ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN BÙI NGUYỄN TÚ ANH CHUẨN HỐ QUY TRÌNH TẠO MƠ HÌNH CHUỘT ĐÁI THÁO ĐƢỜNG TP VÀ BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG GIẢM ĐƢỜNG HUYẾT CỦA VIỆC GHÉP TẾ BÀO GỐC MƠ MỠ TRÊN MƠ HÌNH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm hướng Sinh lý động vật Cán hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Phương Dung ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Họ tên HVCH: BÙI NGUYỄN TÚ ANH ĐỀ CƢƠNG NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ Tên đề tài: CHUẨN HỐ QUY TRÌNH TẠO MƠ HÌNH CHUỘT ĐÁI THÁO ĐƢỜNG TUÝP VÀ BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG GIẢM ĐƢỜNG HUYẾT CỦA VIỆC GHÉP TẾ BÀO GỐC MƠ MỠ TRÊN MƠ HÌNH Chun ngành: Sinh học thực nghiệm hướng Sinh lý động vật Mã số chuyên ngành: 60 42 01 14 Cán hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Phương Dung Tp HCM, ngày 30 tháng 12 năm 2014 MỤC LỤC Tính cấp thiết đề tài Giới thiệu tổng quan 2.1 Bệnh đái tháo đường 2.1.1 Tổng quan bệnh đái tháo đường tuýp 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh đái tháo đường 2.1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới .3 2.1.2.2 Tình hình nghiên cứu nước 2.2 Mơ hình động vật .5 2.2.1 Giới thiệu mơ hình động vật bệnh lý 2.2.2 Mơ hình đài tháo đường 2.2.2.1 Các phương pháp tạo động vật bệnh đái tháo đường 2.2.2.2 Tình hình nghiên cứu mơ hình bệnh đái tháo đường STZ 2.2.2.3 Đặc tính hóa lý Streptozotocine .7 2.3 Liệu pháp tế bào gốc trung mô điều trị 2.3.1 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ .9 2.3.2 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh đái tháo đường type Mục đích nghiên cứu 10 Đối tượng nghiên cứu .10 Các phương pháp nghiên cứu 11 5.1 Cách tiếp cận 11 5.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 12 5.3 Phương pháp thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột 13 5.4 Phương pháp cấy chuyền 13 5.5 Phương pháp tạo mơ hình chuột đái tháo đường tuýp 14 5.6 Phương pháp đánh giá đường huyết 14 5.7 Phương pháp đánh giá sinh lý 15 5.8 Phương pháp đánh giá khả dung nạp đường 15 5.9 Phương pháp đánh giá khả dung nạp insulin 16 5.10 Phương pháp đánh giá mô học .16 5.11 Phương pháp hóa mơ miễn dịch huỳnh quang .17 5.12 Phương pháp định lượng HbA1C 17 5.13 Phương pháp định lượng Insulin 17 5.14 Phương pháp nhuộm Dithizone để xác định đảo tụy 18 Nội dung phạm vi vấn đề sâu nghiên cứu 18 Kết dự kiến .19 Nơi thực đề tài nghiên cứu luận văn 19 Thời gian thực đề tài .19 10 Tài liệu tham khảo .19 Tính cấp thiết đề tài Hiện nay, đái tháo đường tiến triển với tốc độ nhanh chóng gây nguy hại cho sức khỏe nhiều người giới Việt Nam Việt Nam nước có tỷ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh giới (khoảng - 10%/năm) (Cơng bố dự án xã hội hố hoạt động truyền thơng chương trình mục tiêu quốc gia phịng, chống bệnh đái tháo đường, 2009) Vì vậy, mức độ nguy hiểm bệnh đái tháo đường đánh giá ngang với bệnh dịch ung thư Năm 2012, theo công bố Bệnh viện Nội tiết Trung ương, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường 5,7% số bệnh nhân có khả tăng gấp đơi vào năm 2020 (Hội Nội tiết Đái tháo đường Việt Nam) Việc điều trị bệnh đái tháo đường có chi phí cao, chiến lược điều trị đái tháo đường từ cổ điển ngày liệu pháp sử dụng insulin thuốc nhằm kiểm soát đường huyết Bệnh nhân phụ thuộc hoàn toàn vào tác nhân ngoại sinh, việc sử dụng insulin thường xuyên có tác dụng phụ lớn, đặc biệt kháng insulin hay loạn dưỡng mỡ Sự hạn chế phương pháp dẫn đến phát triển phương pháp ghép tụy đảo tụy (1966) Tuy nhiên, khan nguồn mơ ghép nên phương pháp gặp nhiều khó khăn Để khắc phục nhược điểm chiến lược điều trị trên, thập niên qua, hàng trăm nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh đái tháo đường tiến hành Các nghiên cứu thực nghiệm cận lâm sàng nhiều đối tượng chuột, chó… đạt kết khả quan (Dong et al., 2008; Figliuzzi et al., 2009; Kadama et al., 2009; Ito et al., 2010; Jurewicz et al., 2010; Rackham et al., 2011) Điều chứng tỏ việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh