LỜI CAM ĐOAN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu - kết luận văn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn NGUYỄN THỊ HIỀN Nguyễn Thị Hiền NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH Hà Nội, 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC MỞ ĐẦU Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS ĐẶT VẤN ĐỀ Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh CHƢƠNG TỔNG QUAN học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, 1.1 tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian thực hoàn 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis thành luận văn tốt nghiệp 1.1.2 Đặc điểm hình thái Bt Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng Di truyền Vi sinh vật, tận tình bảo giúp đỡ hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi giúp học tập hoàn thành luận văn Đại cƣơng Bacillus thuringiensis 1.1.3 Đặc điểm sinh hoá 1.1.4 Đặc điểm phân loại 1.1.5 Phân loại gene độc tố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.6 Các loại độc tố Bacillus thuringiensis 11 1.1.7 Cấu trúc nhóm độc tố tinh thể 13 1.1.8 Cơ chế tác động protein tinh thể lên côn trùng 14 Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012 1.1.9 Nghiên cứu ứng dụng Bt Việt Nam 15 Học viên 1.1.10 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình hình thành bào tử tinh thể độc 16 1.1.11.Gene cry1C loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai 18 1.2 Đại cƣơng côn trùng cánh vảy 19 1.2.1 Côn trùng cánh vảy 19 Nguyễn Thị Hiền 1.2.2 Côn trùng thử nghiệm 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Sinh phẩm 24 2.1.2 Hóa chất thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phân loại chủng Bt phản ứng huyết 26 2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt 27 2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm 27 2.2.4 Tách chiết DNA plasmid 28 2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C PCR 29 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C 30 BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT 2.2.7 Xác định trình tự nucleotide 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 STT Viết tắt có hoạt tính diệt sâu xanh da láng sâu tơ 33 Amp Ampicillin 3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể chủng Bt nghiên cứu 33 Bp Base pair 3.1.3 Hoạt tính diệt chủng Bta sâu xanh da láng sâu 36 Bt Bacillus thuringiensis Nồng độ bào tử 36 Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleotide acid E coli Escherichia coli CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 OD Optical density 10 PCR Polymerase chain reaction 11 SDS Sodium dodecyl sulphate 12 Sol Solution 13 TE Tris EDTA 14 X-gal 3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai mang gene cry1C Viết đầy đủ 3.1.2 Phân loại Bt huyết 35 Hoạt tính chủng Bta diệt sâu xanh da láng sâu tơ 37 3.2 Tách dòng đọc trình tự đoạn gene cry1C 39 3.2.1 Khuếch đại gene cry1C chủng Bta PCR 39 3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C 40 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C 44 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 5- Bromo- Chloro- indolyl β- D- galactoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU Trang Đặt vấn đề Bảng 1.1 Phân loại gene cry Bt………………………………………… 10 Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao điều Bảng 3.1 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng Bt… 34 kiện thuận lợi cho loài sâu hại nông - lâm nghiệp phát triển Côn trùng Bảng 3.2 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta sau ngày thử nghiệm 37 cánh vảy lớn lớp côn trùng gồm bướm bướm đêm, Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bt sau ngày thử nghiệm 38 180.000 loài mô tả có mặt khắp nơi giới, chúng gây thiệt DANH MỤC HÌNH hại nghiêm trọng kinh tế nông nghiệp nước nhà Hình 1.1 Bào tử tinh thể B thuringiensis …………………… … Hình 1.2 Tinh thể vi khuẩn B thuringiensis Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian chiều protein độc tố Cry1Ac 14 Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu vi khuẩn B thuringiensis …… ………… 15 Hình 1.5 Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….…… 21 Hình 1.6 Rau bắp cải bị sâu hại …………… …………………………… 21 Để bảo vệ suất trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với nồng độ cao để phun sau dịch sâu hại bùng phát Trung bình hectar trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan loại hóa chất diệt côn trùng để lại dư lượng thuốc nông phẩm, gây độc hại sức khỏe người sử dụng gây ô nhiễm môi trường Thay Hình 1.7 Vòng đời sâu xanh da láng …………… ……… …………… 23 vào biện pháp hóa học biện pháp sinh học khuyến khích sử Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc Bt môi trường MPA sau 72h nuôi 28ºC 33 dụng Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm Hình 3.2 Hình dạng bào tử tinh thể Bt phóng đại 1000 lần 34 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học giới hoàn toàn không độc với Hình 3.3 Ngưng kết chủng TN 6.12 phân lập với type huyết kính hiển người, động vật môi trường [24] vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………… 36 Hình 3.4 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta nghiên cứu 37 Hình 3.5 Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bta nghiên cứu……………… 38 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng Bta nghiên cứu………… 39 Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất môi trường LBA sau nuôi cấy qua Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) nghiên cứu nhiều 82 loài Bacillus thuringiensis Bacillus thurigiensis subsp aizawai có khả sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng cánh vảy (Lepidoptera), có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh đêm……………………………………………………………………………… 41 (Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) số côn Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… 42 trùng cánh (Diptera) Cry1C loại protein thể độc Bta sinh Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng cánh vảy mạnh agarose 1% 43 Vì vậy, để sản xuất thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp….…44 cánh vảy chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng cánh vảy vào trồng, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.1 Chƣơng TỔNG QUAN Mục tiêu 1.1 - Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis  Trên giới - Tách dòng đọc trình tự gene cry1C chủng Bta sàng lọc có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy 1.2 Đại cƣơng Bacillus thuringiensis B thuringiensis vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa phát năm 1901 ông nghiên cứu bệnh tằm dâu, Nội dung phát nguyên nhân gây bệnh cho tằm loại vi khuẩn thuộc chi - Thu thập chủng B thuringiensis phân lập số địa điểm Thái Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn Bacillus sotto [8] Nguyên Năm 1911, Berliner (người Đức) phân lập loại vi khuẩn gây - Sàng lọc chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp huyết học bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải vùng Thuringien ông đặt tên Bacillus thuringiensis năm 1915 [8] - Thử hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy chủng Bta thu nhận - Phát chủng Bta mang gene cry1C từ chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp PCR Năm 1930, Bacillus thuringiensis thử nghiệm chống sâu đục thân Châu Âu Năm 1938, chế phẩm Bt sản xuất lần để diệt sâu hại lúa - Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy - Xác định trình tự đoạn gene cry1C tách dòng so sánh với trình mì Pháp tự gene Gene Bank Năm 1953, Hannay Fitzjame phát thể vùi công bố tinh thể có chất protein [8] Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) sản xuất thuốc “Thuricide” với khối lượng lớn từ chủng B thuringiensis subsp kurstaki Năm 1956, Angus chứng minh hoạt tính diệt sâu tinh thể tách từ tế bào bào tử [33] Năm 1962, de Barjac Bonnefoi đưa phương pháp phân loại cho chủng Bt Bacilus sphaericus (Bs) phương pháp huyết Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh phát chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Năm 1977, Goldberg Margarit phát loài Bt var israelensis diệt ấu trùng muỗi ruồi thuộc hai cánh Phát chứng tỏ phổ hoạt tính Bt không bó hẹp cánh vảy (Lepidoptera) mà với hai cánh (Diptera) [14] Đến nhiều chủng Bt phát hiện, nghiên cứu sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao  Ở Việt Nam Lịch sử nghiên cứu ứng dụng Bacillus thuringiensis Việt Nam Năm 1981, Schnepf Whiteley lần phân lập tách dòng gene độc tố mã hóa diệt sâu chủng Bt subsp kurstaki HD-1 gọi gene cry1 cho biểu gene E coli Từ số lượng lớn gene tách dòng nghiên cứu đặc tính khoảng 40 năm chia làm thời kỳ với nhiều công trình tác Nguyễn Công Bì nh , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, người mở đường nghiên cứu B thuringiensis Việt Nam [10] Thời kỳ mở đầu nghiên cứu Năm 1983, phổ hoạt tính Bt lại nâng lên Krieg cộng phát loài Bt subsp tenebrionis diệt cánh cứng (Coleoptera) Chủng phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar Sau đó, công ty Mycogen phát chủng tương tự Bt subsp morrisoni đặt tên Bt subsp Sandiego tổng hợp chuỗi gene độc tố chúng [14] Năm 1985, gene cry Bt chuyển vào trồng để diệt sâu đến năm 1995 chuyển gene đưa vào sản xuất ứng dụng Từ năm 1987 -1992, người ta phát thấy Bt có khả diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc Trematoda diệt kiến thuộc Hymenoptera Đến nhiều chủng Bt phát hiện, nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao [10, 13, 25] Các công bố khoa học nghiên cứu B thuringiensis thời kỳ Vào thời kỳ số viện nghiên cứu tiến hành sản xuất B thuringiensis phương pháp thủ công bán công nghiệp phòng thí nghiệm sử dụng chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var thuringiensis, B thuringiensis var kurstaki Các chế phẩm B thuringiensis sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội thu kết tốt Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B thuringiensis bị giảm sút chế phẩm B thuringiensis sản xuất có chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [8,10] Thời kỳ sản xuất ứng dụng (1984-1994) Ở thời kỳ này, chế phẩm B thuringiensis sản xuất theo phương pháp dịch thể áp dụng rộng rãi, có hiệu phòng trừ rõ rệt, có giá Năm 1995, chuyển gene thương phẩm đưa vào sản thành hợp lý nên nông dân ưa chuộng Sau đó, số đơn vị thuộc xuất, từ chương ứng dụng Bt vào trồng nông nghiệp – trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm B thuringiensis theo phương trồng công nghệ sinh học thực phẩm chuyển gene [2] pháp lên men hở không cần vô trùng không thu kết tốt [10] Năm 2003, Sakai cs công bố thông tin protein tinh thể Bt có khả diệt tế bào ung thư Thời kỳ nghiên cứu bản, ứng dụng phát triển (từ năm 1994 đến nay) Cuối thời kỳ sản xuất ứng dụng, chế phẩm B thuringiensis chất Năm 2005, Ohba N.D Binh phát protein loài Bt lượng không tiêu thụ Sản xuất ứng dụng B thuringiensis bước vào thời phân lập Việt Nam hạn chế phát triển tế bào ung thư cổ tử cung kỳ thoái trào, nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu để phục người [10,13] vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất sở ứng dụng Do nhà khoa Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn học chuyển việc nghiên cứu B thuringiensis sang hướng tìm kiếm Khuẩn lạc Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn chủng B thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục lạc nhăn, đường kính đạt tới 8-10m Một số chủng Bt xuất khuẩn hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B thuringiensis ứng dụng công nghệ lạc dạng trơn nhẵn chuyển gene B thuringiensis phục vụ sản xuất [10] Mỗi tế bào Bt trưởng thành có khả sinh bào tử tinh thể độc Các nghiên cứu Ngô Đình Bính cs cho thấy chủng B chất protein, có khả diệt côn trùng Bào tử Bt có dạng hình trụ thuringiensis phân lập Việt Nam đa dạng thành phần loài [6] Năm hình trứng, kích thước 1,6-2m Bào tử hình thành điều kiện môi 2005, Lê Thị Minh Thành cs nghiên cứu phân bố đa dạng gen e trường bất lợi nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng Khi gặp Bt phân lập số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ phân loại 22 điều kiện thuận lợi, bào tử nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27] loài tổng số 82 loài phát giới [7, 11] Trên sở phát hiện, tách dòng đọc trình tự gene có chủng B thuringiensis phân lập Việt Nam, Ngô Đình Bính cs tách dòng biểu gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C Cry1D diệt sâu khoang E coli thu protein tái tổ hợp có hiệu diệt sâu cao so với đối chứng [5,12] Ở Việt Nam, nghiên cứu lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng vào trồng để tạo có khả kháng