Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ THANH HƯƠNG NGHI N C U A DẠNG DI TRU ỀN M T S O I THU C CHI TRUNG QUÂN (ANCISTROCLADUS) Ở VI T NAM UẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2016 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - PHẠM THỊ THANH HƯƠNG NGHI N C U A DẠNG DI TRU ỀN M T S O I THU C CHI TRUNG QU N ANCISTROCLADUS) Ở VI T NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60420121 UẬN VĂN THẠC S KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS ê Quỳnh iên PGS.TS N uy n Thị Hồn V n Hà Nội, 2016 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Liên (Viện Hóa sinh biển, Viện HLKHCNVN) PGS.TS Nguy n Th H ng Vân ( ộ m n i truy n học, Trường Đại học khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN) tận tình hướng dẫn em suốt thời gian thực đ tài Em xin chân thành gửi lời cảm ơn ThS Nguy n Chi Mai (Viện Hóa sinh biển, Viện HLKHCNVN) gi p đ em suốt qu trình em làm đ tài Em xin chân thành cảm ơn đến c TS Lê Th Thu Hi n (Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm khoa học c ng nghệ Việt Nam) gi p đ em qu trình thực đ tài Em xin trân trọng cảm ơn đến c n giảng viên ộ m n Sinh học-Học viện Y c học c truy n Việt Nam tạo u kiện gi p đ em suốt qu trình học tập, hoàn thiện luận văn Cảm ơn thầy c , anh ch Phòng c ng nghệ Y-Sinh (Trung tâm Ph t triển c ng nghệ cao, Viện HLKHCNVN) tận tình gi p đ tạo u kiện cho em hoàn thành đ tài Cuối c ng em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn b lu n ủng hộ gi p đ em qu trình em làm đ tài Hà Nội, th ng 05 năm 2016 Học viên Ph Thị Th nh H n Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN MỤC ỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC MỞ ẦU 1 Lí chọn đ tài Mục tiêu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI I U 1.1 Chi Trung quân Ancistrocladus 1.1.1 Phân loại học 1.1.2 Sơ lư c v chi Trung Quân 1.2 Đa dạng di truy n chi Trung Quân 1.3.Tình hình nghiên cứu chi Trung Quân Việt Nam .7 1.4 Đ nh gi đa dạng di truy n phương ph p sinh học phân tử 1.5 Các th NA đ nh gi đa dạng di truy n 1.5.1 Chỉ th đa hình trình tự đoạn DNA .8 1.5.2 Chỉ th đa hình trình tự DNA .11 1.5.3 T ng quan hệ gen: 12 1.5.4 T ng quan v th ITS MatK đ tài: 14 1.5.5 Phương ph p xây dựng ph t sinh chủng loại nghiên cứu: 17 CHƯƠNG 2: VẬT LI U V PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 Vật liệu nghiên cứu 18 2.2 Hóa chất, thiết b 19 2.3 Phương ph p nghiên cứu 19 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu nghiên cứu 19 2.3.2 Phương ph p t ch NA t ng số từ 19 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 2.3.3 Phương ph p nhân đoạn gen đích kỹ thuật PCR 20 2.3.4 Tinh sản ph m PCR…………………………………………… 23 2.3.5 Gắn sản ph m PCR vào vector t ch dòng pT257 R/T 23 2.3.6 iến nạp NA plasmid vào tế bào E coli H5α 24 2.3.6 T ch chiết NA plasmid 25 2.3.7 Phương ph p điện di kiểm tra kết 26 2.3.8 Phương ph p phân tích trình tự nucleotide phân tích phát sinh chủng loại 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết tách DNA t ng số 28 3.2 Kết nhân c c đoạn th phương ph p PCR 29 3.3 Kết gắn sản ph m PCR vào vector tách dòng pTZ57 R/T 30 3.4 Kết x c đ nh trình tự 34 3.5 Kết phân tích đa dạng di truy n Trung quân nghiên cứu 34 3.6 Thảo luận 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: 52 Kiến ngh : 52 TÀI LI U THAM KHẢO PHỤ LỤC Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ANH S CH C C CH VI T T T Amp Ampicillin bp base pair CTAB Cetyl Trimethyl Amoni Bromid dATP Deoxyadenosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate ETDA Ethylenediamine tetra acetic acid IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside ITS Internal Transcribed Spacer ISSR Inter Simple Sequence Repeat LB Luria and Bertani