đái tháo đường có sở triển vọng điều trị lâm sàng Trong đó, tế bào gốc từ mô mỡ (ADSC) dần nhà khoa học tiếp cận nghiên cứu đặc tính vượt trội như: nguồn dồi dào, thu nhận dễ dàng, xâm lấn, ghép tự thân… Cùng với việc pháp triển liệu pháp chữa trị, việc phát triển mơ hình thực nghiệm nhằm đánh giá hiệu điều trị quan tâm Việc thử nghiệm liệu pháp điều trị ngưởi gặp phải số vấn đề rào cản y đức luật pháp, đó, mơ hình động vật đái tháo đường trở thành mơ hình hữu ích để thử nghiệm liệu pháp việc điều trị bệnh Tuy nhiên Việt Nam, việc nghiên cứu xây dựng mơ hình bệnh lý đái tháo đường động vật chưa phổ biến Các đề tài chủ yếu dừng lại việc đánh giá đường huyết Chưa có cơng bố chứng minh xây dựng hồn chỉnh mơ hình cách có hệ thống Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài: “Chuẩn hóa mơ hình chuột đái tháo đường tuýp bước đầu khảo sát tác động tế bào gốc mô mỡ lên đường huyết” Việc thực thành công đề tài mang tính thiết yếu quan trọng cho mục tiêu thử nghiệm liệu pháp chữa trị bệnh đái tháo đường tế bào gốc tương lai Giới thiệu tổng quan 2.1 Bệnh đái tháo đƣờng 2.1.1 Tổng quan bệnh đái tháo đƣờng tuýp Đái tháo đường bệnh tổn thương hay suy giảm chức tế bào beta tụy đảo, từ làm giảm lượng insulin tiết vào máu, dẫn tới tăng cao nồng độ đường huyết máu Trên giới có 200 triệu người bị đái tháo đường theo tính tốn số tăng lên gấp đôi vào năm 2025 (Halban cs) Trong năm 2007, tổng chi phí cho việc chẩn đốn bệnh đái tháo đường ước tính 174 tỉ la, 116 tỉ chi phí trực tiếp liên quan đến y khoa 58 tỉ chi phí gián tiếp (liên quan đến bệnh tật, thất nghiệp, ) (American Diabetes Association, 2007) Đái tháo đường bệnh mạn tính với nhiều triệu chứng phức tạp như: khơng có khả kiểm sốt đường huyết có nhiều biến chứng nguy hiểm Hai dạng phổ biến thường gặp là: đái tháo đường tuýp tuýp Cả hai dạng có đặc điểm chung đường huyết q cao khơng kiểm sốt Theo số liệu the International Diabetes Federation, giới có khoảng 16 triệu người bệnh đái tháo đường tuýp 1, chiếm khoảng 10% tổng số ca bệnh đái tháo đường Bệnh đái tháo đường tuýp cho dạng bệnh tự miễn di truyền, theo tế bào tiết insulin tụy bị tiêu diệt hệ miễn dịch (Eisenbarth, 1986) Tuy nhiên, nghiên cứu bệnh đái tháo đường tuýp cặp song sinh cho thấy yếu tố di truyền yếu tố mơi trường số yếu tố khác giết chết tế bào tiết insulin; hay nói cách khác đái tháo đường tuýp dạng bệnh suy thoái tế bào chưa rõ nguyên nhân (Barnett et al) Dù nguyên nhân kết bệnh đái tháo đường tuýp số lượng tế bào tiết insulin giảm sút nghiêm trọng, hậu thể không sản xuất đủ insulin (She & Marron, 1998 Onengut-Gumuscu & Concannon, 2002) Mặc dù, bệnh đái tháo đường tuýp kiểm soát ngày cách bổ sung insulin vào thể, khả kiểm soát đường huyết nguyên nhân dẫn đến số biến chứng nghiêm trọng khác như: bệnh lý võng mạc, mù lòa, rối loạn tim mạch, suy thận, bệnh mạch máu não… 2.1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh đái tháo đƣờng 2.1.2.1 Tình hình nghiên cứu giới Liệu pháp điều trị phổ biến cho đái tháo đường bổ sung insulin thuốc ngày Liệu pháp nhằm kiểm sốt tình trạng đường huyết khơng chữa lành bệnh Liệu pháp sử dụng thuốc insulin ngày giúp cải thiện đường huyết giảm biến chứng bệnh võng mạc bệnh thận (Chrisholm, 1993) Tuy nhiên, liệu pháp insulin mang lại nhiều rủi ro có liên quan đến tăng đường huyết Bởi hạn chế này, phương pháp điều trị không dựa vào insulin ngoại sinh điều cần thiết điều trị đái tháo đường Hướng cần phải có dạng insulin thay mà đáp ứng với thay đổi đường huyết phút một; liệu pháp sử dụng tế bào thay tế bào tiết insulin thể xem xét Các phương pháp cấy ghép toàn tuyến tụy cấy ghép đảo tụy từ người cho phát triển Việc cấy ghép tụy đảo tụy thật phương pháp điều trị tiềm cho bệnh đái tháo đường So với liệu pháp cấy ghép tồn tụy cấy ghép đảo tụy đơn giản liệu pháp có rủi ro định Thành phần ngoại tiết tụy chiếm đến 98% tụy lại không cần thiết cho việc điều hòa đường huyết So với cấy ghép tồn tuyến tụy việc phân lập cấy ghép đảo tụy mang tính logic Việc cấy ghép đảo tụy giúp cải thiện hiệu khả kiểm sốt đường