sâu bệnh cuối kỷ 20 Có nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu vào trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo Hình 1.1 Bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis [21] Cùng với trình tạo bào tử, tinh thể protein độc tố tổng giống trồng có khả kháng sâu như: đậu xanh, cải [9,13] hợp Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể Năm 2003, Phan Đình Pháp cs chuyển gene cry1B vào lúa thông qua hình lập phương, hình lưỡng tháp hình cầu) Tinh thể chiếm tới 30% phương pháp sử dụng súng bắn gen Năm 2005, gene kháng sâu trọng lượng khô tế bào Khi nhuộm tế bào Bt thuốc nhuộm fushin chuyển vào cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [14] quan sát kính hiển vi nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm 1.1.2 Đặc điểm hình thái Bt bào tử bắt màu hồng nhạt [27] Bt đối tượng nghiên cứu nhiều số tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng Bt có đặc điểm vi khuẩn đất, tế bào có dạng que, kích thước 3-6m, đứng riêng rẽ tạo thành chuỗi Bt hô hấp hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả di động nhờ tiêm mao mọc bề mặt tế bào [26,27,28] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tuy nhiên, phương pháp phân loại tồn mặt hạn chế Năm 1962, de Barjac Bonnefoi đưa phương pháp phân loại cho Bt phản ứng huyết mô tả 27 type huyết có hoạt tính diệt côn trùng thuộc cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp Phương pháp phân loại theo type huyết H sử dụng chủ yếu đơn giản có tính đặc hiệu cao Phương pháp phân loại này, dựa phản ứng ngưng kết kháng nguyên tiêm mao H vi Hình 1.2 Tinh thể vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21] khuẩn với kháng huyết tương ứng Số lượng type huyết chủng phân loại theo huyết tăng với tổng số chủng phân lập 1.1.3 Đặc điểm sinh hoá Bt không lên men sinh axid môi trường chứa arrabinorase, xylose, manitol, tạo axit môi trường chứa glucose Có khả thủy phân tinh bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển môi trường chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà Bt khả khử amine phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử muối Cho đến năm 2003, người ta phát 69 typ huyết bao gồm 82 thứ huyết khác B thuringiensis Theo hệ thống phân loại B thuringiensis subsp aizawai thuộc type huyết số (Theo Bonnefoi & de Barjac 1963) [5] Bảng phân loại theo type huyết H trung tâm quốc tế B thuringiensis đặt Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất sulfate (www.phenyl alanine tailieu.vn) Bt có khả sinh trưởng phát triển nhiệt độ dao động từ 15-450C phòng thí nghiệm Bt giới từ năm 1982 có 69 type huyết H 1.1.5 Phân loại gene độc tố vi khuẩn Bacillus thuringiensis Nhiệt độ tối ưu 28- 32οC Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho phát triển Bt pH= Bt Kích thước hệ gene B thuringiensis vào khoảng 2,4- 5,7 triệu bp Thể có khả oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu dioxide carbon theo chu nhân vi khuẩn dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa có hình trình Embden- Meyerhoff- Panas [6, 7, 8] dạng định gọi vùng nhân Khi nhuộm màu tế bào Feulgen thấy nhân màu tím Trong vùng nhân có NST dạng 1.1.4 Đặc điểm phân loại vòng chứa sợi DNA xoắn kép Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền Bt Có nhiều phương pháp phân loại B thuringiensis khác nhau: Phân loại Hầu hết chủng B thuringiensis phân lập mang nhân tố di truyền Bt dựa đặc điểm hình thái đặc điểm sinh hoá (Heimpel Angus, nhiễm sắc thể (NST), nhân tố di truyền đóng vòng không 1958).Phân loại theo typ huyết kháng nguyên - H Phân loại thực đóng vòng Trên giới người ta mô tả đồ cấu trúc gene tự nhiên khuẩn thể dựa tính mẫn cảm khác với thực khuẩn thể khác cho số chủng B thuringiensis nhau.Phân loại theo typ huyết kháng protein tinh thể.Phân loại theo loại hình enzym lipase.Phân loại theo nguồn bệnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Năm 1982, Held cộng sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu Các http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chủng Bt sinh tổng hợp dạng độc tố Cry, Cyt, Vip gene cry, Gene cyt bao gồm 45 gene thuộc lớp cyt1, cyt2 cyt3 mã hóa protein gây độc với côn trùng động vật không xương sống Nhóm gene cyt mã hóa cyt, vip mã hóa [21,25] protein 27 kDa chiếm khoảng 40-50% tinh thể, protein có tác dụng gây 1.1.5.1 Gene cry Gene cry mã hóa cho độc tố Cry khác Đây gene độc tố quan trọng Bt, tính đặc hiệu diệt côn trùng protein độc gene cry độc với côn trùng hai cánh giun tròn Gene vip mã hóa Các gene cry thường nằm plasmid có hệ số copy thấp Những Gene vip mã hóa cho độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) Độc nghiên cứu Carlton Gonzalez 21 loài phụ Bt cho thấy số lượng tố Vip Estruch cộng phát vào năm 1996, bao gồm plasmid dao động từ 2- 12 chủng nghiên cứu [11,20] Vip3A Vip3B [8] Theo công bố website Độc tố Vip thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html: côn trùng kháng độc tố Các nhà khoa học phát 85 phát tới 600 gene thuộc 70 họ gene cry Bt Sau họ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt số côn trùng gây hại phổ biến Việt Nam: Hình dạng tinh thể gene vip thuộc nhóm khác nhau, đáng ý gene vip3A mã hóa protein 88 kDa có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon, Spodoptera fugipera, Spodoptera exigua Khi côn trùng ăn phải độc tố, Vip3A Bảng 1.1 Phân loại gene cry Bt Gen khả diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chưa phát Khối lƣợng phân tử protein (kDa) 130 – 138 nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột Hoạt tính diệt côn trùng 1.1.6 Các loại độc tố Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis có loại độc tố: ngoại độc tố nội độc tố: cry1A- cry1L Lưỡng tháp cry2A- cry2C Cầu 69 – 71 Cánh vảy, hai cánh Ngoại độc tố  ( - exotoxin), ngoại độc tố  (-exotoxin), ngoại độc tố  ( - cry3A- cry3C Lập phương 73 – 74 Cánh cứng exotoxin), nội độc tố  (-endotoxin) Trong nội độc tố  có tác dụng diệt côn cry4A- cry4D Cầu 73 – 74 Hai cánh trùng mạnh cry5 Lưỡng tháp 81 Tuyến trùng Ngoại độc tố  cry8 Lập phương 130 Cánh cứng Các gene cry lại Đa dạng 35 – 129 Cánh vảy Đa dạng Gene cyt Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả tan nước, tích tụ pha logarit vài loài phụ giải phóng môi trường tế bào tan rã Ngoại độc tố  có chất enzyme gọi phospholipase Gene