MatK Maturase K PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic acid rpm Revolutions per minute RNase RiboNuclease SDS Natri Dodecyl Sulfat TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Tm Melting temperatures (Nhiệt độ nóng chảy) Kb Kilobase Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN UV Ultraviolet VNTR Variable Number Tandem Repeat (Đoạn lặp lại kế tiếp) X- gal 5-bromo-4chloro-3indolyl-β-D-glactopyranoside Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DANH SÁCH CÁC H NH Tên hình Trang Hình 1.1 Cây Trung quân A conchinchinensis Gagnep Hình 1.2 Cây Trung quân A tectorius (Lour.)Merr Hình 1.3 Cây Trung quân A wallichii Planch Hình 1.4 Cây Trung quân A scanders Planch Hình 2.1 Cấu trúc vector tách dòng pTZ57 R/T 24 Hình 3.1 Ảnh điện di DNA t ng số mẫu Trung quân 28 Hình 3.2 Ảnh điện di sản ph m PCR mẫu Trung quân m i MatKF-MatKR 29 Hình 3.3 Ảnh điện di sản ph m PCR mẫu Trung quân m i ITS1-ITS4 30 Hình 3.4 Đĩa nu i cấy xuất khu n lạc xanh (không khoanh tròn) trắng (khoanh tròn) m i trường có kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG 31 Hình 3.5 Kết điện di sản ph m PCR m i M13F/R trình tự đoạn ITS đư c gắn vào vector tách dòng pTZ57 R/T 32 Hình 3.6 Kết điện di sản ph m PCR m i M13F/R trình tự đoạn MatK đư c gắn vào vector tách dòng pTZ57 R/T 33 Hình 3.7 Cây phát sinh chủng loại thiết lập dựa trình tự đoạn ITS 12 mẫu Trung quân nghiên cứu 40 mẫu Trung quân tham khảo ngân hàng GenBank 36 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại thiết lập dựa trình tự đoạn gen MatK 12 mẫu Trung quân nghiên cứu 32 mẫu Trung quân tham khảo ngân hàng GenBank 37 Hình 3.9 Trình tự đoạn ITS mẫu Trung quân 44 Hình 3.10 Trình tự đoạn gen MatK mẫu Trung quân 46 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN DANH MỤC BẢNG Tên Trang Bảng 2.1 Danh sách mẫu Trung quân 18 Bảng 2.2 Các m i đư c sử dụng phản ứng 21 Bảng 2.3 Thành phần cho phản ứng PCR với thể tích 25µl 21 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân đoạn gen MatK 22 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR nhân trình tự đoạn ITS 22 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng PCR sử dụng cặp m i M13F/R 22 Bảng 2.7 Thành phần cho phản ứng lai ghép 24 Bảng 3.1 Bảng thống kê trình tự ngân hàng Genbank có tỷ lệ tương đ ng lớn với trình tự phân tích 40 Bảng 3.2 Độ tương đ ng v trình tự nucleotide đoạn gen MatK mẫu Trung quân nghiên cứu 41 Bảng 3.3 Độ tương đ ng v trình tự nucleotide đoạn ITS mẫu Trung quân nghiên cứu 41 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN MỞ ẦU Lí chọn đề tài Việt Nam nước có hệ thực vật phong phú với ước đo n khoảng 12.000 loài, số loài đư c ghi nhận 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch (Viện c liệu, 2004) Sự đa dạng v số lư ng chủng loại c ng u kiện sinh trưởng ch ng làm giàu ngu n tài nguyên làm thuốc Việt Nam với khoảng 30% t ng số loài thực vật đư c sử dụng thuốc truy n thống Kết u tra ngu n tài nguyên dư c liệu Việt Nam giai đoạn 2001– 2005 Viện dư c liệu (2006) cho biết Việt Nam có 3.948 loài thực vật bậc cao, bậc thấp nấm đư c dùng làm thuốc; đó, nhóm thực vật bậc cao có mạch có 3.870 loài (Viện c liệu, 2006) Đây ngu n tài nguyên thiên nhiên to lớn người đặc biệt y học, đư c d ng để chăm sóc chữa bệnh cho người nước ta có truy n thống lâu đời d ng làm thuốc Tuy nhiên, trước tình hình khai thác tận thu mức, nhi u loại dư c liệu b thu hẹp khu vực phân bố đứng trước nguy biến tự nhiên Do vậy, nghiên cứu đa dạng sinh học dư c liệu cần thiết, nhằm tạo sở để đ nh giá ti m ch ng có phương án bảo t n, quản lý khai thác h p lý Từ trước đến nay, nghiên cứu đa dạng sinh học loài thực vật Việt Nam tập trung nghiên cứu v hình thái Tuy nhiên, số lư ng loài thực vật Việt Nam