Phần MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết đề tài Cellulose chất hữu tổng hợp nhiều giới nay, có khoảng từ 60 đến 90 tỷ hàng năm loài thực vật tạo Đây loại polymer sử dụng nhiều (gỗ xây dựng, bột giấy, sợi dệt vải,…) Ở cấp độ sinh quyển, hàng tỷ cellulose tạo năm cần phải phân hủy, không chúng tích tụ lại gây nguy hiểm cho hệ sinh thái Cùng với phát triển mạnh mẽ Công nghệ sinh học, chế phẩm enzyme sản xuất nhiều sử dụng hầu hết lĩnh vực như: nông nghiệp, chế biến thực phẩm, công nghiệp, chăn nuôi, y tế… Nước ta nước sản xuất nông nghiệp nên nguồn phụ phẩm nông nghiệp phong phú đa dạng Mỗi năm nguồn sinh khối trấu nước ta khoảng 100 triệu tấn, mùn cưa 250 triệu tấn, vỏ lạc 4,5 triệu tấn, vỏ hạt điều, bã mía, gỗ mụn khoảng 400 triệu Phần lớn vật liệu bị bỏ đốt, tận dụng Các phế thải có thành phần cellulose Cellulose bị thủy phân môi trường kiềm axit Tuy nhiên việc phân hủy cellulose phương pháp vật lý hóa học phức tạp, tốn gây độc hại cho môi trường Trong đó, việc xử lý chất thải hữu chứa cellulose công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm mặt kỹ thuật, kinh tế môi trường Số lượng loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có điều kiện tự nhiên phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn số trường hợp, nhà khoa học thấy nấm men tham gia trình phân giải Nấm Trichoderma spp diện gần tất loại đất số môi trường sống khác Chúng diện với mật độ cao phát triển mạnh vùng rễ cây, số giống có khả phát triển rễ, chúng có khả phát triển nhanh tiết lượng enzyme lớn với đầy đủ thành phần có hoạt tính mạnh Vì vây, việc nghiên cứu sửdụng nấm trichoderma phân giải phế thải nông nghiệ giàu cellulose nghiên cứu áp dụng rộng rãi Việt Nam giới Mỹ, năm 1983 trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulose Năm 1998, YU nuôi cấy Trichoderma reeesei Rut 30 MT chứa 5% bột cellulose 1% cám mì, thu hoạt lực CMCase 232,4 IU/g Ở Việt Nam nấm mốc trichoderma phân giải cellulose tập trung nhiều nghiên cứu Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu nấm sợi Trichoderma reesei sinh tổng hợp enzyme cellulose MT lỏng với nguồn cacbon CMC [2] Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzyme cellulase với nguồn cacbon cellulose tinh khiết, cám trấu, bã bía, võ cà phê [6] Tác giả Châu Hoàng Vũ nghiên cứu thu nhận tinh enzyme cellulase từ nấm mốc Trichoderma reesei phương pháp lên men bán rắn [27] Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Trichoderma reesei A niger MT lên men bán rắn [16] Tỉnh Thừa Thiên Huế có nguồn phế thải nông nghiệp dồi dào, đặc biệt nghề trồng nấm ăn phát triển sử dụng nhiều nguyên liệu rơm rạ, mùn cưa gòn Các phế thải sau trồng nấm bị thải bỏ không xử lý triệt để, có nguy gây ô nhiễm môi trường nông thôn Vì vậy, việc sử dụng vi sinh vật có khả phận giải cellulose mạnh nấm Trichoderma nhằm thúc đẩy trình phân giải phế thải sau trồng nấm làm phân bón hữu sinh học vừa góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường vừa tạo nguồn phân bón có ích cho trồng Từ nhu cầu thực tiễn tiến hành: “Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu hoạt lực chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose Thừa Thiên Huế” 1.2 Mục đích đề tài Phân lập, tuyển chọn số chủng nấm mốc có khả phân giải