cyt mã hóa cho độc tố Cyt có chất protein hình leucithinase, có hoạt tính với vài loài ong cắn đặc biệt ong thành thể vùi độc tố Cry, tính tương đồng amino acid độc tố Tenthre dineda Tác dụng độc ngoại độc tố  có liên quan tới phân huỷ không đáng kể [34] phospholipid mô côn trùng (nghiên cứu phát Toumanoff - năm 1953) [8, 11] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Ngoại độc tố α có tác dụng tiêu diệt Galleria mellonella Ngoài có Ngoài protein tinh thể chứa thành phần khác như: carbohydrate, hiệu lực với loài sâu thuộc cánh vảy, cánh cứng nhiên carbohydrate thành phần phụ pha tạp Ngoại độc tố  trình hình thành bào tử Xét thành phần hóa học nội độc tố  chứa chủ Độc tố Halt Arkawwa (1959) tìm nuôi ấu trùng ruồi nhà thức ăn có chứa B thuringiensis Độc tố  có khối lượng phân tử cao 707- 850 kDa, bền nhiệt, tan nước Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm nuclease RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA Ngoại độc tố  có phổ hoạt tính rộng, kháng côn trùng thuộc cánh vảy, côn trùng thuộc cánh cứng côn trùng thuộc hai cánh [8,12] yếu nguyên tố C, H, O, N, S Ngoài có Ca, Mg, Si, Fe lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn Nguyên tố P Nội độc tố : có đặc điểm không hòa tan dung môi hữu cơ, tan môi trường có pH kiềm, không tan nước, bền nhiệt Khi đun 650C không bị hoạt tính, đun 100 0C 30-40 phút tinh thể bị tính độc Mặc dù tinh thể độc tan pH kiềm, pH kiềm thích hợp Qua nghiên cứu nhà khoa Ngoại độc tố β có hiệu việc chống sâu non côn trùng học nhận thấy rằng, pH cao hay thấp ảnh hưởng tới độc tính mẫn cảm, gây trì trệ việc chuyển hóa lột xác có tác động sâu tinh thể Tuy nhiên lúc tách khỏi bào tử, hòa tan pH trưởng thành phát triển từ ấu trùng ăn phải độc tố ngưỡng gây chết kiềm Sự tổng hợp tinh thể độc bào tử xảy gần đồng thời Qua nghiên cứu Federici Wu cho thấy chế phẩm Bt sử dụng ngoại độc tố  hiệu diệt côn trùng đạt 20% bổ sung thêm nội độc tố  hiệu diệt côn trùng tăng lên tới 75% Ngoại độc tố  khoảng sau pha cân [8, 11, 16] 1.1.7 Cấu trúc nhóm độc tố tinh thể Năm 1991, Li cs công bố cấu trúc nội độc tố  protein tinh thể diệt sâu Cry3A, từ mở rộng cho độc tố khác Các protein tinh Có khối lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng có cấu trúc chung gồm vùng riêng biệt: khí, có khả tan nước Độc tố thuộc nhóm phospholipase, có tác Vùng 1: chuỗi polypeptide gồm 290 amino acid, vùng đầu dụng lên phospholipid giải phóng acid béo, mẫn cảm với nhiệt độ, N Vùng gồm chuỗi xoắn , chuỗi xếp thành hình nhiệt độ từ 60 C trở lên vòng từ 10- 15 phút bị vô hoạt thứ thứ amino acid kị nước nằm liền kề với vùng Nội độc tố  Có chất protein gồm 1180 gốc amino acid, amino acid chủ yếu glutamic aspartic acid, chiếm 20% tổng số amino acid phân tử protein, nguyên nhân gây điểm đẳng điện thấp Lượng cysteine nhỏ 20% tổng axit amin quy định không hoà tan tinh thể, có amino acid: arginine, threonine, leucine, isoleucine [14] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên cạnh bao bọc xung quanh chuỗi xoắn thứ kị nước Mặt bên chuỗi xoắn http://www.lrc-tnu.edu.vn Vùng 2: amino acid 291 đến amino acid 500 Vùng gồm  có cấu trúc tương đồng, song song xếp ngược chiều nhau, có tính tương đồng cao Mỗi bao gồm mảnh  không song song, có cấu trúc chung Hai mảnh  phía tạo thành dải  kéo dài tận phía mảnh  phía Tấm có mảnh  chuỗi xoắn  có chức Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Các nghiên cứu sâu tơ loại sâu hại nghiêm trọng có khả Từ tuổi 2, màu sắc sâu bắt dầu thể rõ dần Bụng màu vàng kháng thuốc cao Trong thể sâu tơ có loại men phân giải thuốc xanh, đốt thân phân biệt rõ dần Mình sâu có sọc màu trắng mờ, thành chất không độc, hệ men vi thể (microsonal enzyme system) Khi sọc lưng sọc hai bên thân, sọc chạy từ đốt thứ đến đốt thể sâu tiếp xúc với hóa chất độc, hệ men vi thể kích thích hoạt động tăng cuối bụng Ở tuổi sâu có kích thước thể trung bình 0,45x3,7mm 100- 200 lần [3] Thời gian phát triển sâu tuổi từ 2-4 ngày Sâu xanh da láng xanh Đầu màu vàng nhạt, bóng; mang nhiều lông Các chấm Sang tuổi 3, lúc lột xác sâu có màu vàng xanh, sau chuyển sang màu Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)có tên khoa học Spodoptera exigua Hubner, thuộc họ Noctuidae (Ngài Đêm), Lepidoptera (bộ Cánh Vảy) sâu nhỏ dần, lông ngắn Thời gian phát triển sâu tuổi từ 2-3 ngày Ở Việt Nam, vùng đồng sông Cửu Long, từ năm 1981 sâu Sau nở sâu sống tập trung quanh ổ trứng, ăn phần diệp lục đối tượng gây hại đậu nành, đậu xanh, hành, ớt số loại hoa thành lổ nhỏ, chừa lại lớp biểu bì trắng Cuối tuổi sâu bắt đầu phân tán màu ngắn ngày khác.Vòng đời sâu khoảng 30 đến 40 ngày, chia thành giai sang lân cận Ấu trùng tuổi ăn lủng thành lổ nhỏ có tập đoạn: quán nhả tơ buông xuống đất bị động Ở tuổi sâu ăn phá mạnh nhất, Giai đoạn trưởng thành: Bướm loại bướm đêm, màu trắng xám, cắn thành lổ to; sâu đeo chùm hoa đậu nành ăn chiều dài thân từ 7-10 mm, sải cánh rộng từ 20-25 mm Đầu màu xám, mang cánh hoa vừa nhú Ở ruộng có mật số cao sâu ăn trơ gân nhiều lông, hai mắt kép to, màu đen, râu đầu hình sợi chỉ, dài từ 5-6 mm Ngực cuống trái non [3] màu nâu đỏ, phủ kín lớp phấn màu xám tro có ánh kim Cánh trước màu xám ngả nâu, thon dài, hình tam giác, góc cánh bầu, có nhiều Giai đoạn nhộng: Kéo dài từ 7–10 ngày, sâu thường hóa nhộng đất lùm cỏ khô vân Thời gian sống bướm từ 5-10 ngày bướm đẻ từ 300400 trứng vòng từ 3-5 ngày Trứng có hình cầu, đường kính từ 0,4-0,5mm, đẻ màu xanh đến vàng nhạt, sau chuyển sang màu trắng đục, nở có chấm đen vỏ trứng, mắt sâu Trứng đẻ thành ổ, phủ lớp lông màu trắng ngà Thời gian ủ trứng từ 2-4 ngày Giai đoạn sâu non: Sâu có từ 5-6 tuổi, phát triển thời gian từ 10-19 ngày Mặt lưng sâu màu xanh trơn láng nên có tên "Sâu xanh da láng" để phân biệt với sâu xanh (Heliothis armigera) Chi tiết tuổi sâu sau: Hình 1.7 Vòng đời sâu xanh da láng [3] Tuổi 1: thân sâu có màu xanh hay vàng xanh, đầu đen bóng, mang nhiều lông, bụng màu vàng nhạt, thể có chiều dài từ 1,2-1,5mm, thường phần đầu có chiều ngang lớn chiều ngang thân sọc thể chưa rõ ràng Thời gian phát triển sâu tuổi từ 2-5 ngày Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 - Hóa chất sử dụng phản ứng PCR: dNTPs, Taq polymease, đệm, nước khử ion… Vật liệu Thiết bị: 2.1.1 Sinh phẩm 150 chủng Bt phân lập từ mẫu đất Thái Nguyên, chưa qua phân loại xác định hình dạng