10,1% 29 10 34,48±17,3% 11 45,45±29,4% 80,00±35,1% 0.00 0,00% 45 19 42,22±14,4% 15 53,33±25,2% 15 12 80,00±20,2% 13 12 92,31±14,5% 13 12 92,31±14,5% 56 44 78,57±10,7% 101 63 62,38±9,4% 48 18,75±11,0% 29 12 41,38±17,9% 19 36,84±21,7% 42,86±36,7% 93 31 33,33±9,6% 15 33,33±23,9% 13 30,77±25,1% 14 64,29±25,1% 10 80,00±24,8% 52 26 50,00±13,6% 12,50±22,9% 50,00±34,6% 37,50±33,5% 62,50±% 32 13 40,63±17,02% 25,00±42,4% 50,00±49,0% Sóc Trăng Sú 2012 Thâm canh Bến Tre Thẻ 2013 Bán thâm canh Sóc Trăng Thẻ 2013 Thâm canh Kiên Giang trại Thẻ 2013 Thâm canh Kiên Giang trại Thẻ 2013 Thâm canh Bến Tre Thẻ 2012 Trại giống lớn Miền Trung Tôm sú giống Trại giống nhỏ Miền Trung Tôm sú giống Trại giống nhỏ Miền Nam Ấn Độ Dương Tôm sú giống Sú 2013 20132014 20132014 2013 Tổng Tổng Tổng Tổng Tổng Tổng Thâm canh N Z M P Mẹ N Z M P Mẹ N Z M P Mẹ Bố mẹ XVII 12 8 16 19 12 10 10 51 15 17 32 10 10 10 10 40 11 0 11 22 0.00 1 13 5 0 2 0 0 25,00±42,4% 0,00% 33,33±26,7% 37,50±33,5% 25,00±22,7% 31,25±% 36,84±21,7% 8,33±15,6% 10,00±18,6% 40,00±30,4% 25,49±12,0% 0,00% 29,41±21,7% 15,63±12,6% 0,00% 0,00% 0,00% 20,00±24,8% 5,00±6,8% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 0,00% 20 0,00% 68 68 68 68 53 46 46 46 46 30 51 51 51 43 35 10 18 24 22 31 37 37 22 19 20 24 17 18 2,94±4,0% 8,82±6,7% 14,71±8,4% 26,47±10,5% 45,28±13,4% 47,83±14,4% 67,39±13,5% 80,43±11,5% 80,43±11,5% 73,33±15,8% 37,25±13,3% 39,22±13,4% 47,06±13,7% 39,53±14,6% 51,43±16,6% 134 13 9,70±5,0% Đà Nẵng Phú Yên Rạch Gốc Thái Bình Dương Vũng Tàu Sú 2013 2013 2013 Bố mẹ Bố mẹ Bố mẹ 113 47 135 52 30 79 46,02±% 63,83±% 58,52±8,3% 2013 Bố mẹ 126 15 11,90±5,7% 20132014 Tôm Post 117 3,42±3,3% Tổng nhà 138 XVIII 72 52,17±8,3% Phụ lục Bảng phân phối student Bảng Giá trị 0.0005 0.001 0.0015 0.002 0.0025 0.003 0.0035 0.004 0.0045 0.005 0.0055 0.006 0.0065 0.007 0.0075 0.008 0.0085 0.009 0.0095 0.01 0.0105 0.011 0.0115 0.012 0.0125 0.013 0.0135 0.014 0.0145 0.015 3.29048 3.09024 2.96772 2.87815 2.80706 2.74777 2.69683 2.65209 2.61207 2.576 2.54269 2.51213 2.48376 2.45727 2.43239 2.40892 2.3867 2.36561 2.34553 2.326 2.30799 2.29036 2.27343 2.25713 2.2414 2.22621 2.21151 2.19728 2.18348 2.17 0.0155 0.016 0.0165 0.017 0.0175 0.018 0.0185 0.019 0.0195 0.02 0.0205 0.021 0.0215 0.022 0.0225 0.023 0.0235 0.024 0.0245 0.025 0.0255 0.026 0.0265 0.027 0.0275 0.028 0.0285 0.029 0.0295 0.03 2.157067 2.144407 2.132083 2.120069 2.108354 2.096931 2.085762 2.074848 2.064189 2.054 2.043525 2.033521 2.023708 2.014094 2.004654 1.995395 1.9863 1.977369 1.968592 1.96 1.951475 1.943135 1.934923 1.926837 1.918879 1.91103 1.903309 1.895696 1.888193 1.88 0.0305 0.031 0.0315 0.032 0.0325 0.033 0.0335 0.034 0.0345 0.035 0.0355 0.036 0.0365 0.037 0.0375 0.038 0.0385 0.039 0.0395 0.04 0.0405 0.041 0.0415 0.042 0.0425 0.043 0.0435 0.044 0.0445 0.045 1.8734954 1.8662922 1.8591891 1.8521769 1.8452556 1.8384253 1.8316769 1.8250057 1.8184164 1.812 1.8054743 1.7991169 1.7928323 1.7866114 1.7804632 1.7743787 1.7683669 1.7624097 1.7565162 1.751 1.7449111 1.7391994 1.7335378 1.7279308 1.7223829 1.716885 1.7114417 1.7060438 1.700696 1.695 0.05 0.055 1.645 1.59819 0.2 0.205 0.842 0.823893 0.35 0.355 0.385 0.371856 XIX 0.06 0.065 0.07 0.075 0.08 0.085 0.09 0.095 0.1 0.105 0.11 0.115 0.12 0.125 0.13 0.135 0.14 0.145 0.15 0.155 0.16 0.165 0.17 0.175 0.18 0.185 0.19 0.195 1.55477 1.5141 1.47579 1.43953 1.40507 1.3722 1.34075 1.31058 1.282 1.25357 1.22653 1.20036 1.17499 1.15035 1.12639 1.10306 1.08032 1.05812 1.036 1.01522 0.99446 0.97411 0.95416 0.93459 0.91537 0.89647 0.8779 0.85962 0.21 0.215 0.22 0.225 0.23 0.235 0.24 0.245 0.25 0.255 0.26 0.265 0.27 0.275 0.28 0.285 0.29 0.295 0.3 0.305 0.31 0.315 0.32 0.325 0.33 0.335 0.34 0.345 0.806422 0.789191 0.772193 0.755415 0.738846 0.722479 0.706302 0.690309 0.675 0.658838 0.643345 0.628006 0.612813 0.597761 0.582841 0.568052 0.553384 0.538836 0.524 0.510074 0.49585 0.481728 0.467699 0.453763 0.439913 0.426148 0.412463 0.398855 XX 0.36 0.365 0.37 0.375 0.38 0.385 0.39 0.395 0.4 0.405 0.41 0.415 0.42 0.425 0.43 0.435 0.44 0.445 0.45 0.455 0.46 0.465 0.47 0.475 0.48 0.485 0.49 0.495 0.3584591 0.345126 0.3318542 0.3186392 0.3054811 0.2923753 0.2793195 0.2663114 0.253 0.2404261 0.2275453 0.2147021 0.2018942 0.1891181 0.1763738 0.163659 0.1509693 0.1383046 0.126 0.1130388 0.1004332 0.0878447 0.0752698 0.0627062 0.0501541 0.0376076 0.0250691 0.0125328