cellulose mạnh làm đối tượng cho nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố nuôi cấy đến hoạt tính enzyme cellulase Bước đầu tạo chế phẩm sinh học phân giải cellulose nhằm xử lý thử nghiệm phế thải nông nghiệp bèo tây rơm rạ sau trồng nấm 1.3 Ý nghĩa đề tài + Việc tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose mạnh thích nghi với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Thừa Thiên Huế góp phần đa dạng hóa ngân hàng giống vi khuẩn cellulose + Kết nghiên cứu sở quan trọng cho nghiên cứu tiếp tục để xây dựng quy trình tạo chế phẩm sinh học từ nấm mốc cellulose để xử lý phế thải nông nghiệp tạo nguồn phân hữu sinh học quan trọng cho trồng + Sử dụng nấm mốc phân giải cellulose xử lý phế thải nông nghiệp góp phần giảm thiểu vấn nạn ô nhiễm môi trường nông thôn địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế Phần TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan cellulase 2.1.1 Nguồn gốc Celulase tổng hợp từ nhiều nguồn khác tự nhiên như: Động vật, thực vật, vi sinh vật Do ưu điểm thời gian sinh trưởng, kích thước, hiệu suất sản sinh enzyme nên vi sinh vật thường sử dụng để sản xuất chế phẩm enzyme Các vi sinh vật thường sử dụng như: Bảng 2.1 Bảng thể nguồn vi sinh vật sinh enzyme cellulasse [20] Nhóm Chi Loài A niger Aspergillus A nidulans A oryzae (Tái tổ hợp) Fusarium Nấm Humicola Melanocarpus F solani F oxysporum H insolens H grisea M albomyces P brasilianum Penicillium P occitanis P decumbans T reesei Trichoderma T longibrachiatum T harzianum Vi khuẩn A cellulolyticus Acidothermus Bacillus sp Bacillus subtilis Clostridium C acetobutylicum C thremocellum Pseudomonas P cellulosa Rhodothermus R marinus C fimi Cellulomonas C.bioazotea C.uda Xạ khuẩn S drozdowiczii (Actinomycetes) Streptomyces S sp S lividans Thermononospora T fusca T curvata 2.1.2 Định nghĩa Cellulase phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác hoạt động phối hợp việc thủy phân cellulose thành glucose thông qua việc thủy phân liên kết β-1,4-glucosid [40] Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân chất theo chế định nhờ có phối hợp hoạt động enzyme mà phân tử chất thủy phân hoàn toàn tạo thành sản phẩm đơn giản [13], [39] 2.1.3 Phân loại Theo phân loại Hội sinh học phân tử sinh học quốc tế (IUBMBInternational Union Byochemistry anh Molecular) hệ thống thủy phân cellulose gồm có enzyme : Endoglucanase có kí hiệu EC3.2.1.4, Exoglucanase có kí hiệu EC3.2.1.91, β- glucosidase có kí hiệu EC3.2.1.21 [1] - Endoglucanase EC3.2.1.4 Enzyme thường thủy phân liên kết β-1,4-glucosid cellulose β-D-glucan ngũ cốc - Exoglucanse EC3.2.1.91 Enzyme có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucosid cellulose cellotetraose giải phóng cellobiose từ đầu không khử - β-glucosidase EC3.2.1.21 Enzyme thủy phân gốc β-D-glucosid Một số trường hợp thủy phân β-D-galactosidase, β-D-frucoside, β-D-xyloside, α-L-Arabinoside 2.1.4 Cơ chất cellulase Cellulose chất cellulase thành phần thực vật Hằng năm, lượng lớn sinh khối cellulose (1,5 x 1012tấn) tạo thành chủ yếu từ trình quang hợp [20], [29] Cellulose polysaccharide phong phú tự nhiên hợp chất tự nhiên bền vững Nó không tan nước mà phồng lên hấp thu nước, bị phân hủy đun nóng với acid kiềm nồng độ cao Celulose bị phân