tinh thể, Phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp E coli DH5α nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học Các thiết bị nghiên cứu gồm: Máy li tâm (Fresco, Đức), máy PCR (PTC100, Mỹ), máy vortex (IKA, Đức), máy lắc (Gerharat, Đức), máy soi gel (Vilber Lourmat, Đức), máy chụp gel (Gen Doc), kính hiển vi (Olympus, Nhật), tủ lạnh sâu (Frigo, Đan Mạch) Ngoài sử dụng số dụng cụ khác phục vụ cho Sâu tơ (Plutella xylostella) sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) tuổi Viện Bảo vệ thực vật cung cấp trình nghiên cứu như: đĩa petri, bình tam giác, pipet Môi trƣờng: Các cặp mồi sử dụng để khuếch đại gene cry1C phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp Các loại môi trường sử dụng trình thực thí nghiệm:  Môi trƣờng MPA- MT1 (g/l) - Cặp mồi đặc hiệu gene cry1C TYIC 5’ – CAACCTCTATTTGGTGCAGGTTC 3’ TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’ - Cặp mồi M13 Agar: 20g Pepton: 10g Nước cất: 1l NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH:  Môi trƣờng MPB- MT2 (g/l) Pepton: 10g NaCl: 5g Reverse M13: 5’- CAGGAAACAGCTATG – 3’ Nước cất: 1l pH: Cao thịt: 4g  Môi trƣờng Craige- MT3 (g/l) Forward M13: 3’- GTAAAACGACGGCCA – ’ Bacto agar: 8g Pepton: 10g Nước cất: 1l Vector tách dòng plasmid: pGEM-T Easy NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH: Taq polymerase, enzyme giới hạn (EcoRI), ligase…của hãng Invitrogen, Fermentas  Môi trƣờng LB- MT4 (g/l) Trypton: 10g NaCl: 5g 2.1.2 Hóa chất thiết bị Nước cất: 1l pH: Cao men: 4g  Môi trƣờng LBA- MT5 (g/l) Hóa chất: - Hóa chất sử dụng phân lập nuôi cấy Bt: agar, cao thịt, cao nấm men, peptone, NaCl… Agar: 20g Trypton: 10g Nước: 1l NaCl: 5g Cao men: 4g pH: Các loại dung dịch:  Các dung dịch dùng tách chiết DNA plasmid - Hóa chất sử dụng nhuộm bào tử tinh thể: fuchsin base  Dung dịch Sol 1: Tris HCl, pH = 8.0: 20mM - Hóa chất sử dụng điện di: agarose, SDS, Tris-base, TAE Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn  Dung dịch Sol II: EDTA, pH = 8.0: 10mM có khả chuyển động Do vậy, trước tiến hành phương pháp này, chúng Glucose: 50mM tiến hành kiểm tra khả chuyển động chủng nghiên cứu môi NaOH: 20mM trường MT3 [30] Cách tiến hành: chủng Bt cấy vào ống Craige (là ống thủy SDS: 1%  Dung dịch Sol III: CH3COOK: 60ml CH3COOH: 11,5ml to), nuôi 37ºC 24-28 Khi đó, tế bào có khả chuyển động H2O: 28,5ml di chuyển lên phía bề mặt môi trường, ống Craige ống nghiệm  Các dung dịch dung điện di gel agarose  Dung dịch TE: tinh nhỏ, cắm thẳng đứng vào môi trường Craige chứa ống nghiệm Tris HCl 10mM, pH= 8.0 Vi khuẩn phát triển bề mặt cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi trường MT2, lắc 70–75 vòng/phút khoảng thời gian 12-15 [30] Phản ứng ngưng kết với kháng huyết tương ứng quan sát EDTA 1mM, pH= 8.0  Dung dịch đệm điện di TAE 50X: kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm để kiểm tra khả Tris base 121g chuyển động vi khuẩn, sau nhỏ tiếp 2µl huyết chuẩn (đã pha loãng) Acid acetic 5M: 28.6 ml quan sát kính hiển vi EDTA 0.5M pH=8.0: 50ml 2.2.2 Nước khử ion đủ 500ml  Dung dịch đệm tra mẫu DNA (loading buffer) 5X: Tris HCl 1M pH= 8.0: 1ml EDTA 0.5M pH=8.0: 2ml Cấy chủng Bt đĩa môi trường MPA riêng rẽ, nuôi 28ºC sau ngày để thu sinh khối Sinh khối vi khuẩn xử lý 70ºC 10 phút, sau pha loãng đến nồng độ 10-8 lấy 100µl dịch nồng độ pha loãng 10-7 10-8 cấy thảm đĩa petri chứa môi trường MPA Nuôi 28ºC 24h, đếm Glycerol: 2ml số khuẩn lạc mọc đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ Số lượng bào tử Bromphenol blue 1%: 2ml tính theo công thức:  Gel điện di agarose 1%: agarose 1g, TAE 1X: 100ml 2.2 Xác định mật độ bào tử Bt Phƣơng pháp nghiên cứu CFU: số lượng bào tử ml dịch nuôi cấy 2.2.1 Phân loại chủng Bt phản ứng huyết Phương pháp phân loại Bt phản ứng huyết dựa đặc tính huyết học chủng Bt, nghĩa dựa kháng nguyên tiêm mao H tiến hành phản ứng ngưng kết tế bào sinh dưỡng với kháng huyết tương ứng Phương pháp cho phép xác định loài Bt, tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn chủng Bt có hoạt tính cao với côn trùng Các chủng Bt tham gia vào phản ứng ngưng kết huyết phải chủng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CFU = n a 10 http://www.lrc-tnu.edu.vn n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành 100µl dịch pha loãng a: nồng độ pha loãng 2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm Để đánh giá khả tiêu diệt côn trùng cánh vảy chủng nghiên cứu, tiến hành thử nghiệm đối tượng sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) sâu tơ (Plutella xylostella) theo phương pháp Thiery Frachon nồng độ 107 109 bào tử/ml sâu xanh da láng nồng độ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 105 107 bào tử/ml sâu tơ 105 Mỗi nồng độ thử nghiệm với đĩa petri - Đẩy nước lên tới 500µl đĩa 10 sâu tơ sâu sâu xanh da láng [34] - Bổ sung chloroform: isoamylalcohol (24:1); tỷ lệ 1: 1, đảo tay Chuẩn bị: - Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút, 4ºC, thu dịch Các chủng Bt cấy thảm môi trường MPA, nuôi 28 C 72 Sau đó, sinh khối thu vào ống eppendorf chứa 1ml nước cất vô trùng Pha loãng mật độ bào tử nồng độ 10 đến 10 bào tử/ml để thử hoạt tính Lá cải xanh bắp cải (không phun thuốc trừ sâu, không sâu - Bổ sung NaOAC/KOAC, tỷ lệ 1: 10 - Bổ sung cồn tuyệt đối, tỷ lệ 2,5: - Ủ -20ºC 4h - Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút 4ºC, thu tủa bệnh) rửa tráng qua nước cất, để khô tự nhiên, cắt với diện tích - Rửa tủa 200µl cồn 70º cho vừa đĩa petri Nhúng vừa cắt vào dịch Bt pha loãng để - Ly tâm 12000 vòng/phút 10 phút 4ºC, thu tủa 10 phút cho hai mặt ngấm hết dịch Bt, lấy để khô nhiệt độ phòng - Làm khô, hòa tủa 35µl dH2O Sau cho khô dịch vào đĩa petri, đĩa thử 10 sâu - Bảo quản - 20ºC xanh da láng Nuôi nhiệt độ phòng nơi thoáng mát theo dõi tỉ lệ sâu chết ngày 2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C PCR Phương pháp PCR Karl Mulis cộng phát năm 1985 Nhờ Tỉ lệ sâu chết tính theo công thức Abbott: enzym DNA polymerase xúc tác, mạch khuôn DNA tổng hợp nên A = (C – T)/C 100 mạch đơn Các mạch đơn tổng hợp lại sử dụng làm khuôn A: % sâu chết cho trình tổng hợp mạch chu kỳ Sự tổng hợp mạch đơn C: số sâu sống mẫu đối chứng DNA cần có tham gia DNA mồi tạo nhóm 3’-OH tự Các T: số sâu sống mẫu thí nghiệm nucleotide gắn vị trí nhóm OH tự tạo thành mạch đơn 2.2.4 Tách