huyết, đảo tụy thường thu nhận từ người hiến tặng nên bệnh nhân nhận mô ghép phải sử dụng thuốc ức chế miễn dịch thời gian dài; môt số thuốc ức chế miễn dịch làm ức chế khả tiết insulin mô ghép Thuận lợi liệu pháp cấy ghép đảo tụy bao gồm: cải thiện chất lượng sống, bệnh nhân không cần sử dụng thuốc insulin ngày, việc cấy ghép an toàn so với cấy ghép toàn đảo tụy Tuy nhiên, bất lợi liệu pháp cần số lượng lớn người hiến tụy thu nhận đủ số đảo tụy để cấy ghép cho bệnh nhân Trên thực tế, cần thu nhận đảo tụy từ tụy tạng đủ để ghép cho bệnh nhân Đó hạn chế lớn kỹ thuật Từ tiềm to lớn tế bào gốc khám phá, điều mang lại hi vọng sử dụng tế bào gốc phương pháp điều trị tốt cho bệnh đái tháo đường Hơn thập niên, hàng trăm nghiên cứu liệu pháp tế bào điều trị bệnh đái tháo đường tiến hành Các liệu pháp điều trị nguyên nhân gây bệnh mang lại kết ổn định lâu dài Vì vậy, thuật ngữ “tái tạo tuyến tụy” hình thành Đây thuyết liên quan đến việc sử dụng tế bào gốc để tái tạo tuyến tụy bị hư hại thành tuyến tụy khoẻ mạnh Đối với liệu pháp tế bào gốc điều trị đái tháo đường, nhà khoa học khảo sát nhiều bệnh nguyên đề nghị hai chiến lược là: liệu pháp tế bào gốc cho điều trị bệnh tự miễn liệu pháp tế bào gốc cho điều trị bệnh suy thối tế bào 2.1.2.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc Các nghiên cứu điều trị đái tháo đường nước ta chủ yếu nghiên cứu điều trị hỗ trợ điều trị đái tháo đường dược chất tự nhiên tổng hợp như: thực phẩm chức năng, tác dụng nụ vối (Trương Tuyết Mai et al., 2010, 2013), nấm dược liệu (Nguyễn Thị Chính et al., 2011)…(Cục Thơng tin Khoa học Công nghệ Quốc gia) Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc khảo sát đường huyết số tiêu sinh hóa máu chuyển hóa lipid, chống oxi hóa Ngồi ra, số nghiên cứu sản xuất insulin tái tổng hợp tiến hành Việt Nam nhằm hướng đến tự sản xuất cung cấp insulin cho người dân Việt Nam với giá thành phù hợp với điều kiện kinh tế phần đơng người dân Trong có nghiên cứu Tiến sĩ Lê Văn Phủng cộng (2010); hay nghiên cứu Phó Giáo sư Phạm Thành Hổ đồng nghiệp trường Đại học Khoa học Tự nhiên (2010) Tuy nhiên, phương pháp điều trị hay hỗ trợ điều trị mang tính chất điều trị triệu chứng (đường huyết cao) không mang lại hiệu tốt lâu dài ghép tạng Vì nguồn tạng nên hướng tiếp cận nhà nghiên cứu cập nhật điều trị đái tháo đường liệu pháp thay tế bào, đặc biệt tế bào gốc Việc nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh đái tháo đường xem bước đột phá lớn mở niềm hi vọng cho bệnh nhân bị bệnh đái tháo đường giới nói chung Việt Nam nói riêng Theo công bố khoa học nước thời điểm này, việc nghiên cứu thử nghiệm điều trị bệnh đái tháo đường công nghệ tế bào gốc đạt số kết định: khai thác thành công nguồn tế bào gốc khác tế bào gốc nhũ nhi (máu dây rốn, màng lót dây rốn,…) hay tế bào gốc trưởng thành (tủy xương, mô mỡ, máu kinh nguyệt,…) Các nguồn tế bào gốc khác kiểm tra đánh giá tiềm hình thành tế bào có khả sản xuất tiết insulin Cho tới thời điểm này, số nhóm nghiên cứu đạt số kết bước đầu việc sử dụng tế bào gốc hay tế bào tiết insulin biệt hóa từ tế bào gốc điều trị thử nghiệm mơ hình chuột đái tháo đường 2.2 Mơ hình động vật 2.2.1 Giới thiệu mơ hình động vật bệnh lý Việc sử dụng động vật để ứng dụng nghiên cứu sinh lý học có từ lâu đời Trong đó, Galen (130-200), coi ông tổ ngành phẫu thuật y khoa từ thời Hippocrates, người thực phẫu tích nghiên cứu mơ hình động vật để nghiên cứu sinh lý áp dụng cho người sau luật La Mã nghiêm cấm mổ tử thi Từ đến nay, hàng loạt thí nghiệm khác thực động vật động vật sử dụng mơ hình nghiên cứu Mơ hình động vật bệnh lý hiểu vật quần thể động vật di truyền tác động nhân tạo (vật lý, hóa học, sinh học…) mà phát triển rối loạn tương tự bệnh quan tâm người qua cách trực tiếp thông qua chất tương tự cung cấp dấu hiệu sinh lý bệnh Điều quan trọng định đặc điểm tương quan sinh lý bệnh lý động vật phải mô với người Ngày này, việc sử dụng động vật nghiên cứu y học đóng góp cho nhân loại kho tàng tri thức vô giá mặt thể giải phẫu, sinh lý học, bệnh lý học sau mô hình thử nghiệm