BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ MELOIDOGYNE SP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Ngô Thị Thu Hà NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP NẤM PURPUREOCILLIUM LILACINUM ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG BƯỚU RỄ MELOIDOGYNE SP Chuyên ngành: VI SINH VẬT HỌC Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN HỮU PHÚC Thành phố Hồ Chí Minh - 2015 Thành phố Hồ Chí Minh - 2015 LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến TS Nguyễn Hữu Phúc, Th.s Dương Đức Hiếu, LỜI CẢM ƠN người thầy tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ em trình làm luận MỤC LỤC văn Em xin cảm ơn thầy cô môn vi sinh giảng dạy, dẫn cho em suốt BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT trình học tập MỞ ĐẦU Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, anh chị làm việc tạiviện Sinh học Nhiệt Đới tạo điều kiện thuận lợi cho em thực đề tài Con xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người xin nuôi nấng, dạy dỗ động viên lúc gặp khó khăn Cuối em xin gửi lời cảm ơn đến bạn khoá vi sinh vật 22 em chia khó khăn trình học tập Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nhiệm vụ Đối tượng nghiên cứu Thời gian địa điểm nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài nghiên cứu 7 Ý nghĩa thực tiễn đề tài nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung nấm Purpureocillium lilacinum 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 1.1.3 Đặc điểm sinh học 1.1.4 Vai trò Purpureocillium lilacinum 10 1.1.5 Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum phòng trừ tuyến trùng Việt Nam giới .12 1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp 13 1.2.1 Đặc trưng sinh học 13 1.2.2 Các loài quan trọng .15 1.2.3 Cơ sở phòng trừ tuyến trùng 15 Các yếu tố ảnh hưởng lên khả sinh trưởng nấm sợi 22 1.3.1 Các phương pháp nuôi cấy nấm sợi .22 1.3.2 Môi trường nuôi cấy 24 1.3.3 Các hợp chất cung cấp nguồn cacbon 24 1.3.4 Các hợp chất cung cấp nguồn nitrogen 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 Vật liệu 25 2 Thiết bị dụng cụ 25 Hóa chất 25 2 Môi trường 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 2.4.1 Môi trường phân lập, giữ giống nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường potato glucose agar-PGA ) 26 PHỤ LỤC 64 2.4.2 Môi trường khảo sát ảnh hưởng pH, nguồn nitơ, nguồn cacbon, đến sinh khối số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum (môi Czapek-Dox Broth) 26 2.4.3 Môi trường quan sát vi thể nấm Purpureocillium lilacinum (môi trường YEA) 26 Các phương pháp nghiên cứu 26 2.5.1 Phương pháp phân lập 26 2.5.2 Phương pháp giữ giống thạch nghiêng 27 2.5.3 Phương pháp quan sát hình thái định danh nấm sợi 28 2.5.4 Phương pháp định danh nấm sợi sinh học phân tử 28 2.5.5 Phương pháp lọc tĩnh thu tuyến trùng 29 2.5.6 Phương pháp đếm tuyến trùng .29 2.5.7 Phương pháp định danh tuyến trùng hình thái 30 2.5.8 Phương pháp đánh giá khả kiểm soát tuyến trùng nấm Purpureocillium lilacinum điêù kiện in vitro 31 2.5.9 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên sinh khối số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum 32 2.5.10 Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov 33 2.5.11 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 33 2.5.11 Các phương pháp khác 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 34 3.1 Phân lập định danh chủng nấm có khả diệt tuyến trùng 34 3.1.1 Phân lập 34 3.1.2 Định danh 34 3.2 Kết định danh tuyến trùng 38 3.3 Kết khảo sát khả kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp diều kiện in vitro 40 3.3.1 Kết khảo sát khả kiểm soát tuyến trùng loài Meloidogyne sp điều kiện in vitro 40 3.3.2 Kết thử nghiệm in vitro nấm Purpureocillium lilacinum trứng tuyến trùng Meloidogyne sp chuối 42 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sinh khối số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum 45 3.4.1 Ảnh hưởng pH 45 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ nguồn Cacbon .49 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài C: cacbon Việt Nam nước có nông nghiệp lâu đời Hàng năm cung ứng N: nitơ nhiều mặt hàng nông sản cho nhu cầu thương mại nước xuất sang PGA: potato glucose agar nước Các mặt hàng nông sản xuất tiêu biểu như: gạo, cà phê, cao su hay mặt hàng nông sản trái với sản lượng lớn góp phần làm giàu cho kinh tế đất nước Tuy nhiên, sản lượng nông sản thu hoạch hàng năm không ổn định có thất thoát Nguyên nhân gây thực trạng ảnh hưởng khí hậu, thiên tai đặc biệt dịch bệnh Dịch bệnh trồng tác nhân sinh học gây như: virut, nấm, tuyến trùng số đối tượng vấn đề bệnh tuyến trùng gây chưa nghiên cứu nhiều dẫn đến việc phòng bệnh gặp nhiều khó khăn Tác hại tuyến trùng gây thực vật thường tương đối nhẹ, nhiên mật độ ký sinh lớn chúng gây hại nghiêm trọng, chí chúng gây chết thực vật Tuyến trùng ký sinh làm giảm 12,5 % sản lượng trồng thiệt hại tuyến trùng ký sinh trồng nông nghiệp ước tính hàng trăm tỷ USD năm Tuyến trùng thực vật sống ký sinh tất phần thực vật phát triển, hoa, lá, hạt, thân rễ, rễ nơi gặp nhiều nhóm tuyến trùng ký sinh Tiểu biểu nhóm tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne spp ký sinh rễ số cà phê, hồ tiêu, cà chua, cà rốt gây tổn thất đáng kể đặc biệt mặt hàng nông sản mạnh cà phê, hồ tiêu Để phòng trừ bệnh tuyến trùng rễ đối tượng trồng có biện pháp như: dùng tác nhân học, hoá học, sinh học Trong số biện pháp biện pháp phòng trừ tuyến trùng tác nhân sinh học dùng loại vi khuẩn Pasteuria penetrans, nấm (Nematoctonus concurrens N haptocladus, Purpureocillium lilacinum ) quan tâm Xuất phát từ thực tế tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu phân lập nấm Purpureocillium lilacinum để phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.” Mục tiêu đề tài - Góp phần nghiên cứu khả phòng trừ tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp.bởi tác nhân sinh học nấm Purpureocillium lilacinum Nhiệm vụ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU - Phân lập nấm Purpureocillium lilacinum từ côn trùng bị bệnh - Phân loại đến loài chủng nấm Purpureocillium lilacinum - Phân loại đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp - Thử nghiệm in vitro khả kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp nấm Purpureocillium lilacinum - Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến phát triển sinh khối hình thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Đối tượng nghiên cứu 1.1 Giới thiệu chung nấm Purpureocillium lilacinum 