hủy nhiệt độ bình thường nhiệt độ 40-50 0C nhờ hệ enzyme thủy phân cellulose gọi cellulase [21] Cellulose cấu tạo từ gốc β-D-glucopyranose liên kết với liên kết 1,4-glucoside Có công thức cấu tạo (C 6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n n nằm khoảng 5000-14000, thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật Trọng lượng phân tử cellulose khoảng từ 50.000–25.000.000 Dalton Các phân tử cellulose liên kết với nhờ lực hút Van der Waals liên kết hydro Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng nm Các sợi sơ cấp kết hợp với thành vi sợi Trong điều kiện tự nhiên, vi sợi thường không đồng nhất, chúng thường tồn hai vùng kết tinh vô định hình [21] Hình 2.1 Cấu trúc không gian cellulose [29] (Màu nâu – cacbon, màu đỏ - oxy, màu trắng - hydro) Hình 2.2 Các mắt xích β-D-Glucose cellulose [6] 2.1.5 Cấu trúc cellulase Cellulase có chất protein cấu tạo từ axit amin, axit amin nối với liên kết peptid (-CO-NH-), cấu trúc có thành phần phụ khác Cấu trúc hoàn chỉnh loại enzyme nhóm endoglucanase exoglucanase giống hệ cellulase nấm sợi, gồm trung tâm xúc tác đuôi tận cùng, phần đuôi xuất phát từ trung tâm xúc tác gắn thêm vùng glycosyl hóa, cuối đuôi vùng gắn kết với cellulose (CBD : cellulose binding domain) Vùng có vai trò liên kết tạo cellulose tinh thể Trong trình thủy phân cellulose có tương quan mạnh khả xúc tác phân giải cellulose enzyme lực enzyme cellulose Hơn nữa, hoạt tính cellulase dựa vào tinh thể cellulose khả kết hợp CBD với cellulose Điều chứng tỏ CBD làm gia tăng hoạt tính cellulase tinh thể cellulose Sự có mặt CBD hỗ trợ cho cellulase thực việc cắt đứt nhiều liên kết cellulose Vùng gắn kết với cellulose có cấu tạo khác với liên kết thông thường protein việc thay đổi chiều dài vùng glycosil hóa có ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme [13], [29] Hình 2.3 Cấu trúc cellulase [29] 2.1.6 Cơ chế hoạt động cellulase Thủy phân cellulose có tham gia loại cellulase gồm endoglucanase, exoglucanase β-glucosidase Thiếu ba loại thủy phân phân tử celllulose đến Mỗi dạng enzyme phức cellulase tham gia thủy phân phân tử chất theo chế riêng Tuy nhiên enzyme thường phối hợp với để thủy phân hoàn toàn phân tử chất thành sản phẩm đơn giản glucose [13], [29] 2.1.6.1 Cơ chế 1,4-β-D-glucan cellobiohyrolase (EC 3.2.1.91) Enzyme thủy phân liên kết 1,4-β-glucosid từ đầu không khử chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose Hình 2.4.Cơ chế hoạt động exoglucanase [29] 2.1.6.2 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.14) Enzyme thủy phân ngẫu nhiên liên kết 1,4-β-D-glucosid mạch chuỗi cellulose, lichenin β-D-glucan ngũ cốc Sản phẩm phân cắt olygosacharide Hình 2.5 Cơ chế hoạt động endoglucanase [29] 2.1.6.3 β-D-glucosid glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Enzyme thủy phân gốc β-D-glucosid không khử tận để phóng thích β-D-glucose Hình 2.6 Cơ chế hoạt động β-Glucosidase [29] Hình 2.7 Quá trình phân giải cellulose cellulase [13] 2.1.7 Tính chất Thuộc tính cellulase thay đổi tùy theo nguồn gốc chúng Khối lượng phân tử cellulase thay đổi từ 30-110KDa [29] Cellulase protein có tính axit, độ bền nhiệt tính đặc hiệu chất khác Cellulase hoạt động từ dãy pH từ 3-7, pH tối ưu 4-5 nhiệt độ tối ưu 28-50 0C Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn 80 0C 10-15phút Cellulase bị ức chế sản phẩm glucose cellobiose tạo phản ứng thủy phân bị ức chế hoàn toàn Hg Ngoài ra, bị ức chế ion kim loại khác Mn 2+, Ag+, Zn2+ mức độ nhẹ Cellulase thủy phân cellulose tự nhiên dẫn xuất Carboxymethyl Cellulose (CMC) Hydroxyethyl Cellulose (HEC) Cellulase cắt liên kết β-1,4glucosid cellulose, lichenin β-D-glucan ngũ cốc [32] 2.1.