di truyền học Với phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật, thập niên cuối kỷ XX, có nhiều mơ hình nghiên cứu phi động vật (quan sát giải phẫu tử thi sử dụng dòng tế bào người) để thay mơ hình động vật, đem lại giá trị khoa học định động vật mơ hình sử dụng ưu nghiên cứu y sinh học Mơ hình bệnh lý động vật thực cách tự nhiên thực tác nhân vật lý, hóa học hay sinh học, như:  Sử dụng Metrazol (Pentylenetrazol) để xây dựng mơ hình bệnh động kinh  Sự tạo miễn dịch kháng nguyên mạnh để gây đáp ứng miễn dịch để xây dựng mơ hình bệnh tự miễn, ví dụ EAE  Sự tắc nghẽn động mạch não mơ hình động vật mang bệnh đột quỵ thiếu máu cục  Gây bệnh cho động vật mầm bệnh để tạo mơ hình bệnh lây nhiễm người  Sử dụng xạ in hóa để tạo khối u  Liệu pháp gen (như mô hình chuột bệnh đái tháo đường) Ngày nay, ứng dụng mơ hình động vật ngày nhiều lĩnh vực y – dược học, mở nhiều hướng cho việc điều trị tìm hiểu chế bệnh lý 2.2.2 Mơ hình đài tháo đƣờng 2.2.2.1 Các phƣơng pháp tạo động vật bệnh đái tháo đƣờng Hiện biện pháp xây dựng mơ hình bệnh lý đái tháo đường phổ biến gồm phương pháp sau:  Cắt bỏ phần tụy  Sử dụng tác nhân gây sai hỏng gen tổng hợp protein insulin tạo mơ hình bệnh lý đái tháo đường tuýp1  Sử dụng virus Coxsackie B (CVB4, CVN5), Encephalomyocarditis, virus gây rubéole, virus quai bị Các virus coi tác nhân gây bệnh đái tháo đường chất độc mà tiết xâm nhập vào thể người  Sử dụng hóa chất gây bệnh đái tháo đường Hiện nay, hai loại hóa chất phổ biến thường dùng là: Streptozotocin Alloxan, từ hai loại hóa chất người ta xây dựng nhiều phương pháp tạo mô hình bệnh lý đái tháo đường động vật 2.2.2.2 Tình hình nghiên cứu mơ hình bệnh đái tháo đƣờng STZ Trên giới Hiện nay, bệnh đái tháo đường tuýp xây dựng số tác nhân phá hủy tế bào tuyến tụy có Streptozptocin (STZ) Alloxan thuốc thường sử dụng Việc xây dựng mơ hình bệnh lý đái tháo đường thực nhiều loài bao gồm loài linh trưởng (ngoại trừ người), chó, mèo, thỏ, động vật thuộc gặm nhấm Streptozotocin lần chứng minh gây bệnh đái tháo đường vào năm 1963 Rakieten cộng ơng, nhóm nhà khoa học thử chó chuột Rat chứng minh STZ có khả gây bệnh đái tháo đường từ STZ với Alloxan tác nhân sử dụng rộng rãi việc gây mơ hình bệnh lý đái tháo đường Trong nƣớc Hiện Việt Nam, việc nghiên cứu xây dựng mơ hình bệnh lý đái tháo đường động vật chưa phổ biến Hiện nay, đề tài chủ yếu nhằm vào mục đích đánh giá số thuốc trị đái tháo đường theo kinh nghiệm dân gian Trong hướng nghiên cứu sử dụng Streptozotocin Alloxan để xây dựng mơ hình bệnh lý đái tháo đường tuýp tuýp dừng lại việc đánh giá hiệu hạ đường huyết dược chất thiên nhiên Nhưng chưa có cơng trình cơng bố sâu vào chứng minh chuẩn hóa quy trình tạo mơ hình cách có hệ thống 2.2.2.3 Đặc tính hóa lý Streptozotocine Streptozotocin hỗn hợp alpha beta stereoisomer Nó có dạng bột kết tinh màu xám vàng trắng đục STZ tan nước, ketone alcol nồng độ thấp mức độ khơng đáng kể, STZ hịa tan dung dịch hữu STZ chất gây độc đặc biệt lên tế bào beta sản xuất insulin tụy động vật có vú STZ thuộc nhóm tác nhân alkyl hóa đặc biệt gọi nitrosoureas Việc thực cách gắn vào mạch DNA tế bào, tế bào khơng thể phân chia thành tế bào STZ hoạt động chống lại khối u, đồng thời gây tổn hại đến tế bào sản xuất isulin STZ chất kháng sinh, sản xuất Actinomycete - giống vi trùng (thuộc giống nấm không di động, gram dương, gây bệnh súc vật người), cụ thể Streptomyces achromogenes  Cuối thập niên 50, STZ chất kháng sinh, thống chủng nhà khoa học công ty thuốc Upjohn Kalamozoo, Michigan  Giữa thập niên 60: STZ tìm thấy chật gây độc có tính chọn lọc với tế bào beta đảo tụy  Thập niên 60 70: Viện ung thư Quốc gia khảo sát sử dụng STZ liệu pháp chữa ung thư hóa chất  Tháng 7/1982: FDA (Food and Drug Administration) Hiệp hội quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kì phê duyệt cách điều trị STZ cho ung thư tế bào đảo tụy STZ sử dụng rộng rãi để kháng khuẩn Tuy nhiên, việc sử dụng STZ để kháng khuẩn khơng cịn thơng dụng Chủ yếu sử dụng để trị liệu bệnh ung thư tế bào đảo tuỵ, khối u ác tính; dùng để nghiên