1.1.1 Vị trí phân loại − Giới (Kingdom) : Nấm − Ngành (Division): Ascomycota − Lớp (Class): Sordariomycetes − Bộ (Order): Hypocreales − Họ (Family): Ophiocordycipitaceae - Chủng nấm Purpureocillium lilacinum phân lập từ côn trùng bị bệnh - Tuyến trùng Meloidogyne sp phân lập từ đất rễ chuối bị bệnh tuyến trùng − Chi (Genus) : Purpureocillium (theo Luangsa-ard, Hywel-Jones, Houbraken & Samson (2011)) − Loài: Purpureocillium lilacinum (Thom) Luangsa-ard, Hou- braken, Hywel-Jones & Thời gian địa điểm nghiên cứu Địa điểm: Công ty TNHH Gia Tường, chi nhánh số đại lộ Độc Lập, khu công nghiệp Sóng Thần 1, huyện Dĩ An , tỉnh Bình Dương Viện sinh học nhiệt đới, Số 9/621 Xa Lộ Hà Nội, KP 6, P Linh Trung, Quận Thủ Đức, Samson (2011) Tên đồng nghĩa: Paecillium Luangsa-ard, Hywel-Jones & Samson (2007); Penicillium lilacinum Thom (1910); Penicillium amethystinum Wehmer (1923) TP.HCM Thời gian thực hiện: từ tháng 10/2012 đến tháng 9/2013 Ý nghĩa khoa học đề tài nghiên cứu Spicaria rubidopurpurea Aoki (1941) Purpureocillium lilacinum (Thom) Samson (1974) Purpureocillium chi nấm họ Ophiocordycipitaceae Chi đơn loài có Góp phần tìm hiểu đặc điểm sinh học,điều kiện nuôi cấy khả diệt tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp Purpureocillium lilacinum chứa loài Purpureocillium lilacinum, loài nấm sợi hoại sinh phổ biến Nó đựơc phân lập từ loạt môi trưòng sống bao gồm đất trồng đất bỏ hoang, rừng, đồng cỏ, sa mạc, trầm tích cửa sông, bùn cặn nứơc thải côn trùng Nó đựơc tìm Ý nghĩa thực tiễn đề tài nghiên cứu Trên sở kết thu trình khảo sát khả phòng trừ tuyến trùng bướu rễ chủng vi sinh Purpureocillium lilacinum từ ứng dụng vào sản xuất chế phẩm đặc trị tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp cho trồng thấy trứng giun tròn, tuyến trùng nang Ngoài đựơc phát thường xuyên vùng rễ nhiều loại trồng Chúng phát triển phạm vi nhiệt độ rộng từ 8-38 oC, nhiệt độ sinh trưỏng tối ưu khoảng 26-30 oC Nó có khả chịu đựng pH rộng 2-10 phát triển nhiều loại bề mặt khác Purpureocillium lilacinum đựơc cho có tiềm sử dụng để kiểm soát phát triển tuyến trùng rễ [16],[19] 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu Hình 1.1: Khuẩn lạc nấm Purpureocillium lilacinum (hình bên trái), cấu tạo vi thể nấm Các loài đựơc mô tả nhà nấm học người Mỹ Charles Thom vào năm 1910 với tên gọi Penicillium lilacinum Purpureocillium lilacinum (hình bên phải) [36] 1.1.4 Vai trò Purpureocillium lilacinum a Tác nhân kiểm soát tuyến trùng Vào năm 1974 Charles Thom chuyển loài thành Paecilomyces Những ấn phẩm thập niên 20 chi Paecilomyces đơn ngành mà có quan hệ mật thiết với Paecilomyces nostocoides, Isaria takamizusanensis and Nomuraea atypicola Purpureocillium lilacinum loài nấm phổ biến với phạm vi phân bố rộng toàn giới (Samson, 1974) thử nghiệm rộng rãi cho kiểm soát bệnh sần rễ u nang tuyến trùng Chi Purpureocillium tạo để tổ chức đơn vị phân loại Tên gọi chung đề cập đến bào tử tím tạo nấm Purpureocillium lilacinum sử dụng chủ yếu điều kiện nhiệt đới, ví dụ như, Philippines (Jatala, 1986) Cộng hòa Nam Phi (Neethling, 2002) Loài có hiệu chống lại loài tuyến trùng khác gây bệnh thực vật, chủ yếu lây nhiễm trứng 1.1.3 Đặc điểm sinh học tuyến trùng (Amancho Sasser năm 1995; Borisov năm 1998; Pandey Trivedi, Purpureocillium lilacinum tạo thành sợi nấm dầy đặc làm phát sinh cành bào tử phân sinh Phần cuối thể bình mang bào tử xếp thành chuỗi Bào tử nảy mầm 1990; Silva cộng sự, 1992; Sosnowska năm 2001; Zaki, 1994) Wang cộng (2001) Quan sát số nhiễm trùng giai đoạn ấu trùng Đông Trung Quốc có có độ ẩm chất dinh dưỡng thích hợp khác biệt lớn khả gây bệnh chủng Purpureocillium lilacinum Khuẩn lạc môi trường thạch Malt phát triển nhanh, đạt đuờng kính 5-7cm vòng 14 ngày 15oC, bao gồm sợi nấm khí sinh ban đầu có màu trắng (Rodriguez- Kabana et al., 1984) Ở Ba Lan, dòng nội địa loại nấm loài nghiên cứu tác nhân sinh học tiềm chống lại hình thành bào tử có thay đổi sắc thái thành màu đỏ rượu vang Sợi dinh dưỡng có thành bao trơn, suốt, kích thứơc 2.5-4 mm Cuống sinh bào tử phát sinh từ sợi ký sinh phát sinh từ sợi nấm khí sinh Cuống sinh bào tử dài khoảng 400-600 μm tuyến trùng sần rễ nhà kính (Sosnowska, 2003) Hiện nay, Purpureocillium lilacinum loài nấm có mục đích thương mại để kiểm soát tuyến trùng, sâu bệnh châu Âu, chủng nấm 251 thương mại đăng ký để bán số nước (Atkins et al., 2005) Bởi phân loại microbiopesticide [23] Thể bình gồm phần đuôi phình to, thon dần phần đầu giống cổ Bào tử chuỗi có nhiều hình dạng từ elip đến hình thoi Bào tử có thành trơn đến nhám Cơ chế công trứng tuyến trùng: Trứơc xâm nhiễm vào trứng tuyến trùng, Purpureocillium lilacinum áp sát vào Không có bào tử chống chịu [19] bề mặt trứng trở nên sát gần với trứng Purpureocillium lilacinum sản xuất tế bào chuyên biệt điển hình để lây nhiễm khắp nơi bề mặt trứng tuyến trùng Những tế bào chuyên biệt tương tự mấu lồi phần cuối sợi nấm giúp áp sát vỏ trứng Sau sợi nấm xâm nhập vào vỏ trứng chúng nhanh chóng phá huỷ ấu trùng bên sau sợi nấm tạo thành cuống sinh bào tử phía xâm nhiễm trứng liền kề [19] 10 1.1.5 Tình hình ứng dụng nấm Purpureocillium lilacinum phòng trừ tuyến trùng Việt Nam giới a Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum giới Một số chế phẩm diệt tuyến trùng sản xuất từ nấm Purpureocillium lilacinum thị trường giới Hình 1.2: Cơ chế công trứng tuyến trùng Meloidogyne spp nấm Purpureocillium lilacinum [42] Hình 1.3: Trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica bị nhấn chìm sợi nấm Purpureocillium lilacinum Hình 1.4: Một số chế phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum thị trường giới [40] b Sản xuất số enzym Nhiều enzym đựơc sản xuất Purpureocillium lilacinum đựơc nghiên cứu như: serine protease loại enzym chống lại trứng tuyến trùng Meloidogyne hapurpureocillium lilacinuma: protease chitinase làm suy yếu vỏ trứng tuyến trùng [16],[19] b Các sản phẩm diệt tuyến trùng từ nấm Purpureocillium lilacinum Việt Nam + Tuyến trùng: Sử dụng nấm đối kháng Paecilomyces (Palila 500 WP) liều lượng theo khuyến cáo, hoạt chất Cytokinin (Sincosin + Agrispon) 0,2%; Etobon 0,56 SL, tưới gốc c Kháng khuẩn nồng độ: 0,125 ml/lít nước; 3.000-5.000 lít nước/ha, Vimoca 10G rải quanh gốc (30g/gốc Purpureocillium lilacinum nuôi cấy lên men chìm người ta chiết tách tưới đẫm nước) hoạt chất sinh học có tên gọi leucinostatins Leucinostatins peptide trung tính với cấu trúc gồm: α-aminoisobutyric acid, L-leucine, β-alanine theo sau acid amin bất thường (L-threo- β-hydroxy leucine, 