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật 2.1.8.1 Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến phát triển, khả sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật tính chất enzyme tổng hợp Tùy chủng mà nhiệt độ thích hợp khác Sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme thường bị kìm hãm nhanh chóng nhiệt độ cao nhiệt độ thích hợp Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng tổng hợp cellulase nhiều loài nấm khác nằm khoảng 18-30 0C Phần lớn vi sinh vật sử dụng môi trường lên men bắn rắn ưa nhiệt, có nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 20-400C tối đa không 50 0C Các chủng xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt loài nấm sợi Cellulase xạ khuẩn thường chịu nhiệt tốt cellulase loài nấm sợi [18] 2.1.8.2 pH Sự sinh trưởng vi sinh vật làm thay đổi pH đáng kể chất Giá trị pH môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật không giống Có giá trị pH mà vi sinh vật phát triển bình thường, trình sinh tổng hợp enzyme lại không diễn Nhiều loại nấm phát triển sinh tổng hợp mạnh mẽ cellulase pH = 4,6; nhiên có loài Fusarium oxysporum tiếp tục phân giải cellulose môi trường có pH = 1,8-2,0 [18], [33] 2.1.8.2 Thời gian nuôi cấy Tốc độ phát triển vi sinh vật thường liên quan đến thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy chủng nấm mốc phụ thuộc vào chủng giống Thời gian phát triển sinh tổng hợp cellulase dài nấm sợi thông thường, nấm sợi phát triển từ 48-60 giờ sinh tổng hợp cellulase cao Trong xạ khuẩn phải 72 giờ tổng hợp cellulase nhiều [18], [32] 2.1.8.3 Môi trường nuôi cấy - Nguồn cacbon: Sự diện chất cảm ứng môi trường nuôi cấy giữ vai trò quan trọng để vi sinh vật tổng hợp enzyme mong muốn Để vi sinh vật tổng hợp cellulase người ta thường bổ sung nguồn cacbon từ cellulose tự nhiên hay dẫn xuất nó, chất coi tác nhân cảm ứng đặc hiệu vào môi trường nuôi cấy [38] 10 1NH1 Khoa Nông Học, Trường Đại Học Nông Lâm Huế Màu xanh cây, bề mặt đường rãnh phân cách thành thùy, rìa khuẩn lạc màu trắng 2NH1 Nt Màu xanh cây, Rìa khuần lạc màu trắng 3NH1 Nt Màu xanh đậm, bờ phát triển không 4NH1 Nt Màu xanh đậm, lan rộng 5NH1 Nt Màu xanh đậm, tròn 6NH1 Nt Màu xanh cây, lan rộng 7NH2 Nt Màu đen, rìa khuẩn lạc màu trắng 8NH2 Nt Màu đen, rìa khuẩn lạc màu trắng 9QN2 Quảng Nam Màu trắng, có vòng khuẩn ty màu đen 10 10QN2 Nt Màu đen, rìa khuẩn lạc màu trắng 11 11QN1 Nt Màu xanh cây, xung quanh sợi nấm màu trắng 12 XC2 Hương Sơ, Huế Nấm đen, rìa khuẩn lạc trắng 13 13XC2 Nt Xanh đậm, lan rộng 14 14XC2 Nt Màu xanh, rìa khuẩn lạc màu trắng 15 15XC2 Nt Màu đen, rìa khuẩn lạc trắng 16 16XC2 Nt Màu xanh cây, lan rộng 17 17XC1 Nt Màu xanh cây, rìa khuẩn lạc màu trắng 57 18 18XC3 Nt Xanh cây, bờ phát triển không 19 19XC2 Nt Màu xanh đậm, sợi nấm màu trắng 20 20XC2 Nt Màu xanh cây, bề mặt đường rãnh phân cách thành thùy 21 21T4 