chiết DNA plasmid - Nuôi vi khuẩn môi trường MPB 28°C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm Thành phần phản ứng PCR: - Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút, thu cặn dNTPs - Bổ sung 150µl dung dịch sol I, vortex 2µl 2+ Đệm (có Mg ) 2µl - Bổ sung 150µl dung dịch sol III, lắc mạnh cho tủa hòa tan Mồi 1C F 1µl - Ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút, 4ºC, thu dịch Mồi 1R 1µl - Bổ sung 150µl dung dich sol II, đảo nhẹ tay - Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối Taq polymease 0,2µl - Ly tâm 10000 vòng/phút 10 phút, thu tủa DNA Temp 2µl - Làm khô tự nhiên dH2O 11,8µl - Hòa tủa 35µl RNase, ủ 37°C 1h Thể tích/phản ứng: 20µl - Tủa - 20°C Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Sản phẩm PCR kiểm tra phương pháp điện di gel agarose 1% - Ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút 4ºC, hòa tế bào 60µl CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glycerol 2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy Sản phẩm PCR gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối - Bảo quản tế bào - 80ºC + Biến nạp: - Lấy tế bào khả biến từ - 80ºC để vào đá 30 phút - Hút 5µl sản phẩm phản ứng nối ghép gene vào dung dịch tế bào khả T4- DNA ligase Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng: Đệm 5µl Vector 1µl T4-DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 3µl biến trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có nhiệt độ thấp định tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào cách đồng đều) - Sốc nhiệt 42ºC 60-90 giây sau giữ đá phút - Bổ sung 200-300µl môi trường LB lắc 37ºC, 200 vòng/phút 11,5 - Trải 150µl sản phẩm đĩa petri chứa môi trường LBA bổ sung ampicilin Phản ứng ghép nối tiến hành 14 - 16h 4ºC Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E coli DH5α + X- gal, nuôi 37ºC từ 14-16h Sàng lọc khuẩn lạc PCR colony  Nguyên tắc: Dưới tác dụng CaCl2 thành tế bào thời kỳ sinh trưởng Các thành phần PCR colony tương tự phản ứng khuếch đại gene cry1C trở nên xốp tạo điều kiện cho DNA chui qua lỗ màng vào tế bào chất với mồi đặc hiệu, khác chỗ khuôn DNA thay lượng nhỏ sốc nhiệt sinh khối từ khuẩn lạc trắng sử dụng cặp mồi M13  Quy trình gồm bước Tách DNA plasmid từ E coli DH5α + Chuẩn bị tế bào khả biến: - Nuôi cấy khuẩn lạc E coli DH5α môi trường LB lỏng qua đêm - Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB - Lắc 200 vòng/phút 2h 37ºC Đo OD600 đạt 0,5-0,6 hút lấy mẫu vào ống eppendorf đặt đá 1h Sau bước thao tác phải thực 4ºC Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng) cấy vào 2ml môi trường LB chứa ampicillin, lắc qua đêm 200 vòng/phút 37ºC Qui trình tách tương tự quy trình tách DNA plasmid Bt Xử lý DNA plasmid enzyme giới hạn EcoRI Để xác định xác vector tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn - Mẫu sau đặt đá 1h ly tâm 6000 vòng/phút 10 phút, loại dịch Hòa tế bào thu 1-1,5ml CaCl2 100mM vô trùng, vortex ly tâm thu tủa 6000 vòng/phút 10 phút hay không, cắt đoạn DNA ghép nối vào plasmid EcoRI Trình tự cắt EcoRI: - Hòa tan lại tủa 1,5ml CaCl2 100mM, vortex, ủ mẫu đá 2h, 15 phút đảo lần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai mang gene cry1C có hoạt tính diệt sâu xanh da láng sâu tơ Thành phần phản ứng cắt: Thành phần 3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể chủng Bt nghiên cứu Thể tích (µl) Từ 150 chủng vi sinh vật thu nhận sau ngày nuôi cấy 28 0C, đĩa thạch chứa môi trường MPA mọc lên nhiều loại khuẩn lạc B thurigiensis DNA plasmid 6µl Buffer 1µl EcoRI 0,5µl dH2O 2.5µl Tổng thể tích 10µl hình tròn, có màu trắng sữa mép nhăn không (Hình 3.1) Phản ứng cắt tiến hành 37ºC 4h 2.2.7 Xác định trình tự nucleotide Tiến hành theo phương pháp tổng hợp Sanger CS Thực phản ứng PCR thành phần thông thường bổ sung loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, dd TTP) đánh dấu thuốc nhuộm huỳnh quang [23] Điện di sản phẩm PCR gel polyacrylamide bổ sung urea để tăng độ phân giải gel Sử dụng tia lase quét phát dideoxynucleotide đánh dấu Xử lý kết phần mềm PC/GENE, sau so sánh trình tự gene Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc Bt môi trƣờng MPA sau nuôi 28ºC sau 72h (1: Khuẩn lạc Bt) Từ đĩa nuôi cấy tách lấy khuẩn lạc riêng rẽ làm tiêu với thuốc nhuộm fuchsin base sau quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000X (vật kính dầu) Kết cho thấy 150 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus thu thập, có 54 chủng sinh tinh thể Kết thể Hình 3.2, Bảng 3.1 tách dòng với trình tự công bố GenBank 2.3 Địa điểm thực đề tài Đề tài thực phòng Di truyền vi sinh vật, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện CNSH, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn dạng tinh thể thành phần protein cấu tạo tinh thể tạo nên Sự phong phú Bảng 3.1 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng Bt Hình dạng tinh thể STT Số chủng Tỷ lệ % hình dạng tinh thể sở tạo nên phổ diệt côn trùng rộng từ cánh vảy, hai cánh đến cánh cứng tới giun tròn thực vật Lưỡng tháp 21 39 Cầu gene cry1 có gene cry1C có khả mã hóa protein tinh thể hình Lưỡng tháp cầu 26 48 lưỡng tháp hình cầu có khả diệt côn trùng cánh vảy với hoạt lực cao Lập phương Cầu lập phương cánh vảy với sâu tơ Không xác định 3.1.2 Phân loại Bt huyết 54 100 Tổng số Theo nhiều tài liệu công bố, loài Bta mang nhiều gene họ Vì vậy, chủng Bt phân lập phân loại huyết để xác định loài chúng nhằm tìm chủng Bta thử hoạt tính diệt côn trùng Phân loại loài theo phương pháp phân loại huyết de Barjac Bonefoi chủng nghiên cứu Bt chia làm nhiều loài khác nhau, loài mang đặc điểm riêng biệt Dưới loài Bta có khả diệt côn trùng cánh vảy thuộc type huyết H7 Để tìm chủng Bta tiến hành sàng lọc chủng Bt phân lập cách sử dụng typ huyết H7 để phân loại Với 26 chủng nghiên cứu mang tinh thể hình lưỡng tháp hình cầu, xác định 10 chủng có phản ứng dương tính với typ huyết H7 chiếm 38% số chủng phân loại (Hình 3.3) Như bước đầu kết luận có 10 chủng nghiên cứu có khả Hình 3.2 Hình dạng bào tử tinh thể Bt phóng đại 1000 lần thuộc loài Bta dƣới kính hiển vi quang học (1: tinh thể, 2: bào tử) 54 chủng B thuringiensis sinh tổng hợp lọai protein tinh thể đa dạng Trong đó, protein tinh thể hình lưỡng tháp hình cầu chiếm tỷ lệ cao 48%, sau protein tinh thể lưỡng thấp chiếm 39% Các chủng sinh tinh thể hình cầu, lập