2-amino-2-hydroxy-4-methyl-8 oxodecanoicacid cis-4-methyl-L-proline (theo Mori et al 1982).Leucinostatins có loại môt tả A, B, C, D, E, F Leucinostatins có khả kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương PALILA : ( Purpureocillium lilacinum 500 triệu bào tử/g) Sản phẩm đặc trị tuyến trùng, ngăn ngừa bênh chết nhanh chết chậm tiêu nhiều loại trồng khác, làm khoẻ lại rễ hút dinh dưỡng tốt nhiều loại nấm (theo Fukushima et al 1983 a,b) Tuy nhiên chế kiểm soát tuyến Đặc biệt thử nghiệm hiệu cao su, cà phê, hồ tiêu, khảo nghiệm chất lượng trùng tham gia loại độc tố [9] đuợc khẳng đinh Đơn Dương- Đức Trọng, Chư sê, Daksong… 11 12 Trên trồng: cải bắp ( sú) , hồ tiêu, cà phê… [40] nan điểm xâm nhập cho IJ2 khác làm cho bề mặt rễ bị tổn thương Khi IJ2 tiếp xúc với bề mặt rễ chúng thường dùng kim hút châm chích xâm nhập vào rễ Sự 1.2 Tuyến trùng sần rễ Meloidogyne spp xâm nhập chúng xảy phía rễ Sau xâm nhập vào rễ Tuyến trùng sần rễ (root-knot nematodes) coi nhóm tuyến trùng ký sinh quan trọng Nhóm tuyến trùng phân bố rộng khắp giới ký sinh hầu hết trồng quan trọng vùng khí hậu khác Chúng gây nên giảm sản lượng thu hoạch chất lượng sản phẩm trồng Hiện thống kê khoảng gần 80 loài ký sinh thuộc chi này, có loài ký sinh gây hại quan trọng là: M incognita, M arenaria, M javanica M hapurpureocillium lilacinuma Đây loài phân bố rộng gây hại lớn vùng nông nghiệp giới Ngoài số loài khác gây hại quan trọng chúng gây hại 1-2 trồng phân bố hẹp [18] 1.2.1 Đặc trưng sinh học tuyến trùng di chuyển tế bào vỏ rễ làm cho tế bào bị tách dọc ra, sau tuyến trùng định vị vùng mô phân sinh vỏ rễ bắt đầu trình dinh dưỡng Khi dinh dưỡng tuyến trùng cắm phần đầu vào tế bào mô mạch rễ, tiết men tiêu hóa làm cho trình sinh lý sinh hóa mô rễ thay đổi hình thành điểm dinh dưỡng cho tuyến trùng Vùng gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) tạo thành vùng nhu mô vùng mô phloem, nơi đầu tuyến trùng Đây thích nghi chuyên hóa cao tế bào, chúng tạo trì tuyến trùng ký sinh Cùng với hình thành tế bào khổng lồ mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng ký sinh phình to tạo thành sần rễ (gall root-knot) Sần rễ thường tạo thành vòng 1-2 ngày sau tuyến trùng xâm nhập Kích thước nốt sần liên quan đến chủ, số lượng IJ2 xâm nhập Trứng tuyến trùng sần rễ đẻ bọc gelatine (còn loài tuyến trùng ký sinh [5] gọi bọc trứng) nằm bề mặt sần rễ Đôi bọc trứng nằm bên nốt sần Sau trình phát triển phôi thai, trứng phát triển thành ấu trùng tuổi bên trứng Lần lột xác thứ xảy trứng phát triển thành ấu trùng tuổi Trứng nở ấu trùng tuổi dạng cảm nhiễm (infective juvenile = IJ2) không cần có kích thích rễ thực vật Hình 6: Chu kỳ sống tuyến trùng bướu rễ Meloidogyne sp http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Carrots/Root-Knot/Root-KnotCycle.jpg Bản thân tuyến trùng cảm nhiễm, sau xâm nhập vào rễ bắt đầu cách nhanh chóng trình thay đổi hình thái: thể chúng phình nội quan dần phát triển Quá trình phát triển tuyến trùng rễ từ IJ2 trải qua lần lột xác Hình 1.5: Tuyến trùng Meloidogyne sp khối trứng đạt đến trưởng thành Lần lột xác cuối biến thái thật đực, từ dạng http://www.tstcantho.com.vn/?mod=article&id=193§ion_id=3 cuộn gấp khúc IJ4 chúng nở có dạng hình giun, có Chuẩn bị xâm nhập vào rễ IJ2 tập trung dọc theo tế bào non phía sau dạng hình tròn lê hay chanh Tuyến trùng Meloidogyne spp sinh sản vùng đỉnh rễ IJ2 thường công vào mô phân sinh đỉnh rễ, nơi rễ bên mọc tạo cách: vài loài sinh sản hữu tính-giao phối bắt buộc (amphimixis) phần lớn loài 13 14 sinh sản lưỡng tính (parthenogenessis) không cần đực Đối với loài hữu tính đực cặp đôi với sau lần lột xác cuối Tuyến trùng sần rễ có quan hệ mật thiết với điều kiện môi trường chủ, nhiệt độ yếu tố sinh thái đất độ ẩm, cấu trúc đất, độ thoáng khí, độ kiềm Có thể phân biệt nhóm sinh thái liên quan đến nhiệt độ nhóm ưa nóng (các loài điển M incognita, M javanica, M exigua) nhóm ưa lạnh (các loài điển M hapla, M chitwooodi M naasi) liên quan đến pha chuyển hóa lipid tuyến trùng xảy 10 °C Tác hại tuyến trùng gây trồng thường có liên quan đến loại đất kiềm, môi trường tạo sốc bất lợi (stress) cho thực vật Nội dung phòng trừ tuyến trùng bao gồm: i) Giết tuyến trùng làm nguồn dinh dưỡng để tuyến trùng chết đói; ii) Giết trực tiếp tuyến trùng hóa chất kỹ thuật khác áp dụng trước gieo trồng; iii) Sử dụng hóa chất cách hợp lý để chống lại tuyến trùng đồng ruộng có trồng [18] a Ngăn ngừa Ngăn ngừa phòng ngừa giải pháp quan trọng quản lý tuyến trùng, biện pháp đơn giản để giải tuyến trùng trước chúng trở thành vật hại xác định đồng ruộng Ngăn ngừa phát tán tuyến trùng cần xem xét mức độ khác 1.2.2 Các loài quan trọng nhau: trang trại (như đơn vị sản xuất), quốc gia quốc tế Ở quy mô quốc tế, vấn M incognita: loài phổ biến nhất, ký sinh gây hại nhiều trồng khác phân đề kiểm dịch thực vật quan trọng quản lý công ước kiểm dịch thực vật [18] bố vùng địa lý rộng từ 40 vĩ độ bắc đến 33 vĩ độ nam phạm vi toàn giới Đây loài ký sinh gây hại phổ biến trồng Việt Nam, chúng ký b Luân canh sinh gây hại phổ biến ở: tiêu, cà phê, cà chua, bí đỏ, đu đủ, họ Cà, họ Đậu, Luân canh coi biện pháp quản lý tuyến trùng đơn giản Tuyến trùng thực vật chuối ký sinh bắt buộc, chúng cần vật chủ cho phát triển nhân nuôi số lượng M javanica: loài phổ biến thứ sau loài có dải phân bố tương tự Đây loài có khả chịu đựng qua mùa khô hạn thời gian 3-6 tháng Ở Việt Nam, loài ký sinh tương đối phổ biến sau loài M incognita, gây hại cho đậu phộng, chuối Mỗi loài tuyến trùng thực vật có phổ vật chủ, phổ dù rộng không bao gồm tất loài trồng Mật độ tuyến trùng tăng chủ thích hợp suy giảm chủ không thích hợp Trong luân canh trồng để quản lý trồng mẫn cảm với loài tuyến trùng trồng luân canh với kháng miễn M arenaria: loài phổ biến thứ sau, phân bố khắp giới loài M incognita nhiễm tuyến trùng Thường trồng kinh tế mẫn cảm với tuyến trùng M javanica Đây loài ký sinh gây hại tương đối phổ biến Việt Nam cây trồng luân canh kinh tế Sự luân canh cần phải trồng để họ đậu mật độ quần thể tuyến trùng mức thấp trồng trồng Các luân canh M graminicola: ký sinh gây hại cho lúa cạn vùng nhiệt đới cận nhiệt đới (Đông Nam Á, Nam Phi, Mỹ) Ở ta loài ký sinh tương đối phổ biến lúa cạn (giai đoạn lúa non, chưa ngập nước) đồng sông Cửu Long [18] miễn nhiễm có khả chống chịu cao với một vài loại tuyến trùng Khả miễn nhiễm chúng miễn nhiễm tự nhiên [18] c Biện pháp canh tác Tùy loại tuyến trùng ký sinh loại trồng mà lựa chọn, điều chỉnh 1.2.3 Cơ sở phòng trừ tuyến trùng Mục tiêu phòng trừ là: giảm mật độ quần thể