Quảng Nam Màu xanh cây, lan rộng, khuẩn lạc màu trắng 22 22T4 Nt Màu đen đậm, sợi nấm màu trắng 23 23Thazi Nt Màu xanh cây, rìa khuẩn lạc màu trắng 24 24CDLTTP Nt Màu trắng, sợi nấm mọc nhanh, lan rộng 25 25CDLTTP Nt Màu xanh cây, bề mặt đường rãnh phân cách thành thùy, rìa khuẩn lạc màu trắng 26 26CDLTTP Nt Nấm đen, rìa khuẩn lạc trắng 27 27Thazi Nt Màu xanh cây, rìa màu trắng, tia từ tâm 28 28T1 nt Màu xanh cây, rìa màu trắng, tia từ tâm 29 29T4 Nt Nấm đen, rìa khuẩn lạc trắng 30 30T4 Nt Màu xanh cây, rìa màu trắng, tia từ tâm 31 31T4 Nt Màu xanh cây, bề mặt đường rãnh phân cách thành thùy 32 32CDLTTP Nt Màu xanh cây, rìa màu trắng, tia từ tâm 58 33 33NH Khoa Nông Học, Trường Đại Học Nông Lâm Huế Màu xanh cây, tia từ tâm 34 34NH Nt Màu xanh cây, rìa màu trắng, tia từ tâm 35 35ĐN Đà Nẵng Màu xanh cây, tia từ tâm 36 36ĐN Nt Màu xanh cây, tia từ tâm 37 37ĐL Quảng Nam Màu xanh cây, tia từ tâm 38 38NH Khoa Nông Học, Trường Đại Học Nông Lâm Huế Màu xanh cây, lan rộng, bờ màu trắng 39 39NH Nt Màu xanh cây, lan rộng, bờ màu trắng 40 40NH Nt Màu xanh cây, rìa màu trắng, tia từ tâm 41 41PY Xã Phước Yên, Phong Điền, T.P Huế Màu trắng xanh, lan rộng, tròn 42 42PY Nt Màu trắng xanh, lan rộng, tròn 43 43PY Nt Màu trắng, lan 44 44TH Tứ Hạ, TP Huế Màu đen, lan rộng 45 45TH Nt Màu trắng, lan 46 46PY Xã Phước Yên, Phong Điền, T.P Huế Màu xanh cây, lan 47 47PY Nt Màu trắng, lan rộng 48 48TH Tứ Hạ, TP Huế Màu vàng nhạt 59 49 49PY Xã Phước Yên, Phong Điền, T.P Huế Màu đen, lan rộng 50 50PY Xã Phước Yên, Phong Điền, T.P Huế Màu trắng đen, lan rộng 51 51PY Xã Phước Yên, Phong Điền, T.P Huế Màu trắng, lan nhanh xung quanh 52 52PY Nt Màu trắng 53 53TH Tứ Hạ, TP Huế Màu trắng 54 54TH Nt Màu xanh đen 55 55PY Xã Phước Yên, Phong Điền, T.P Huế Màu xanh, lan rộng 56 56PY Nt Màu vàng xanh 57 57PY Nt Màu xanh 58 58PY Nt Màu xanh 59 59TH Tứ Hạ, TP Huế Màu trắng 60 60PY Xã Phước Yên, Phong Điền, T.P Huế Màu trắng, lan rộng, tròn 61 61PY Nt Màu xanh 62 62PY Nt Màu xanh, bào tử trắng 7.5 Kết dựng đường chuẩn glucose Bảng 7.8 Bảng kết đo OD540nm STT Nồng độ glucose (mg/ml) OD540 (nm) 0,2 0,151 0,4 0,47 60 0,6 0,806 0,8 1,078 1,322 Ta xây dựng phương trình: y = 1,475x – 0,119 Và độ xác phương trình: R2 = 0,995 7.6 Số liệu kết xử lý thống kê Anova phần mềm SPSS Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase chủng nấm mốc 6NH1 Descriptives ĐKVPG N Mean Std Std Error 95% Confidence Interval for Deviation Minimum Maximum Mean Lower Bound Upper Bound 16,667 ,5774 ,3333 15,232 18,101 16,0 17,0 19,000 1,0000 ,5774 16,516 21,484 18,0 20,0 21,000 1,0000 ,5774 18,516 23,484 20,0 22,0 20,333 ,5774 ,3333 18,899 21,768 20,0 21,0 16,000 2,6458 1,5275 9,428 22,572 13,0 18,0 10,333 3,7859 2,1858 ,929 19,738 6,0 13,0 18 17,222 4,0374 ,9516 15,214 19,230 6,0 22,0 Total ANOVA ĐKVPG Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 229,111 45,822 48,000 12 4,000 277,111 17 F Sig 11,456 ,000 ĐKVPG CT N Subset for alpha = 0.05 Tukey HSDa 16,000 16,667 10,333 61 19,000 20,333 21,000 Sig Waller-Duncana,b 1,000 ,082 10,333 16,000 16,667 16,667 19,000 19,000 19,000 20,333 20,333 21,000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 b Type 1/Type Error Seriousness Ratio = 100 Đường kính phân giải nguồn carbon khác công thức Descriptives