phương đồng thời loại tinh thể chiếm tỷ lệ tương đối thấp, từ 2% đến 7% Điều thể tính đa dạng hình dạng tinh thể chủng B thuringiensis phân lập Sự khác cấu trúc hình Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hoạt tính chủng Bta diệt sâu xanh da láng sâu tơ  Hoạt tính diệt sâu da láng Bảy chủng Bta đươc pha loãng tới nồng độ 107 109 bào tử/ml nước cất vô trùng Tiến hành thử nghiệm đối tượng sâu xanh da láng theo công thức Abbott Tỷ lệ sâu chết tính sau ngày thử nghiệm Kết thử nghiệm trình bày Hình 3.4 Bảng 3.2 A B Hình 3.3 Sản phẩm ngƣng kết huyết chủng TN 6.12 phân lập với typ huyết dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần A: Trước nhỏ huyết miễn dịch B: Sau nhỏ huyết miễn dịch 3.1.3 Hoạt tính diệt chủng Bta sâu xanh da láng sâu tơ Hình 3.4 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta nghiên cứu Nồng độ bào tử Bảng 3.2 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta sau ngày thử nghiệm Bt giai đoạn tạo bào tử đồng thời sinh tổng hợp tinh thể độc Thông qua nồng độ bào tử gián tiếp ước lượng nồng độ tinh thể chủng nghiên cứu Do tiến hành xác định nồng độ bào tử STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%) nồng độ 10 bào tử/ml nồng độ 109 bào tử/ml chủng Bta nghiên cứu với chủng Bta chuẩn 4J4 làm đối chứng ĐC âm 0 dương ĐC dương (4J4) 33 78 Nồng độ bào tử chủng Bta dao động từ 2,5109 đến 5109 bào tử/ml TN 1.12 22 56 Chúng chọn chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12, TN 3.4 11 22 TN 28.6 TN 36.3 có nồng độ bào tử cao để xác định hoạt tính diệt côn TN 4.4 11 33 trùng thử nghiệm TN 5.3 11 44 TN 6.12 22 56 TN 28.6 22 67 TN 36.3 22 55 Sinh khối chủng Bta pha loãng nhiều lần, sử dụng nồng độ 105 107 bào tử/ml để thử hoạt tính diệt sâu tơ nồng độ 107 109 bào tử/ml diệt sâu xanh da láng Bảng 3.2 cho thấy chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da láng Sau ngày thử nghiệm, chủng TN1.12, TN6.12, TN28.6 TN 36.3 có hoạt tính Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn diệt sâu xanh da láng 50% nồng độ 109 bào tử/ml Các kết thử hoạt tính diệt sâu sở để tiến hành nghiên cứu  Qua kết thử hoạt tính chủng Bta diệt loại côn trùng thử nghiệm kết luận sau: - chủng Bta nghiên cứu có hoạt tính diệt loại côn trùng thử Hoạt tính diệt sâu tơ Với chủng Bta lựa chọn được, thử nghiệm diệt sâu tơ, tỷ lệ sâu chết theo dõi ngày tính toán theo công thức Abbott Kết thử nghiệm trình bày Hình 3.5 Bảng 3.3 nghiệm - Các chủng TN28.6,TN1.12, TN6.12, TN36.3 có hoạt tính diệt cao loại côn trùng thử nghiệm Các kết thử hoạt tính diệt sâu nói sở để tiến hành nghiên cứu gene mã hóa độc tố tinh thể 3.2 Tách dòng đọc trình tự đoạn gene cry1C 3.2.1 Khuếch đại gene cry1C chủng Bta PCR Nhóm gene cry1C mã hóa protein tinh thể có khả diệt côn trùng cánh vảy Để phát gene độc tố sử dụng phương pháp PCR nhằm khuếch đại đoạn gene cry1C chủng Bta có hoạt tính diệt sâu Hình 3.5 Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bta nghiên cứu với cặp mồi đặc hiệu Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm đoạn gene cry1C với cặp mồi đặc hiệu có kích thước 288 bp Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bt sau ngày thử nghiệm Tỷ lệ sâu chết (%) Tên chủng Ở nồng độ 105 Ở nồng độ 107 bào tử/ml bào tử/ml ĐC âm 0 ĐC dương (4J4) 77 93 TN 1.12 53 80 TN 3.4 63 83 TN 4.4 50 77 TN 5.3 53 80 TN 6.12 57 80 TN 28.6 60 87 TN 36.3 53 83 STT Bảng 3.3 cho thấy tất chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12, TN 28.6 TN 36.3 lựa chọn có hoạt tính diệt sâu tơ tương đối cao Sau ngày thử hoạt tính đa số chủng cho tỷ lệ sâu chết lớn 50%, hai nồng độ pha loãng Đặc biệt tất chủng trừ TN 4.4 thử Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% (Hình 3.6) Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng Bta nghiên cứu Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN 5.3, TN 6.12, TN 28.6, TN 36.3, ĐC dương M: DNA Marker nồng độ 107 bào tử/ml có tỷ lệ sâu chết lên tới 80% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.6 cho thấy sản phẩm PCR có băng với kích thước khoảng 300 bp Như chủng thuộc loài Bta nghiên cứu mang gene cry1C Để khẳng định chủng chắn mang gene cry1C hay không, chọn chủng TN 6.12 TN 28.6 để tách dòng đoạn gene cry1C xác định trình tự chúng 3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy Vector pGEM-T Easy tồn dạng mạch thẳng với đầu tự thừa Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất môi trƣờng LBA nucleotide T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A sau nuôi cấy qua đêm (1: Khuẩn lạc trắng, 2: khuẩn lạc xanh) sản phẩm PCR (Taq polymerase có hoạt tính gắn thêm adenine vào đầu 3’ Các dòng vi khuẩn mọc môi trường chứa ampicillin dòng kết thúc PCR) chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách biến nạp vector pGEM-T Easy có gene kháng kháng sinh dòng Đoạn gene tính toán theo lý thuyết 288 bp thu từ sản phẩm PCR Khuẩn lạc xanh xuất promoter lac - operon vectơ chủng TN 6.12 chủng TN 28.6 gắn trực tiếp vào vector pGEM-T pGEM-T Easy hoạt động bình thường nên β- galactosidase tổng Easy Sản phẩm vector tái tổ hợp pGEM-T Easy- cry1C-TN 6.12 pGEM- hợp có khả chuyển hóa X-gal từ không màu sang màu xanh chàm Khuẩn lạc trắng xuất hai nguyên nhân sau: nguyên nhân thứ T Easy-cry1C-TN 28.6 tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp mang đoạn DNA Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt trình bày phần phương pháp Sau biến nạp, chủng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM-T Easycry1C nuôi cấy môi trường LB + ampicillin + X-gal 37ºC qua đêm thấy xuất khuẩn lạc màu xanh trắng mặt thạch (Hình 3.7) chèn vào gene cấu trúc lacZ làm hỏng promoter gene lac-operon vector pGEM–T Easy nên trình sống không tạo β- galactosidase, khả chuyển hoá chất X- gal có môi trường nuôi cấy vi khuẩn mà màu xanh Nguyên nhân thứ hai promoter điều khiển hoạt động gene mã hoá cho β - galactosidase bị hỏng, dẫn đến không tổng hợp β- galactosidase mà vi khuẩn E coli không chuyển hoá X-gal có môi trường nên tạo thành khuẩn lạc màu trắng Để biết khuẩn lạc trắng có mang gene mong muốn hay không, kiểm tra cách cắt DNA plasmid tinh Các dòng khuẩn lạc trắng cấy vào môi trường LB bổ sung ampicillin nuôi lắc qua đêm để tách plasmid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Do có tới hai khả dẫn đến việc khuẩn lạc có màu trắng mà phải tiến