tuyến trùng ban đầu giảm số số biện pháp canh tác như: gieo trồng sớm, làm khô ruộng, làm ngập nước, bón chất hữu giảm mật độ tuyến trùng tránh số tác hại gây tuyến trùng trồng bị nhiễm tuyến trùng 15 16 Làm ngập nước: nồng độ O2 giảm, CO2 tăng giảm vi khuẩn hiếu khí, đồng thời đất ngập nước xảy phản ứng như: phản ứng nitrat, tích luỹ chất amoni, nhiệt vi sóng, đốt đồng sau thu hoạch, khử trùng nguyên liệu gieo trồng nhiệt, chiếu xạ [18] giảm sắt, mangan sunfat, tăng loại acid hữu cơ, methane hydrosulfite e Chọn giống kháng giống chống chịu bệnh Bón phân hữu cơ: phân huỷ chất hữu giải phóng hợp chất gây độc cho tuyến trùng ký sinh Đặc biệt, phân giải chất phế thải thực vật giải phóng acid hữu như: acid acetic, propionic, butyric Nồng độ chất lưu giữ vài tuần đất giết chết vài loại tuyến trùng ký sinh, không độc đến nhóm tuyến trùng sống tự đất Phân từ động vật nuôi, bùn cống rãnh, chất thải thành phố, rơm rạ phế thải sau thu hoạch sử dụng làm chất bổ sung - Trồng chống chịu tuyến trùng ký sinh đáp ứng cho phương pháp lý tưởng trì mật độ quần thể tuyến trùng ngưỡng gây hại Các trồng kháng tuyến trùng có số ưu điểm vượt trội phương pháp khác cho mục tiêu quản lý tuyến trùng hại: (a) hoàn toàn ngăn ngừa sinh sản tuyến trùng, không giống vài phương pháp khác phòng trừ hóa học; (b) áp dụng chúng cần không cần công nghệ hiệu kinh tế; (c) cho phép luân canh thời gian ngắn; (d) không vào đất để tăng hàm lượng chất hữu để lại dư lượng độc Ở Nigieria, bón vỏ khô ca cao vỏ gọt sắn cho phòng trừ tuyến trùng gây - Ngoài tính kháng (resistance) với tuyến trùng ký sinh, kháng cần phải chống bướu rễ mang lại hiệu kinh tế cao so với sử dụng thuốc hoá học bón loại chịu (tolerance); không chống chịu phải chịu thiệt hại nặng nề trồng phân hoá học NPK liều lượng cao Ở xí nghiệp Liên hiệp hồ tiêu Tân Lâm Quảng Trị, bón đất nhiễm tuyến trùng nặng Các chống chịu mà không kháng có xu hướng tăng mật độ 20 kg phân chuồng ủ hoai mục/ gốc tiêu làm giảm 45-60% tuyến trùng bướu rễ quần thể tuyến trùng đến số lượng tuyến trùng cao dẫn đến gây hại [18] Meloidogyne incognita so với đối chứng [5] f Biện pháp hóa học Một số trồng hoang dại dùng làm thuốc thảo mộc phòng trừ tuyến trùng xoan Ấn Độ, hạt củ đậu, rễ ruốc cá, hạt sầu đâu rừng Việt Nam chúng chứa hợp chất phenolic, glucid alkaloid… có tác dụng gây độc tuyến trùng số sâu hại khác.Ở Tân Lâm Quảng Trị với liều dùng 40-60g HBJ LBJ ( chế phẩm dạng bột chế biến từ sầu đâu rừng)/m2 diệt 75-98% tuyến trùng ký sinh (Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh, 1993; Nguyễn Thị Yến , 1997) [5] Từ năm 1950 trở lại loại thuốc hóa học khác sử dụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật Tuy nhiên, mặt có lợi chối cãi việc phòng trừ sâu bệnh hại tăng sản lượng trồng, việc sử dụng không hợp lý chất hóa học gây hậu xấu môi trường sức khỏe cộng đồng Đặc biệt, thuốc hóa học làm cho nhiều loại tuyến trùng trở nên kháng thuốc Mặc dù sản xuất nhiều loại thuốc có hiệu tốt hơn, chuyên hóa việc phòng trừ tuyến trùng độc hại môi trường Tuy nhiên nên dùng thuốc hóa học trường hợp cần thiết khuyến cáo d Các biện pháp vật lý Lợi ích lớn biện pháp vật lý phòng trừ tuyến trùng không để lại dư lượng, độc tố thuốc hóa học Bản chất biện pháp vật lý phòng trừ tuyến trùng xử lý nhiệt Tuyến trùng nhìn chung mẫn cảm với nhiệt Hầu hết tuyến trùng chết nhiệt độ cao 60 °C Phương pháp vật lý áp dụng rộng rãi nhiều biện pháp khác như: xử lý khói, dùng nước nóng xử lý đất, phơi nắng, khử trùng nhiệt điện, 17 đặc biệt phải sử dụng chúng cách hợp lý [18] g Biện pháp sinh học Tuyến trùng ký sinh thực vật bị công nhiều thiên địch tồn đất virus, vi khuẩn, nấm, Ricketuyến trùngsia, đơn bào, Tardigrade, Tuberlaria, Enchytraeid, ve bét, côn trùng tuyến trùng ăn thịt Vì vậy, nghiên cứu sử dụng thiên địch 18 Kết trình bày bảng 3.2 hình 3.13 cho thấy nấm Purpureocillium lilacinum có khả kiểm soát nở trứng tuyến trùng 70% cao so với lô đối chứng Tuy nhiên tỉ lệ trứng bị ký sinh nấm Purpureocillium lilacinum thấp 25% so với chủng nấm Purpureocillium lilacinum A (78.5%), Purpureocillium lilacinum B (66%), Purpureocillium lilacinum M (73.4%) báo tác giả Chen Guan Pau Tỉ lệ ký sinh chủng nấm Purpureocillium lilacinum thấp chủng có hoạt tính thấp, thời gian sinh trưởng chậm Tỉ lệ trứng không nở lô đối chứng cao 53% nguyên nhân điều nhiệt độ thí nghiệm không thích hợp thí nghiệm tiến hành điều kiện nhiệt độ phòng có lên đến 30-32º C không thuận lợi cho nở trứng tuyến trùng (27-28 ºC) 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng điều kiện môi trường đến sinh khối số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum 3.4.1 Ảnh hưởng pH Hình 3.15: Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Bảng 3.3: Ảnh hưởng pH lên sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Sinh khối nấm Sinh khối nấm Sinh khối nấm Sinh khối nấm Bình Purpureocillium Purpureocillium Purpureocillium Purpureocillium lilacinum pH lilacinum pH lilacinum pH lilacinum pH (g) Nấm Purpureocillium lilacinum tiến hành nuôi cấy tĩnh môi trường lỏng Czapek-Dox Broth bình tam giác 250ml (100ml môi trường/bình) với giá trị pH môi trường là: 6, 6.5, 7, 7.5, đặt điều kiện tối, nhiệt độ phòng Sau thời gian 14 ngày nuôi cấy tiến hành thu sinh khối bào tử nấm Purpureocillium lilacinum pH7 pH 6.5 pH6 pH7.5 0.9622 1.1441 1.1130 1.2776 0.8679 1.2953 0.7486 0.8679 0.8023 Số Trung mẫu bình 0.836711 0.993356 1.00877 1.04954 6.5 (g) 1.0789 0.9070 1.2245 0.6969 0.9338 0.8353 0.7545 0.5573 0.5422 Sự khác biệt 0.204854 0.31488 0.227628 0.37276 X X X X Hình 3.14: Khảo sát ảnh hưởng pH lên sinh khối số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum 45 (g) 1.2615 1.3374 1.4560 1.2045 0.7842 0.8034 0.6690 0.6891 0.7351 Sai số 46 7.5 (g) 1.6044 1.4516 0.7594 1.3082 1.3335 0.8635 0.8202 0.7156 0.5895 Sinh khối (g) Hình 3.17: Ảnh hưởng pH lên hình thành số lượng bào tử nấm Purpureocillium 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 1.009 0.993 lilacinum 1.050 0.837 Bảng 3.4: Ảnh hưởng pH đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Đĩa pH pH 6.5 pH pH 7.5 pH Hình 3.16: Đồ thị thể ảnh hưởng pH lên sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Bảng số liệu 3.3 hình 3.16 cho thấy giá trị sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt cao pH 7.5 (1.050 g/100ml) đạt giá trị thấp pH (0.837g/100ml) Tuy nhiên thay đổi giá trị pH ảnh hưởng đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum qua phân tích phần mềm sử lý Stargraphic cho thấy sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum khác biệt nhóm giá trị pH Sự thay đổi pH môi trường ảnh hưởng đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum nấm Purpureocillium lilacinum có khả phát triển khoảng pH rộng (cả điều kiện pH kiềm lẫn axit ) phát triển Và thay đổi giá trị pH không tỷ lệ thuận với phát triển sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum ( theo đồ thị 3.3 ) cho ta thấy pH sinh khối 1.009 g/100ml đến pH 6.5 sinh khối giảm xuống 0.993g/100ml pH sinh khối đạt 0.837g/100ml pH 7.5 sinh khối lại tăng lên 1.050g/100ml 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Số lượng bào Số lượng bào tử Số lượng bào Số lượng bào tử (pH 6) (pH 6.5) (bào tử (pH 7) (bào tử (pH 7.5) (bào tử/ ml) tử/ ml) tử/ ml) (bào tử/ ml) 51600000 23400000 46000000 30800000 50000000 26600000 34000000 33200000 49800000 26400000 34000000 30600000 14400000 23000000 22000000 25200000 14000000 24600000 32000000 27000000 14400000 25600000 24000000 14000000 25400000 13600000 11000000 30000000 25000000 17400000 7400000 40000000 29000000 11200000 13200000 38000000 9400000 10400000 10000000 3800000 9800000 6400000 17400000 6600000 10000000 4800000 7600000 5400000 5000000 7000000 6600000 5200000 5400000 7400000 7800000 2800000 3200000 5400000 10200000 3200000 3200000 5000000 9800000 4600000 6600000 3800000 6000000 5200000 3200000 4400000 4000000 2800000 3200000 2800000 5800000 3600000 6800000 6200000 1000000 2800000 6000000 5400000 800000 1800000 5600000 6600000 1200000 2800000 5200000 4000000 800000 5200000 6000000 4200000 4600000 3000000 2000000 2600000 2800000 3800000 2600000 4000000 6400000 3200000 2000000 6000000 1600000 1000000 pH Số lượng bào tử pH 6.5 Số lượng bào tử pH Số lượng bào tử pH 7.5 47 Số mẫu 27 Trung bình (bào tử) 1.06741E7 Sự khác biệt X 27 1.21481E7 X 27 1.24296E7 X 48 Số lượng bào tử pH 27 1.36593E7 X Bào tử nấm PL 16000000 13659259 14000000 12148148 12429630 10674074 12000000 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 pH6 pH6.5 pH7 pH7.5 Hình 19: Ảnh hưởng nguồn N lên sinh khối số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum pH Hình 3.18: Biểu đồ thể ảnh hưởng pH đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum NaNO3 KNO3 Đối với hình thành bào tử nhận thấy giá trị pH cho số lượng bào tử cao 13659259 bào tử/ ml đạt số lượng bào tử thấp giá trị pH 6.5 ( 10674074 bào tử/ ml) Tuy nhiên qua phân tích phần mềm Stargraphic cho thấy khác biệt số lượng bào tử thu nhóm giá trị pH Từ kết phân tích bảng 3.4 hình 3.18 cho kết luận thay đổi giá trị pH ý nghĩa hình thành sinh khối số lượng bào tử nấm (NH4)2SO4 Hình 20: Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum nguồn N khác Purpureocillium lilacinum 3.4.2 Ảnh hưởng nguồn Nitơ nguồn Cacbon a Ảnh hưởng nguồn Nitơ Chúng tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum môi trường lỏng CzapekDox bình tam giác 250ml (100ml môi trường/bình) thay cao nấm men nguồn Nitơ khác như: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 49 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nguồn N đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Bình Cao nấm men KNO3 NaNO3 (NH4)2SO4 (g) (g) (g) (g) 0.7039 0.1694 0.1396 0.1905 0.7655 0.2587 0.1817 0.1848 0.6775 0.1710 0.1356 0.1841 0.7109 0.1040 0.1759 0.1591 0.5246 0.1464 0.0959 0.2261 0.7911 0.1353 0.0812 0.1444 50 0.8193 0.6452 0.7882 NaNO3 (NH4)2SO4 KNO3 Cao nấm men 0.1317 0.1038 0.1984 0.2005 0.1744 0.1640 0.3298 0.2445 0.1489 Sai số Số Trung bình Sự khác biệt mẫu (g) 0.0916788 0.148067 X 0.0262158 0.177811 X 0.0710664 0.182978 X 0.0515726 0.714022 X cón chứa thêm thành phần khác như: vitamin, chitin (là thành phần tham gia cấu trúc vách tế bào nấm sợi) có vai trò việc chuyển hoá chất, tham gia hình thành sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Hình 22: Ảnh hưởng nguồn N lên số lượng bào tử nấm Hình 21: Đồ thị thể ảnh hưởng nguồn N đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Purpureocillium lilacinum − Kết trình bày bảng 3.5 hình 3.21 cho thâý nấm Purpureocillium lilacinum sinh trưỏng tất nguồn N từ N vô như: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 đến nguồn N hũư như: cao nấm men Trong đó, sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị Bảng 3.6: Ảnh hưởng nguồn N lên số lượng bào tử nấm cao nuôi cấy môi trường có nguồn N cao nấm men (0.714022g/ ml) đạt giá trị thấp môi trường có (NH4)2SO4 − Qua kết phân tích số liệu phần mềm Stargraphic cho thấy thay đổi nguồn N có ảnh hưởng đến hình thành sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum sinh khối nhóm N khác có khác biệt rõ ràng: nguồn N hữu cao nấm men khác biệt hẳn so với nguồn N vô là: KNO3, NaNO3, (NH4)2SO4 Còn nguồn N vô với khác biệt sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Nguyên nhân khác biệt nhóm nguồn N việc cung cấp protein cao nấm men 51 Purpureocillium lilacinum Đĩa Cao nấm men (bào tử/ ml) 3800000 1800000 5000000 4800000 5400000 3600000 KNO3 (bào tử/ ml) 5800000 5200000 1600000 6600000 4600000 6000000 52 NaNO3 (NH4)2SO4 (bào tử/ ml) (bào tử/ ml) 1800000 3200000 1200000 200000 2000000 800000 1400000 200000 2000000 200000 1200000 400000 5800000 4600000 3200000 3600000 1000000 1400000 3400000 1200000 4000000 4600000 5400000 2600000 3000000 2400000 1200000 2800000 1600000 1800000 3600000 2600000 2800000 Số mẫu (NH4)2SO Cao nấm men NaNO3 KNO3 27 27 27 27 6400000 5600000 5400000 2600000 1000000 3600000 4000000 7800000 1800000 3000000 1800000 2600000 1000000 800000 1400000 2400000 1000000 2600000 4400000 2600000 3600000 Trung bình (bào tử/ ml) 814815 3.22222E6 3.40741E6 3.52593E6 5400000 4600000 4800000 5000000 2200000 3200000 5200000 1400000 3000000 3200000 2800000 2800000 2400000 4400000 2800000 5200000 5000000 2800000 3000000 8000000 5200000 Sự khác biệt X X X X 1600000 400000 200000 3800000 400000 200000 200000 3600000 1800000 400000 400000 200000 200000 400000 600000 400000 200000 800000 400000 200000 600000 4000000 3500000 3525926 3222222 3407407 3000000 Bào tử 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2500000 2000000 1500000 814815 1000000 500000 Cao nấm men KNO3 NaNO3 (NH4)2SO4 Nguồn N Hình 23: Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng nguồn N lên số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum − Kết từ bảng 3.6 hình 3.23 cho số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao sử dụng nguồn N KNO3 (3525926 bào tử/ ml) đạt giá trị thấp sử dụng nguồn N (NH4)2SO4 (814815bào tử/ml) Sự thay đổi nguồn N ảnh hưởng rõ ràng đến hình thành bào tử nấm