phong phú, nhi u loài có hình th i tương đối giống gây khó khăn cho phân loại thực vật o đó, đánh giá đa dạng v di truy n công cụ b sung hữu hiệu cho hướng nghiên cứu Chi Trung quân (Ancistrocladus) phân bố ph biến Châu Phi, Ấn Độ v ng Đ ng Nam , loại thực vật có chứa nhi u h p chất alkaloid gi tr v y học, h p chất dimeric naphthylisoquinon alkaloids hay gọi michellamnes có khả ức chế sinh trưởng virus gây suy giảm mi n d ch người HIV mức độ in vivo (McMahon et al., 1997) Ngoài ra, nhi u h p chất kh c t ch từ chi Trung quân có ti m kh ng khu n, chống oxy hóa ức chế sinh trưởng tế bào u tủy ( ringmann et al., 2012) Nhi u nghiên cứu cho thấy c c loài Trung quân 10 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ancistrocladus tectorius GQ443504.1 Ancistrocladus tectorius GQ443502.1 Ancistrocladus tectorius GQ443510.1 Ancistrocladus tectorius GQ443507.1 Ancistrocladus tectorius GQ443506.1 Ancistrocladus tectorius GQ443511.1 Ancistrocladus tectorius GQ443508.1 Ancistrocladus tectorius GQ443505.1 Ancistrocladus tectorius GQ443513.1 Ancistrocladus tectorius GQ443519.1 Ancistrocladus tectorius GQ443517.1 Ancistrocladus tectorius GQ443520.1 Ancistrocladus tectorius GQ443516.1 Ancistrocladus tectorius GQ443515.1 Ancistrocladus benomensis GQ443532.1 Ancistrocladus benomensis GQ443532.1 Ancistrocladus griffithii GQ443529.1 Ancistrocladus tectorius GQ443514.1 Ancistrocladus heyneanus GQ443534.1 Ancistrocladus griffithii GQ443530.1 Ancistrocladus tanzaniensis GQ443544.1 71 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ancistrocladus cochinchinensis HM204869.1 Ancistrocladus hamatus GQ443543.1 Ancistrocladus tectorius GQ443512.1 Ancistrocladus heyneanus GQ443533.1 Ancistrocladus griffithii GQ443528.1 Ancistrocladus tectorius GQ443531.1 Ancistrocladus tectorius GQ443522.1 Ancistrocladus tectorius GQ443521.1 Ancistrocladus tectorius GQ443527.1 Ancistrocladus robertsoniorum GQ443551.1 Ancistrocladus sp Bringmann GQ443550.1 Ancistrocladus congolensis GQ443537.1 Ancistrocladus heyneanus HM204874.1 Ancistrocladus pachyrrhachis GQ443546.1 Ancistrocladus tectorius GQ443524.1 Ancistrocladus congolensis GQ443535.1 Ancistrocladus tectorius GQ443526.1 Ancistrocladus abbreviatus GQ443545.1 Ancistrocladus tectorius GQ443525.1 Ancistrocladus tectorius GQ443523.1 72 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Ancistrocladus korupensis GQ443549.1 Ancistrocladus congolensis HM204870.1 Ancistrocladus tectorius GQ443518.1 Ancistrocladus korupensis HM204875.1 Ancistrocladus guineensis GQ443547.1 Ancistrocladus barteri GQ443548.1 Ancistrocladus hamatus HM204873.1 Ancistrocladus grandiflorus HM204871.1 Ancistrocladus barteri HM204867.1 Ancistrocladus guineensis HM204872.1 Ancistrocladus abbreviatus HM204866.1 Ancistrocladus robertsoniorum HM204876.1 Ancistrocladus benomensis HM204868.1 Ancistrocladus cochinchinensis GQ443541.1 Ancistrocladus attenuatus GQ443542.1 Ancistrocladus pinangianu GQ443540.1 73 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trình tự nuc e tide đ n ITS 74 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 75 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 76 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 77 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 78 Luận văn thạc sĩ Trình tự nuc e tide đ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN n gen MatK 79 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 80 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 81 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 82 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 83 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 84 Luận văn thạc sĩ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN 85