cứu bệnh đái tháo đường chất độc tế bào beta tuyến tụy Ở nhiều lồi động vật, STZ gây bệnh đái tháo đường tương tự tăng đường huyết bệnh đái tháo đường người (Weir cộng sự, 1981) Nó có tác động nhanh hiệu nên sử dụng rộng rãi nghiên cứu đặc biệt làm giảm suy yếu tế bào β tuyến tụy (Karunanayake cộng sự, 1974) Khi đưa vào đường tĩnh mạch, nồng độ STZ huyết tương nhanh chóng giảm xuống vòng 15 phút tập trung gan thận (Sicor Phamaceuticals, 2003) Khoảng 20% thuốc (chuyển hóa nhóm chứa N-nitrosourea) chuyển hóa tiết thận (sicor pharmaceuticals, 2003) 2.3 Liệu pháp tế bào gốc trung mô điều trị 2.3.1 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Mô mỡ dạng mô liên kết mềm, tế bào mỡ kết nối với thành mạng lưới nhờ collagen Thành phần mô mỡ phức tạp, bao gồm nhiều loại tế bào tế bào mỡ trưởng thành, nguyên bào sợi, tế bào nội mô, tế bào tiền tạo mỡ, tế bào miễn dịch…, đó, tế bào gốc từ mô mỡ quan tâm nhiều Các nghiên cứu gần tế bào gốc từ mô mỡ phong phú Cùng với đó, tên gọi loại tế bào bào đa dạng tế bào đệm (ASCs), tế bào gốc trưởng thành có nguồn gốc từ mô mỡ (ADAS), tế bào gốc trung mơ mỡ (AdMSCs)… Do đó, Hiệp hội The International fat Applied Technology Socienty thống thuật ngữ Adipose-derived stem cells – ADSCs để tế bào gốc thu nhận từ mơ mỡ Hiện có nhiều nhóm nghiên cứu xem ADSC tế bào gốc trung mơ Vì tế bào ADSC sở hữu nhiều đặc tính tế bào gốc trung mơ Về đặc điểm hình thái ni cấy in vitro có dạng ngun bào sợi trì hình thái trình tăng sinh Một lý khiến nhiều nhà nghiên cứu cho ADSC tế bào gốc trung mơ khả biểu dương tính mạnh với số kháng nguyên bề mặt tế bào CD44, CD73, CD90 CD105; biểu hiệm âm tính với CD14 (kháng nguyên đặc trưng bạch cầu đơn nhân), CD34 (kháng nguyên tế bào gốc tạo máu), CD45 (kháng nguyên tế bào bạch cầu) HLA-DR (kháng nguyên tế bào trưởng thành) Nhiều nghiên cứu gần cho thấy, ADSC tế bào gốc đa có khả biệt hóa hóa thành nhiều loại tế bào khác tế bào mỡ, tế bào tạo xương, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào thần kinh Ngồi ra, ADSC cịn cho có khả tiết cytokine nhân tố tăng trưởng hỗ trợ trình tái tạo mơ ngăn cản q trình apoptosis 2.3.2 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh đái tháo đƣờng type Ghép đảo tụy gần xem phương pháp điều trị có hiệu bệnh nhân Tuy nhiên liệu pháp gặp nhiều khó khăn việc thu thập nguồn tụy để ghép Trên thực tế cần hai người hiến tụy đủ lượng tụy cho bệnh nhân Từ tiềm to lớn tế bào gốc khám phá, điều mang lại hi vọng sử dụng tế bào gốc phương pháp điều trị tốt cho bệnh đái tháo đường Tế bào gốc đóng vai trò quan trọng y học tái tạo phục hồi, xem công cụ hiệu việc ngăn chặn, sửa chữa thay quan bị hư hỏng Sử dụng tế bào gốc ADSC điều trị đái tháo đường mở hướng nghiên cứu ứng dụng, chiều rộng lẫn chiều sâu Các nghiên cứu giới cho thấy triển vọng việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc điều trị thành cơng đái tháo đường (Iskovich, 2012; Karaoz, 2013) Theo đó, liệu pháp tế bào gốc thể khả ứng dụng cao bệnh đái tháo đường tuýp Việc điều trị đái tháo đường tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thực nhiều nghiên cứu cho kết khả quan nhu cầu insulin giảm, đường huyết giảm ổn định nhiều tháng (Bassi, 2012; Li et al 2012; Dave et al., 2013) Nghiên cứu gần tế bào gốc mơ mỡ có khả cận tiết để bảo vệ chống lại tăng đường huyết Streptozotocin (Kono et al., 2014) Mục đích nghiên cứu Đề tài thực nhằm mục đích sau: - Chuẩn hóa thành cơng mơ hình chuột đái tháo đường tuýp Streptozotocine (STZ) đánh giá hiệu mơ hình tạo (tỷ lệ thành cơng, khả phục hồi mơ hình ) - Đánh giá tác động tế bào gốc mô mỡ lên đường huyết mơ hình chuột đái tháo đường tuýp Đối tƣợng nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu chuột nhắt trắng Balb/C Chuột ni hệ thống phịng Phịng thí nghiệm nghiên cứu ứng dụng Tế bào gốc Chuột sử dụng thí nghiệm chuột có trọng lượng từ 25-30 gram, nuôi ổn định tuần trước thí nghiệm áp dụng chu kỳ ngày đêm 12 sáng – 12 tối Quy trình chăm sóc q trình tiến hành thí nghiệm tuân theo quy định quy trình hướng dẫn Phịng Thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế Bào Gốc dành cho động vật thí nghiệm 10 Các phƣơng pháp nghiên cứu 5.1 Cách tiếp cận Về kiến thức: Thơng qua tìm đọc tổng hợp tài liệu bệnh đái tháo đường, nguyên nhân chế bệnh sinh bệnh, chế tác động STZ xây dựng mơ hình, sinh lý chuột (bình thường bệnh lý) tài liệu khác liên quan đề tài; thông qua kế thừa kết từ đề tài nước; thông qua kiến thức học tập khóa học hội nghị… Về kỹ thuật: thơng qua nghiên cứu, tìm hiểu chuẩn hóa quy trình kỹ thuật thao tác động vật, giải phẫu học, mô học kỹ thuật thường quy nghiên cứu bệnh đái tháo đường; thơng qua khóa tập huấn kỹ thuật từ phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào gốc; thông qua tài liệu hướng dẫn quy trình từ nhà sản xuất hóa chất dụng cụ… 11 5.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 12 5.3 Phương pháp thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột Việc thu nhận tế bào gốc trung mô từ mô mỡ thu nhận theo quy trình sử dụng Kit ADSC extraction công ty GeneWorld Nguyên tắc: Mô mỡ bao gồm nhiều loại tế bào tế bào mỡ trưởng thành, nguyên bào sợi, tế bào nội mô, tế bào tiền tạo mỡ, tế bào miễn dịch Tuy nhiên, mơi trường ni cấy thích hợp có tế bào ADSC có khả bám dính sau 5-7 ngày ni cấy Phương pháp: - Tiến hành gây mê chuột ketamine - Giải phẫu thu nhận mô mỡ từ vùng sinh dục chuột bỏ vào falcon chứa sẵn PBS- KS 5X - Rửa mẫu mỡ PBS KS5X từ 2-3 lần - Cắt nhuyễn mô mỡ huyền phù Washing buffer - Chuyển tồn mộ dịch mơ mỡ ly tâm 3500v/p 5phút - Thu nhận mô mỡ bổ sung Super Extract (100ul/1ml mỡ) - Ủ hỗn hợp 37 độ đến khối mỡ tan thành dạng huyền phù - Bổ sung 3ml Washing Buffer ly tâm 3500v/p phút - Loại bỏ mỡ dung dịch phía trên, thu nhận cặn - Rửa lại Washing Buffer đem nuôi cấy môi trường MSC cult kit - Thay mt sau 48h quan sát tế bào bám trải 5.4 Phương pháp cấy chuyền Nguyên tắc: Cấy chuyền nhằm cung cấp chất dinh dưỡng không gian cho phát triển tế bào ứng viên Các tế bào tế bào ứng viên, khơng bám dính, tế bào máu, hồng cầu loại bỏ dần sau lần cấy chuyền Phương pháp: - Khi tế bào nuôi cấy bám dính bình nuối cấy đạt mật độ từ 70 -80 % ta tiến hành cấy chuyền - Hút bỏ môi trường cũ Roux - Rửa lại PBS 2-3 lần 13 - Bổ sung thêm ml dung dịch Trypsin/EDTA 0,25%, ủ 37 độ quan sát đến tế bào bong hoàn toàn khỏi bề mặt nuôi cấy - Bổ sung 2ml môi trường MSC cult kit, chuyển toàn dịch huyền phù vào falcon - Ly tâm 2500v/p 10 phút - Loại dịch bổ sung 9ml môi trường MSC cult kit vào phần cặn tế bào - Huyền phù kỹ chia qua Roux - Chuyển Roux vào tủ ấm 37 độ để tiếp tuc nuôi cấy 5.5 Phương pháp tạo mơ hình chuột đái tháo đường Ngun tắc: STZ chất độc có cấu trúc giống đường, ưu tiên vận chuyển qua kênh Glut-2 (hiện diện nhiều tế bào beta đảo tụy) Do tính chất alkin hóa nó, STZ gây nên thay đổi cấu trúc đại phân tử, đứt gãy DNA phá hủy có chọn lọc tế bào beta, nguyên nhân tình trạng đái tháo đường phụ thuộc insullin (tuýp 1) Tiến hành: – Chuột tiêm thuốc STZ để tạo mơ hình đái tháo đường Thuốc tiêm theo đường tĩnh mạch xoang bụng với liều đơn 100mg/kg, 120mg/kg, 140mg/kg 160mg/kg (n=9) tiêm liên tục 50mg/kg ngày liên tục – Chuột bỏ đói 6giờ hoăc 24h trước tiêm – Sau tiêm STZ, chuột tiêm succrose 2g/kg vào xoang bụng để tránh sốc sau tiêm thuốc nhịn khát 4h để tránh đào thải thuốc qua thận – Lô đối chứng (n=9), tiêm buffer Natri-citrat (buffer dùng pha STZ) với thể tích tiêm tương tự lơ thí nghiệm Đánh giá kết quả: Mơ hình đái tháo đường đánh giá tiêu chính: – Đánh giá hiệu mơ hình: qua tỷ lệ sống/chết, sinh lý, mức đường huyết, cân nặng, mô học, khả dung nạp đường, khả dung nạp insulin, nhuộm tế bào đảo tụy lượng insulin, HbA1C máu 5.6 Phương pháp đánh giá đường huyết 14 Nguyên tắc: Đường huyết tiêu định khả thành cơng mơ hình động đái tháo đường Ở chuột đái tháo đường, khả sử dụng đường tế bào yếu, nồng độ đường máu ln tăng cao bình thường Tiến hành & đánh giá kết - Chuột không cần bỏ đói trước đo đo thời điểm 9-10h sáng – Chuột tiến hành đo đường huyết ngày/ lần bắng máy đo đường huyết One Touch Ultra hãng Lifescan – Johnson & Johnson (USA) – Máu tĩnh