Purpureocillium lilacinum điều thể qua khác biệt số lượng bào tử nguồn N (NH4)2SO4 với nguồn N khác: cao nấm men, KNO3, NaNO3 − Khác với hình thành sinh khối, hình thành bào tử thường xảy điều kiện môi trường khắc nghiệt, thiếu thốn thấy nuôi cấy môi trường sử dụng nguồn N KNO3 lại cho kết cao sử dụng nấm men Tuy nhiên qua phân tích số liệu không cho thấy khác biệt KNO3 cao nấm men đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Do đó, chọn cao nấm men nguồn N cho thí nghiệm b Ảnh hưởng nguồn Cacbon Chúng tiến hành nuôi cấy nấm Purpureocillium lilacinum môi trường lỏng Czapek-Dox Broth bình tam giác 250ml (100ml môi trường/bình) thay nguồn C glucose bằng: saccharose, tinh bột Kết thu 53 54 0.929055556 0.9 Sinh khối (g) 0.8 0.757577778 0.7 0.624344444 0.6 0.5 Sinh khối trung bình 0.4 0.3 Glucose 0.2 Saccharose 0.1 glucose saccarose tinh bột Nguồn C Hình 3.25: Đồ thị khảo sát ảnh hưởng nguồn C lên sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Tinh bột - Kết phân tích bảng 3.7 hình 3.25 cho thấy chủng nấm Purpureocillium Hình 24: Ảnh hưởng nguồn C lên sinh khối nấm đường đa tinh bột Sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao sử Purpureocillium lilacinum dụng nguồn C saccharose (0.929056g/ 100ml) sinh khối đạt giá trị thấp sử Bảng 3.7: Ảnh hưởng nguồn C lên sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Bình Glucose (g) Saccharos(g) Tinh bột(g) 0.7618 0.9068 0.7186 0.8579 0.7700 0.7260 0.6601 0.8591 0.7068 0.9686 1.4147 0.6882 0.8125 0.9698 0.4943 0.7071 1.0474 0.5248 0.7555 0.9947 0.7597 0.6320 0.6926 0.4827 0.6627 0.7064 0.5180 Nguồn C Số mẫu tinh bột glucose saccharose 9 Trung bình (g) 0.624344 0.757578 0.929056 55 Sai số lilacinum có khả sử dụng loại đường: đường đơn glucose, đường đôi saccharose dụng nguồn C tinh bột (0.624344g/100ml) - Qua phân tích số liệu phần mềm Stargraphic cho thấy khác sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum thu nhóm nguồn C khác nhau: saccharose với tinh bột, saccharose với glucose Điều cho thấy việc thay đổi nguồn C có ảnh hưởng rõ ràng đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Sự khác biệt 0.108659 X 0.221359 X 0.115439 X Tinh bột Saccharose Hình 26: Ảnh hưởng nguồn C lên số lượng bào tử nấm 56 Purpureocillium lilacinum 30000000 24200000 25000000 20000000 Số lượng bào tử Bảng 3.8: Bảng số liệu khảo sát ảnh hưởng nguồn C đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Đĩa Glucose Saccharose Tinh bột (bào tử/ ml) (bào tử/ ml) (bào tử/ ml) 3800000 36600000 14000000 1800000 31000000 4800000 5000000 24200000 7400000 4800000 15000000 17600000 5400000 11600000 15600000 3600000 37000000 16200000 5800000 25000000 15000000 4600000 19400000 17400000 3200000 20200000 14600000 10 3600000 33400000 21200000 11 1000000 23600000 16200000 12 1400000 21200000 20600000 13 3400000 20600000 5000000 14 1200000 33000000 11200000 15 4000000 21400000 9800000 16 4600000 22600000 20000000 17 5400000 14400000 18200000 18 2600000 23000000 8200000 19 3000000 11400000 12400000 20 2400000 25400000 8000000 21 1200000 25200000 10000000 22 2800000 28200000 12000000 23 1600000 18000000 6000000 24 1800000 31200000 5000000 25 3600000 25800000 14000000 26 2600000 37000000 9000000 27 2800000 18000000 16000000 12792593 15000000 Số lượng bào t 10000000 5000000 3222222 glucose saccharose tinh bột Nguồn C Hình 27: Biểu đồ khảo sát ảnh hưởng nguồn C đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum - Kết trình bày bảng 3.8 hình 3.27 cho thấy số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao sử dụng nguồn C saccharose (24200000 bào tử/ ml) đạt giá trị thấp sử dụng nguồn C glucose (3222222 bào tử/ ml) qua kết phân tích phần mềm Stargraphic cho thấy khác biệt rõ rệt số lượng bào tử thu từ nhóm nguồn C khác Điều chứng tỏ thay đổi nguồn C có ảnh hưởng rõ rệt đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Nguồn C glucose tinh bột saccharose Số Trung bình Sự khác biệt mẫu (bào tử/ ml) 27 3.22222E6 X 27 1.27926E7 X 27 2.42E7 X 57 58 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt - Từ 30 mẫu côn trùng bị nhiễm nấm bệnh thu chủng nấm A Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại đến loài chủng A, kết luận chủng thuộc loài Purpureocillium Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Hữu Thanh (2000), Động vật chí Việt Nam - Tuyến trùng ký sinh thực vật, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, tr 7, tr 36-37, tr 210-211 Nguyễn Ngọc Châu (2003), Tuyến trùng thực vật sở phòng trừ, Nhà xuất Khoa lilacinum - Từ chủng tuyến trùng thu rễ chuối bị bệnh tuyến trùng tách định loại học Kỹ thuật, tr 10-15 Trần Thị Minh Định (2011), Nghiên cứu khả sinh kháng sinh chủng Aspergillus sp đến giống tuyến trùng Meloidogyne sp - Đã tiến hành thử nghiệm in vitro khả kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp chủng nấm Purpureocillium lilacinum với tỉ lệ lây nhiễm 10 bào tử/ cá thể thấy tỉ lệ lây nhiệm sau ngày thấp khoảng 11% sau ngày lây nhiễm đạt 31% - Đã tiến hành thử nghiệm in vitro trứng tuyến trùng Meloidogyne sp chủng nấm Purpureocillium lilacinum với tỉ lệ lây nhiễm 105 bào tử/ 100 trứng tuyến trùng với tỉ lệ trứng không nở 70% số tỉ lệ trứng không nở ký sinh nấm Purpureocillium phân lập từ rừng ngặp mặn Cần Gìơ, Luận văn Thạc sĩ Sinh Học, Trường ĐH Sư Phạm TP HCM, tr 35-37 Đặng Văn Giáp (1997), Phân tích liệu khoa học chương trình MS-EXCEL, Nhà xuất Giáo Dục Dương Đức Hiếu (2008), Khảo sát khả kiểm soát tuyến trùng bướu rễ hồ tiêu từ bánh dầu neem phối trộn với compost nấm T harzianum, Báo cáo nghiệm thu, tr 4-10 Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh đại cương, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội, tr lilacinum 25% - Bước đầu khảo sát ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến sinh khối số lượng bào Trần Thị Thanh (2007), Công nghệ vi sinh, Nhà xuất Giáo Dục, tr 45-60 Trần Thanh Thuỷ (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo Dục, tr tử nấm Purpureocillium lilacinum: - Với thay đổi giá trị ph từ 6, 6.5, 7, 7.5 ảnh hưởng nhiều đến sinh khối 54-56, tr 70-71 số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum - Với thay đổi nguồn Nitơ: sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao Tiếng Anh nuôi cấy nguồn Nitơ cao nấm men (0.714022g/ 100ml) Số lượng bào tử nấm Alamgir KHAN, Keith L WILLIAMS and Helena Nevalainen (2003), “Testing the Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao sử dụng nguồn Nitơ KNO3 (3525926 bào nematophagous biological control strain Purpureocillium lilacinum 