ĐKVPG N Mean Std Std 95% Confidence Interval for Deviation Error Mean Lower Bound Minimum Maximum Upper Bound 18,833 1,8930 1,0929 14,131 23,536 17,5 21,0 17,167 1,0408 ,6009 14,581 19,752 16,0 18,0 3 23,967 ,4509 ,2603 22,847 25,087 23,5 24,4 16,833 ,2887 ,1667 16,116 17,550 16,5 17,0 18,833 ,7638 ,4410 16,936 20,731 18,0 19,5 21,167 2,7538 1,5899 14,326 28,007 18,5 24,0 18 19,467 2,8153 18,067 20,867 16,0 24,4 Total ,6636 ANOVA ĐKVPG Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 108,500 21,700 26,240 12 2,187 134,740 17 F 9,924 Sig ,001 ĐKVPG CT N Subset for alpha = 0.05 Tukey HSDa 16,833 17,167 17,167 18,833 18,833 18,833 18,833 62 3 21,167 23,967 Sig Waller-Duncana,b 21,167 ,581 ,054 16,833 17,167 18,833 18,833 18,833 18,833 3 ,258 21,167 21,167 23,967 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 b Type 1/Type Error Seriousness Ratio = 100 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase chủng nấm mốc 16XC2 Descriptives ĐKVPG N Mean Std Std Error 95% Confidence Interval for Mean Deviation Lower Bound Minimum Maximum Upper Bound 7,667 1,5275 ,8819 3,872 11,461 6,0 9,0 13,667 2,3094 1,3333 7,930 19,404 11,0 15,0 15,000 2,0000 1,1547 10,032 19,968 13,0 17,0 13,667 1,1547 ,6667 10,798 16,535 13,0 15,0 9,333 1,5275 ,8819 5,539 13,128 8,0 11,0 7,000 1,0000 ,5774 4,516 9,484 6,0 8,0 18 11,056 3,5392 ,8342 9,296 12,816 6,0 17,0 Total ANOVA ĐKVPG Sum of Squares Between Groups Within Groups Total df Mean Square 180,278 36,056 32,667 12 2,722 212,944 17 F 13,245 Sig ,000 ĐKVPG CT N Subset for alpha = 0.05 Tukey HSDa 7,000 7,667 9,333 9,333 63 13,667 13,667 13,667 13,667 15,000 Sig ,538 ,063 7,000 7,667 9,333 13,667 13,667 15,000 ,913 Waller-Duncana,b Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 b Type 1/Type Error Seriousness Ratio = 100 Hoạt độ enzyme cellulase chủng nấm mốc 6NH1 qua phương pháp định lượng đường khử DNS Descriptives ĐK N Mean Std Std Error Deviation 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum Upper Bound ,58734 ,021783 ,012576 ,53323 ,64146 ,567 ,610 ,24249 ,118132 ,068204 -,05097 ,53594 ,153 ,376 3 ,25017 ,127623 ,073683 -,06686 ,56720 ,105 ,345 ,10034 ,002955 ,001706 ,09300 ,10768 ,098 ,104 ,23774 ,042719 ,024664 ,13162 ,34386 ,190 ,272 ,18328 ,079358 ,045817 -,01386 ,38041 ,131 ,275 18 ,26689 ,170663 ,040226 ,18202 ,35176 ,098 ,610 Total ANOVA ĐK Sum of df Mean Squares F Sig Squar e Between Groups ,417 ,083 Within Groups ,078 12 ,006 12,894 ,000 64 Total ,495 17 ĐK CT N Subset for alpha = 0.05 Tukey HSD a ,10034 ,18328 ,23774 ,24249 3 ,25017 Sig Waller-Duncana,b ,58734 ,273 ,10034 ,18328 ,23774 ,24249 3 ,25017 1,000 ,58734 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000 b Type 1/Type Error Seriousness Ratio = 100 7.5 Hình ảnh số thiết bị, dụng cụ trình thực đề tài Hình 7.1 Máy lắc Hình 7.2 Lò vi sóng 65 Hình 7.3 Tủ cấy Hình 7.5 Nồi tiệt trùng Hình 7.4 Tủ sấy Hình 7.6 Cân định lượng 66 MỤC LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Phần .53 PHỤ LỤC 53 7.1 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất loại môi trường thí nghiệm 53 67 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng thể nguồn vi sinh vật sinh enzyme cellulasse [20] Error: Reference source not found Bảng 4.1: Số lượng nấm mốc