mạch từ đuôi chuột lấy để đưa lên que thử máy ghi nhận kết – Những chuột có đường huyết (khi no) 180mg/dL từ ngày thứ ổn định suốt tuần đánh giá bị đái tháo đường, cần kết hợp đánh giá khác trước kết luận 5.7 Phương pháp đánh giá sinh lý Nguyên tắc: Khi bị đái tháo đường, chuột có khả hấp thụ đường kém, dẫn tới việc tế bào ln bị thiếu lượng Do đó, cân nặng giảm hoạt động sinh lý bình thường Tiến hành & đánh giá kết – Chuột đo cân nặng đánh giá tiêu sinh lý ngày lần (cùng với khoảng thới gian đo đường huyết) – Các tiêu sinh lý cần khảo sát bao gồm: cân nặng, lượng thức ăn nước uống, khả hoạt động, lượng nước tiểu, tình trạng lơng, móng giác mạc… 5.8 Phương pháp đánh giá khả dung nạp đường Nguyên tắc: Khi bị đái tháo đường, khả sử dụng hấp thu đường chuột Do đó, bổ sung lượng đường lớn vào thể, khả làm hạ nồng độ đường máu Mức độ hạ đường huyết cho biết khả dung nạp thể glucose Ở chuột bình thường có mức dung nạp đường nhanh, chuột đái tháo đường có mức độ dung nạp chậm Tiến hành đánh giá kết – Chuột bị bỏ đói khoảng 12 trước tiến hành dung nạp đường 15 – Đo đường huyết chuột trước tiến hành dung nạp – Tiêm vô trùng dung dịch D-glucose với lượng 1,5 gram/kg thể trọng vào khoang bụng chuột – Đo đường huyết chuột vào thời điểm 30, 60, 120 180 phút – Đường huyết bình thường (lúc đói) vào khoảng 140 mg/dL Vào thời điểm 120 phút (sau dung nạp), mức đường huyết khoảng từ 140 – 200 mg/dL cho rối loạn dung nạp đường 200 mg/dL cho đái tháo đường (theo WHO) 5.9 Phương pháp đánh giá khả dung nạp insulin Nguyên tắc: Insulin loại hormone tế bào beta tuyến tụy tiết với tác dụng chuyển hóa carbonhydrate (đường) Khi bị đái tháo đường tuýp 1, tế bào beta đảo tụy bị phá hủy, khả sản xuất insulin khơng cịn, khả chuyển hóa đường tế bào, làm lượng đường máu cao Do đó, bổ sung lượng insulin giúp hạ thấp lượng đường huyết Kiểm tra mức độ dung nạp insulin cho biết thể có cảm ứng với insulin hay không Dung nạp insulin đánh giá thường quy để giúp phân biệt đái tháo đường tuýp với tuýp Tiến hành & đánh giá kết - Những chuột đánh giá đái tháo đường test dung nạp glucose tiếp tục dùng để đánh giá dung nạp Insulin - Pha insulin liều 0,75 mg/kg PBS - Kiểm tra nồng độ đường huyết vào thời điểm 30 phút trước tiêm - Tiêm dung dịch insulin chuẩn bị vào xoang bụng - Kiểm tra nồng độ đường huyết vào thời điểm 30, 60, 120 phút sau tiêm - Những chuột có khả hạ đường huyết gần mức bình thường (so với đối chứng), xem đái tháo đường tuýp 5.10 Phương pháp đánh giá mô học Nguyên tắc: STZ chất độc với với thể, có khả hủy hoại cấu trúc mô học tụy, gan thận quan khác có kênh Glut-2 Mức độ hư hại cấu trúc mô đánh giá tác động STZ lên tụy Tiến hành 16 – Giết chuột, thu nhận mẫu mô tụy chuyển vào dung dịch 4% paraformaldehyde qua đêm – Đúc mẫu paraffin, sau cắt thành tiêu có độ dày micromet nhuộm với Hematoxylin Eosin quan sát kính hiển vi quang học – Quan sát so sánh với mơ đối chứng (bình thường) Phương pháp hóa mơ miễn dịch huỳnh quang 5.11 Ngun tắc: Hóa mơ miễn dịch trình protein tế bào mô gắn với kháng thể tương ứng chúng theo nguyên tắc kháng nguyên kháng thể Các kháng thể gắn với chất thị phát quang để dễ dàng quan sát Tiến hành – Tiến hành cắt lát mô tụy giống phương pháp 5.10 – Nhuộm tiêu có với kháng thể Insulin quan sát kính hiển vi huỳnh quang để xác định vị trí cấu trúc đảo tụy 5.12 Phương pháp định lượng HbA1C Nguyên tắc: HbA1C hay A1C phức hợp Hemoglobin glucose máu Nếu lượng đường máu cao số lượng hồng cầu gắn đường nhiều Sự hình thành HbA1c diễn chậm tồn suốt đời sống hồng cầu 90-120 ngày Chính thế, HbA1c phản ánh nồng độ đường máu suốt khoảng thời gian 90-120 ngày Định lượng HbA1C có ý nghĩa quan trọng đường huyết tính ổn định thời gian tương đối dài Tiến hành : – Nồng độ HbA1C máu phân tích kĩ thuật Elisa – Máu chuột thu từ tĩnh mạch đuôi sau tuần tạo mơ hình 5.13 Phương pháp định lượng Insulin Ngun tắc: Insulin loại hormone từ đảo tụy mà cụ thể tế bào beta Khi đảo tụy bị phá hủy lượng insulin giảm Lượng Insulin máu giúp đánh giá mức độ hư hại đảo tụy Tiến hành : – Nồng độ Insulin máu