251 for paecilotoxin production”, Elsevier, pp 107-111 tử/ ml) - Với thay đổi nguồn Cacbon: sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum đạt giá trị cao nuôi cấy nguồn cacbon saccharose (0.929056 g/ 100ml) đạt số lượng bào tử cao (24200000 bào tử/ ml) 10 Alamgir KHAN, Keith L WILLIAMS and Helena K.M NEVALAINEN (2006), “Control of purpureocillium lilacinumant-parasitic nematodes by Paecilomyces lilacinus and Monacrosporium lysipagum in pot trials”, Biocontrol 51, pp 643-658 11 Chen Guan Pau, Chan Teck Stephen Leong, Sing King Wong, Lily Eng, Make Jiwan, Franklin Ragai Kundat, Zakry Fitri Bin AB Aziz, Osumanu Haruna Ahmed and Nik 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục khảo sát khả kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne sp nấm Purpureocillium lilacinum điều kiện nhà lưới để làm sở ứng dụng 59 Muhamamad Majid (2012), “Isolation of indigenous strains of Purpureocillium lilacinum with antogonistic activity aganinst Meloidogyne incognita”, International jounal of Agriculture & Biology, 14: pp 197-203 60 12 Christos I Rumbos and Sebastian Kiewnk (2006), “Effect of purpureocillium lilacinumantspecies on persistence of Purpureocillium lilacinum strain 251 in soil and on root colonization by the fungus”, Purpureocillium lilacinumant and Soil 283, pp 25-31 13 CMPT Mycology Purpureocillium lilacinumus Program (2011), “Sinus aspiratePaecilomyces species (lilacinus)”, Challenge 1109-3 and the effect of biocontrol agents on purpureocillium lilacinumant growth”, African Journal of Agricultural Research, Vol 4(6), pp 564-567 22 Xiaoli Liu, Xizhuo Wang, Laifa Wang, Qinglong Shu, Zhihua Cao (2013), “Generatiom of green fluorenscent protein vector transfomed Purpureocillium lilacinum strains”, Academic journals, Vol 7(13), pp 1114-1120 14 F.A Zaki and D.S Bhatuyến trùngi (1990), “In vivo parasitism of Meloidogyne javanica 23 Yuzuru Mikami, Katsukiyo Yazawa, Kazutaka Fukushima, Tadashi Arai, Shunichi by an oviparasitic fungus, Purpureocillium lilacinum”, Departermant of Nematology, Udagawa and Robert A Samson (1989), “Paecilotoxin production in clinical or terrestrial Haryana Agricultural University – Hisar 125004, India, 18: pp 141-143 isolates 15 Hajer Regaieg, Aurelio Ciancio, Najet Horrrigue Raouani, Gaetano Grrasso, Laura Rosso of Purpureocillium lilacinum strains”, Kluwer Academic Publishers, Mycopathologia 108, pp 195-199 (2010), “Effects of culture filtrates from the nematophagous fungus, Verticillium 24 Zaneta Fiedler and Danuta Sasnowska (2007), “Nematophagous fungus Purpureocillium leptobactrum on viability of the root-knot nematode Meloidogyne incognita”, Springer lilacinum (Thom) Samson is also a biological agent for control of greenhouse insects and Science and Business Media B.V mite pests”, Biocontrol 52, pp 547-558 16 Imran A Siddiqui, Shanmin A Qureshi, V Sultana, S Ehteshamul-Haque and Abdul Ghaffar (2000), “Biological control of rot-root knot disease compurpureocillium Web lilacinumex of tomato”, Kluwer Academic Publishers, Purpureocillium lilacinumant and 25.htuyếntrùngp://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Tuy%E1%BA%BFn_tr%C3%B9ng_h%E1 %BA%A1i_th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt Soil 227, pp 163-169 17 Jian Xin Deng, Narayan Chandra Paul, Huyn Kyu Sang, Ji Hye Lee, Young Soo Hwang and Seung Hun Yu (2012), “Frist report on isolation of Penicillium adametzioides and 26.htuyến trùngp://hydrology1.nmsu.edu/teaching/soil698/Student_Reports/lightmicroscope/light_microscope/microscopic-microorganisms.html\ Purpureocillium lilacinum from decayed fruit of Cheongsoo grapes in Korea”, The Korean 27.htuyến trùngp://agronovida.blogspot.com/2011/04/el-cultivo-de-lasmandarinas_1178.htmlhtuyến trùngp://www.agirpourlabiodiversite.fr/spip.php?article24 Society of Mycology 40(1), pp 66-70 18 Li Gao and Xing Zhong Liu (2010), “Sporulation of several biocontrol fungi as affected by carbon and nitrogen sources in a two-stage cultivation system”, The Journal of Microbiology, Vol 48, No 6, pp 767-770 28.htuyếntrùngp://zipcodezoo.com/Photographers/Agroscope%20FAL%20Reckenholz%20Arc hives.asp 29.htuyến trùngp://www.vipesco.com.vn/tintucchitiet.php?Idtin=6338 19 M Nasr Esfahari and B Ansari Pour (2006), “The effects of Purpureocillium lilacinum on the pathogenesis of Meloidogyne javanica and tomato purpureocillium lilacinumant growth 30.htuyến trùngp://www.khuyennongtphcm.com/?mnu=4&s=600012&id=2785 parameters, Iran Agricultural Research”, Vol 24, No and Vol 25, No 31.htuyếntrùngp://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/Nematodes/Pages/RootknotNemat ode.aspx 20 Nic Smol (2007), Lectura book of the Postgraduate Unternational Nematology Course- 32.htuyến trùngp://www.nature.com/nbt/journal/v26/n8/fig_tab/nbt.1482_F1.html General techniques, Ghent University 21 Poornima Sharma and Rakesh Pandey (2009), “Bological control of root-knot nematode; 33.http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/Images/Carrots/Root-Knot/Root-KnotCycle.jpg Meloidogyne incognita in the medicinal purpureocillium lilacinumant; Withania sominifera 61 62 PHỤ LỤC 34.htuyến trùngp://tapchitre.com/kham-pha/ngam-cac-loai-nam-ky-quai-tu-kinh-hien-vi20120926031033229.tct 35.htuyến trùngp://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012/06/paecilomyces-lilacinus.html 36.htuyến trùngp://agriviet.com/home/threads/5705-Cong-Ty-Tnhh-Nong-Sinh 37.htuyến trùngp://www.gaanvn.com/news.php5?NewsID=111 38.htuyến trùngp://www.greenmaxagrotech.com/paecilomyces-lilacinus.html 39.htuyến trùngp://trade.indiamart.com/search.mp?search=paecilomyces+lilacinus 40.htuyến trùngp://agriviet.com/home/threads/5705-Cong-Ty-Tnhh-Nong-Sinh 41.htuyến trùngp://www.doctor-obregon.com/siteimages/paecilomyces1.jpg 42.htuyếntrùngp://origin-ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0 S0038071710001422-gr1.jpg Kết xử lý số liệu phần mềm Stargraphic Ảnh hưởng pH đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics Count Average Standard deviation pH6 1.00877 0.204854 pH6.5 0.99335 0.31488 pH7 0.83671 0.227628 pH7.5 1.04954 0.37276 Total 36 0.97209 0.28736 Stnd kurtosis pH6 -0.973109 pH6.5 -1.22625 pH7 -0.342502 pH7.5 -1.09884 Total -1.12136 ANOVA Table Source Sum of Squares Between 0.235116 groups Within groups 2.65504 Total (Corr.) 2.89015 Multiple Range Tests Coeff of variation 20.3074% 31.6986% Minimum Maximu Range Stnd m skewness 0.7486 1.2953 0.5467 0.331128 0.669 1.456 0.787 0.459758 27.2051% 0.5422 1.2245 0.6823 