phân giải cellulose mẫu đất Error: Reference source not found Bảng 4.2: Mức độ phân giải chủng nấm mốc phân lập Error: Reference source not found Bảng 4.3: Hoạt độ enzyme cellulase số chủng nấm mốc tuyển chọn Error: Reference source not found Bảng 4.4: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase chủng nấm mốc tuyển chọn .Error: Reference source not found Bảng 4.5 Ảnh hưởng nguồn carbon nuôi cấy đến khả phân giải cellulose chủng nấm mốc 6NH1 .Error: Reference source not found Bảng 4.6 Hoạt độ enzyme cellulase chủng 6NH1 qua phương pháp định lượng đường khử DNS .Error: Reference source not found Bảng 4.7 Theo dõi khối lượng lục bình sau xử lý phòng thí nghiệm Error: Reference source not found Bảng 4.8 Theo dõi khối lượng rơm rạ sau xử lý đồng ruộng Error: Reference source not found Bảng 4.9 Diễn biến mật độ vi khuẩn sau xử lý phế thải trồng nấm Error: Reference source not found 68 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc không gian cellulose [29] Error: Reference source not found Hình 2.2 Các mắt xích β-D-Glucose cellulose [6] Error: Reference source not found Hình 2.3 Cấu trúc cellulase [29] Error: Reference source not found Hình 2.4.Cơ chế hoạt động exoglucanase [29] Error: Reference source not found Hình 2.5 Cơ chế hoạt động endoglucanase [29] Error: Reference source not found Hình 2.6 Cơ chế hoạt động β-Glucosidase [29] Error: Reference source not found Hình 2.7 Quá trình phân giải cellulose cellulase [13] .Error: Reference source not found Hình 2.8 Khuẩn ty T harzianum (vùng màu trắng) phát triển môi trường PDA sau 2-3 ngày nuôi cấy tạo thành bào tử (vùng màu xanh) [50] Error: Reference source not found Hình 4.1 Một số hình ảnh nấm mốc phân lập Error: Reference source not found Hình 4.2 Hoạt lực phân giải nấm mốc môi trường dịch thể Error: Reference source not found Hình 4.3 Hoạt lực phân giải nấm mốc môi trường xốp Error: Reference source not found Hình 4.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính cellulase chủng nấm mốc 6NH1 16XC2 Error: Reference source not found Hình 4.5: Hoạt tính cellulase chủng nấm mốc 6NH1 16XC2 Error: Reference source not found Hình 4.6 Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả phân giải cellulose chủng nấm mốc 6NH1 .Error: Reference source not found Hình 4.7: Nguồn carbon ảnh hưởng tới đường kính phân giải chủng nấm mốc 6NH1 Error: Reference source not found 69 Hình 4.8 Đồ thị tương quan nồng độ glucose chuẩn giá trị OD540nm Error: Reference source not found Hình 4.9 Hoạt độ enzyme cellulase chủng 6NH1 qua phương pháp định lượng đường khử DNS .Error: Reference source not found Hình 4.10 Hình ảnh lục bình phân giải sau 30 ngàyError: Reference source not found Hình 4.11 Mẫu đối chứng rơm rạ sau 30 ngày Error: Reference source not found Hình 4.12 Nấm mốc 6NH1 sau 30 ngày Error: Reference source not found Hình 4.13 Nấm mốc 6NH1 vi khuẩn 9QN2 sau 30 ngàyError: Reference source not found 70 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ ANOVA : Analysis of Variance CFU : Colonie foriming unit CMC : Carboxyl metyl cellulose DNS : Acid Dinitro-salicylic CT : Công thức ĐC : Đối chứng NXB : Nhà Xuất Bản OD : Optical Density T reesei : Trichoderma reesei T harzianum : Trichoderma harzianum STT : Số thứ tự 71