phân tích hai kĩ thuật Elisa HPLC 17 – Máu chuột thu nhận từ tĩnh mạch đuôi sau tuần cho kỹ thuật Elisa thu nhận từ động mạch cảnh má (1-1,5ml) sau 12 tuần cho kỹ thuật HPLC Phương pháp nhuộm Dithizone để xác định đảo tụy 5.14 Nguyên tắc: Dithizione tác nhân có khả tạo phức hợp với kẽm (Zn) Do có khả liên với ion kẽm tế bào beta nhuộm có tính chọn lọc đảo tụy làm tế bào có màu đỏ đậm Do đó, chất nhuộm dùng để phân biệt tế bào đảo tụy tế bào khác Tiến hành - Thu nhận đảo tụy tách đảo tụy thành tế bào đơn enzyme Collagenase - Ly tâm rửa để thu tế bào đơn - Bổ sung 1ml DTZ ủ 360C 30 phút - Trải lên lame quan sát kính hiển vi quang học - Những tế bào đảo tụy bắt màu đỏ đậm, tế bào mô khác bắt màu với thuốc nhuộm Do đó, tế bào đảo tụy bị phá hủy, không quan sát tế bào có bắt màu với thuốc nhuộm thị trường Nội dung phạm vi vấn đề sâu nghiên cứu Nội dung 1: Khảo sát nồng độ STZ, vị trí tiêm, thời gian nhịn đói, nhịn khát thích hợp để chuẩn hóa quy trình tạo chuột đái tháo đường khảo sát mơ hình tiêu – Chỉ tiêu 1: Đường huyết khả dung nạp đường – Chỉ tiêu 2: Cân nặng sinh lý – Chỉ tiêu 3: khả dung nạp insulin định lượng insulin máu – Chỉ tiêu 4: Đánh giá cấu trúc mô học đảo tụy qua nhuộm Dithizone, H&E miễn dịch huỳnh quang Nội dung 2: Phân lập, ghép đánh giá tác động ADSC tự thân lên đường huyết mơ hình chuột đái tháo đường - Phân lập thành công tế bào gốc mô mỡ đạt tiêu chuẩn cấy ghép - Ghép đánh giá khả giảm đường huyết mơ hình chuột 18 Kết dự kiến - Tạo thành cơng mơ hình chuột đái tháo đường tuýp với tiêu đặt giống với biểu bệnh lý từ bệnh đái tháo đường - Đánh giá sơ khả giảm đường huyết ADSC ghép Nơi thực đề tài nghiên cứu luận văn - Đề tài thực phịng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế Bào Gốc, trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Tp Hồ Chí Minh Thời gian thực đề tài Đê tài thực tháng 10.Tài liệu tham khảo [1] Arora, S., S K Ojha and D Vohora (2009), Characterisation of Streptozotocin Induced Diabetes Mellitus in Swiss Albino Mice, Global Journal of Pharmacology 3(2): 81-84 [2] Deeds, M C., J M Anderson, A S Armstrong, D A Gastineau, H J Hiddinga, A Jahangir, N L Eberhardt and Y C Kudva (2011), Single dose streptozotocin-induced diabetes: considerations for study design in islet transplantation models, Lab Anim 45(3): 131-140 [3] Graham, M L., J L Janecek, J A Kittredge, B J Hering and H J Schuurman (2011), The streptozotocin-induced diabetic nude mouse model: differences between animals from different sources, Comp Med 61(4): 356360 [4] Ito, M., Y Kondo, A Nakatani and A Naruse (1999), New model of progressive non-insulin-dependent diabetes mellitus in mice induced by streptozotocin, Biol Pharm Bull 22(9): 988-989 [5] King, A J (2012), The use of animal models in diabetes research, Br J Pharmacol 166(3): 877-894 [6] Lenzen, S (2008), The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes, Diabetologia 51(2): 216-226 [7] McEvoy, R C., J Andersson, S Sandler, Hellerstr, xF and C m (1984), Multiple low-dose streptozotocin-induced diabetes in the mouse Evidence 19 for stimulation of a cytotoxic cellular immune response against an insulinproducing beta cell line, The Journal of Clinical Investigation 74(3): 715722 [8] Nakamura, T., T Terajima, T Ogata, K Ueno, N Hashimoto, K Ono and S Yano (2006), Establishment and pathophysiological characterization of type diabetic mouse model produced by streptozotocin and nicotinamide, Biol Pharm Bull 29(6): 1167-1174 [9] Rees, D A and J C Alcolado (2005), Animal models of diabetes mellitus, Diabet Med 22(4): 359-370 [10] Sakata, N., G Yoshimatsu, H Tsuchiya, S Egawa and M Unno (2012), Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation, Exp Diabetes Res 2012: 256707 [11] Van Belle, T L., P Taylor and M G von Herrath (2009), Mouse Models for Type Diabetes, Drug Discov Today Dis Models 6(2): 41-45 [12] Wang, Z and H Gleichmann (1998), GLUT2 in Pancreatic Islets: Crucial Target Molecule in Diabetes Induced With Multiple Low Doses of Streptozotocin in Mice, Diabetes 47(1): 50-56 20