0.386119 35.5164% 29.5609% 0.5895 0.5422 1.6044 1.6044 1.0149 0.374244 1.0622 1.15181 Df Mean F-Ratio Square 0.0783721 0.94 P-Value 0.4307 32 0.0829699 35 Method: 95.0 percent LSD Count Mean pH7 pH6.5 pH6 pH7.5 9 Contrast 63 Homogeneou s Groups 0.83671 X 0.99335 X 1.00877 X 1.04954 X ph6 - ph6_5 ph6 - ph7 ph6 - ph7_5 ph6_5 - ph7 ph6_5 ph7_5 ph7 - ph7_5 Sig Difference +/- 64 0.0154111 0.172056 0.0407778 0.156644 0.0561889 -0.212833 Limits 0.276587 0.276587 0.276587 0.276587 0.276587 0.276587 * denotes a statistically significant difference Ảnh hưởng pH đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics Count Average Số lượng bào tử _pH Số lượng bào tử _pH 6.5 Số lượng bào tử _pH Số lượng bào tử _pH 7.5 Total 27 27 27 27 108 Standard deviation 1.36593E 1.51168E7 1.06741E 8.44387E6 1.21481E 1.20962E7 1.24296E 1.33039E7 1.22278E 1.23512E7 Stnd skewness Số lượng bào tử _pH 3.65545 Số lượng bào tử _pH 2.14632 6.5 Số lượng bào tử _pH 3.01232 Số lượng bào tử _pH 2.11917 7.5 Total 6.30008 ANOVA Table Source Sum of Df Squares Between 1.21776E14 groups Within groups 1.62013E16 104 Total (Corr.) 1.63231E16 Multiple Range Tests Coeff of variation 110.67% Minimum Maximu Range m 2.E6 5.16E7 4.96E7 79.1063% 2.6E6 99.5726% 800000 4.6E7 4.52E7 107.034% 1.E6 3.9E7 101.009% 800000 5.16E7 Stnd kurtosis 2.06987 -0.679829 1.34052 -0.794559 3.04224 Mean F-Ratio Square 4.0592E13 0.26 P-Value 0.8536 4.E7 2.4E7 5.08E7 Ảnh hưởng nguồn N đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum deviation variation cao nấm 0.71402 0.0916788 12.8398% 0.5246 0.8193 men (NH4)2SO4 0.17781 0.0262158 14.7436% 0.1444 0.2261 KNO 0.18297 0.0710664 38.8388% 0.104 0.3298 NaNO3 0.14806 0.0515726 34.8307% 0.0812 0.2445 Total 36 0.30571 0.247348 80.907% 0.0812 0.8193 1.55782E1 107 Method: 95.0 percent LSD Số lượng bào tử _pH 6.5 Số lượng bào tử _pH Số lượng bào tử _pH 7.5_ Số lượng bào tử _pH 2.66E7 Contrast Sig Difference +/- Limits Số lượng bào tử _pH 6_- Số lượng bào tử 2.98519E 6.73633E _pH 6.5 6 Số lượng bào tử _pH 6- Số lượng bào tử 1.51111E 6.73633E _pH 6 Số lượng bào tử _pH 6- Số lượng bào tử 1.22963E 6.73633E _pH 7.5 6 Số lượng bào tử? _pH 6.5- Số lượng bào tử 6.73633E bào t? _pH 1.47407E 6 Số lượng bào tử _pH 6.5 - Số lượng bào tử 6.73633E _pH 7.5 1.75556E 6 Số lượng bào tử _pH - Số lượng bào tử -281481 6.73633E _pH 7.5 * denotes a statistically significant difference Count Mean Homogeneous Groups 27 27 27 27 1.06741E7 1.21481E7 1.24296E7 1.36593E7 X X X X 65 cao nấm men (NH4)2SO4 KNO3 NaNO3 Total Stnd kurtosis 0.699889 -0.107829 0.740693 -0.0145503 -0.381397 66 Range 0.2947 Stnd skewness -1.27799 0.0817 0.582444 0.2258 1.5441 0.1633 0.637726 0.7381 2.91598 ANOVA Table Source Sum of Squares Between 2.00692 groups Within groups 0.13442 Total (Corr.) 2.14134 Multiple Range Tests Df Mean Square 0.668975 cao nấm men (NH4)2SO4 cao nấm men KNO3 cao nấm men NaNO3 (NH4)2SO4- KNO3 P-Value 159.26 0.0000 (NH4)2SO4 27 Total 108 cao nấm men KNO3 -1.00715 NaNO3 0.406629 (NH4)2SO4 3.54731 Total -1.10586 ANOVA Table Source Sum of Squares Between 1.35053E14 groups Within groups 2.59751E14 Homogeneous Groups X X X X Total (Corr.) 3.94804E14 Multiple Range Tests Sig Difference +/Limits * 0.536211 0.062234 * 0.531044 0.062234 * 0.565956 0.062234 67 130.047% 70.0386% Df Mean F-Ratio Square 4.50177E1 18.02 104 2.49761E1 107 Method: 95.0 percent LSD Count Mean (NH4)2SO4 27 cao nấm 27 men NaNO3 27 0.062234 0.0051666 (NH4)2SO4- NaNO3 0.0297444 0.062234 KNO3 - NaNO3 0.0349111 0.062234 * denotes a statistically significant difference Ảnh hưởng nguồn N đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum deviation variation cao nấm 27 3.22222E 1.41349E6 43.8669% 1.E6 5.8E6 men KNO3 27 3.52593E 2.01697E6 57.2038% 800000 7.8E6 NaNO3 27 3.40741E 1.67376E6 49.1213% 1.2E6 8.E6 814815 1.05965E6 2.74259E 1.92087E6 200000 200000 3.8E6 8.E6 Stnd kurtosis -1.0372 32 0.00420061 35 Method: 95.0 percent LSD Count Mean NaNO3 0.14806 (NH4)2SO4 0.17781 KNO3 0.18297 cao nấm 0.71402 men Contrast F-Ratio KNO3 Contrast Range 4.8E6 Stnd skewness 0.268604 7.E6 0.854775 6.8E6 1.58345 27 Homogeneous Groups 814815 X 3.22222E X 3.40741E X 3.52593E X Sig Difference +/Limits -303704 852957 cao nấm men KNO3 cao nấm men NaNO3 cao nấm men * (NH4)2SO4 KNO3 - NaNO3 KNO3 - (NH4)2SO4 * NaNO3 * -185185 852957 2.40741E6 852957 118519 852957 2.71111E6 852957 2.59259E6 852957 68 P-Value 0.0000 3.6E6 7.8E6 4.4659 2.0689 (NH4)2SO4 * denotes a statistically significant difference Ảnh hưởng nguồn C đến sinh khối nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum deviation variation Glucose 0.757578 0.108659 14.343% 0.632 0.9686 saccharose 0.929056 0.221359 23.8263% 0.6926 1.4147 tinh bột 0.624344 0.115439 18.4896% 0.4827 0.7597 Total 27 0.770326 0.197394 25.6248% 0.4827 1.4147 Stnd kurtosis Glucose 0.16557 saccharose 1.44244 tinh bột -1.41498 Total 3.37441 ANOVA Table Source Sum of Squares Between 0.420014 groups Within groups 0.593063 Total (Corr.) 1.01308 Multiple Range Tests Df Mean Square 0.210007 F-Ratio P-Value 8.50 0.0016 24 0.024711 26 Range Stnd skewness 0.3366 1.02536 0.7221 1.59533 0.277 -0.261205 0.932 2.71398 Ảnh hưởng nguồn C đến số lượng bào tử nấm Purpureocillium lilacinum Summary Statistics Count Average Standard Coeff of Minimu Maximu Range deviation variation m m glucose 27 3.22222 1.41349E6 43.8669% 1.E6 5.8E6 4.8E6 E6 saccharose 27 2.42E7 7.37397E6 30.4709% 1.14E7 3.7E7 2.56E7 tinh bột 27 1.27926 4.99491E6 39.0454% 4.8E6 2.12E7 1.64E7 E7 Total 81 1.34049 1.0044E7 74.9273% 1.E6 3.7E7 3.6E7 E7 ANOVA Table Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 5.95609E15 2.97805E1 109.86 0.0000 groups Within groups 2.11439E15 78 2.71075E1 Total (Corr.) 8.07048E15 80 Multiple Range Tests Method: 95.0 percent LSD Count Mean glucose 27 tinh bột 27 saccharose 27 Homogeneo us Groups 3.22222E6 X 1.27926E7 2.42E7 X X Method: 95.0 percent LSD Count Mean tinh bột glucose saccharose Contrast Homogeneous Groups 0.624344 X 0.757578 X 0.929056 X Sig Difference +/Limits * -0.171478 0.152942 glucose saccharose glucose - tinh 0.133233 0.152942 bột saccharose - tinh * 0.304711 0.152942 bột * denotes a statistically significant difference 69 Contrast Sig Difference +/- Limits glucose * -2.09778E7 2.82109E saccharose glucose - tinh bột * -9.57037E6 2.82109E saccharose - tinh * 1.14074E7 2.82109E bột * denotes a statistically significant difference 70 Stnd skewness 0.268604 0.377893 -0.195049 2.31962 Kết định danh nấm Purpureocillium lilacinum 71 72 73