hành PCR colony với mồi đặc hiệu vector M13 để chọn dòng để kiểm tra có mặt gene cry1C Sản phẩm cắt điện di gel agarose (Hình 3.9) khuẩn lạc mang vector có đoạn gene cry1C chèn vào Hình 3.9 Điện di đồ phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13 1, 3: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 –p3, TN 6.12 –p7 2: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc trắng TN 6.12 –p5 Giếng 1,3 Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy– cry1C – TN28.6- p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Giếng DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh (ĐC) M:Thanh DNA chuẩn M: Thang DNA chuẩn Điện di đồ sản phẩm PCR cho thấy DNA khuẩn lạc trắng TN 28.6 Kết cho thấy DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng sau –p3, TN 6.12–p7 có kích thước khoảng 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết cắt EcoRI tạo hai băng, băng lớn vectơ tách dòng pGEM-T Easy (là kích thước đoạn gene cry1C cộng với kích thước sản phẩm PCR có kích thước 3000 bp, băng nhỏ có kích thước gần 300 bp tương ứng với vector mồi M13) Trong khuẩn lạc trắng TN 6.12–p5 tổng hợp sản phẩm PCR đoạn gene cry1C Trong đó, plasmid khuẩn lạc đoạn gene có kích thước khoảng 300 bp (là kích thước sản phẩm PCR xanh sau phản ứng cắt cho băng có kích thước khoảng 3000 bp (tương vector mồi M13) Điều chứng tỏ khuẩn lạc trắng TN 28.6–p3 ứng với kích thước vector tách dòng) TN 6.12–p7 biến nạp vector mang gene cry1C Để xác định chắn có mặt gene cry1C khuẩn lạc Chúng lấy khuẩn lạc trắng sàng lọc PCR colony khuẩn lạc xanh chủng cấy vào lọ penicillin chứa 2ml môi trắng khuếch đại đoạn gene cry1C từ khuôn plasmid thu với cặp mồi đặc hiệu TYIC TYIUNI (Hình 3.10) trường LB bổ sung Amp (nồng độ 50 µg/ml) nuôi lắc 37 C qua đêm để tách plasmid DNA plasmid kiểm tra enzyme giới hạn Do vùng MCS (multi cloning site) vector pGEM–T Easy có chứa vị trí cắt EcoRI nằm đầu đoạn DNA insert nên cắt DNA plasmid enzyme Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Từ kết thu trên, bước đầu kết luận tách dòng thành công gene cry1C vector pGEM–T Easy Tuy nhiên để kết luận xác đoạn gene tách dòng có phải đoạn gene cry1C hay không tiến hành đọc trình tự đoạn gene so sánh với trình tự gene Gene Bank 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C Plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy–cry1 –TN28.6 - p3 pGEM-T Easycry1C–TN 6.12–p7 chọn để đọc trình tự so sánh với trình tự có mã số AF362020 Gene Bank Đoạn gene 288 bp chủng TN6.12 có độ tương đồng 100% so với trình tự gene cry1C chủng Bta C002 (AF362020) công bố Gene Bank Trong đó , trình tự đoạn gen e cry1C chủng TN 28.6 có độ tương đồng 99% so với chủng Bta C002 (AF362020) bị mấ t nucleotide ở vị trí 282 Trình tự AF362020 trình tự gene cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca Như kết luận, trình tự gene cry1C chủng tách dòng thuộc phân nhóm gene cry1Ca Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Tiếng Việt Từ 150 chủng Bacillus cereus chưa qua phân loại, xác định 54 Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, chủng B thuringiensis sinh tinh thể, 26/54 chủng sinh loại tinh thể trang 153 dạng lưỡng tháp cầu nhận dạng type huyết chuẩn Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý Trong có 10 chủng thuộc loài B thuringiensis subsp aizawai chiếm (1999), Thiết kế lại cấu trúc gene Bt để chuyển vào hai mầm, Báo cáo Hội tỷ lệ 38% nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376 chủng Bta có hoạt tính diệt sâu tơ sâu xanh da láng, chủng TN28.6, TN 1.12, TN6.12, TN 36.3 có hoạt tính diệt sâu cao Khuếch đại gene cry1C từ chủng Bta cho sản phẩm có hoạt tính diệt sâu với cặp mồi đặc hiệu có kích thước 288 kb Đoạn gene cry1C từ chủng TN 6.12 TN 28.6 tách dòng, đọc Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp đại cương tập 2, Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167 Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, trang 109-147 so sánh với trình tự gene cry1C chủng Bta có mã số AF362020 có độ Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận tương đồng 100% 99% Các gene tách dòng thuộc phân huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu Viện Công nhóm gene cry1Ca nghệ Sinh học 200-2001, trang 296-303 4.2 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh KIẾN NGHỊ Gene cry1C tách dòng từ chủng TN6.12 TN28.6 có hoạt tính diệt sâu cao, xác định đoạn gene cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca Trên sở đó, thiết kế vector biểu protein Cry1Ca nhằm nghiên cứu: sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt diệt côn trùng cánh vảy làm nguyên liệu chuyển gene cry1C vào trồng tạo khả kháng lại côn trùng cánh vảy Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn Hoài Trâm (2000), Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thuringiensis phân lập từ số tỉnh Việt Nam “Những vấn đề nghiên cứu sinh học” Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, trang 484488 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), Sự phân bố Bacillus thuringiensis mẫu đất Việt Nam, Tài nguyên sinh vật đất phát triển bền vững hệ sinh thái đất, trang 1-7 Ngô Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 10 Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, 17 Tang W, Chen H, Xu C, Li, X., Lin, Y., Zhang X (2007), “Development of Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến insect – resistant transgenic indica rice with a synthetis Cry1C (2010), “35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus Breed, 18, pp 1- 10 thuringiensis Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 288 – 300 11 Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngô Đình Bính * gene” Mol 18 Asano S., Yamashita C., Iizuka T., Takeuchi K.,Yamanaka S., Cerf D., and Yamamoto S.(2003), “A strain of Bacillus thurigiensis subsp galleriae contaning a novel cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea” Biological (2005), Nghiên cứu phân bố đa dạng gene vi khuẩn Bacillus Control 28, page 191-196 thuringiensis phân lập số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ, Tạp chí Di truyền 19 Lyon WaF Confused and red flour beetles-HYG-2087-97, page 38.Ohio ứng dụng, số 4, tr 29 – 34 State University Extention Fact Sheet 12 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hoài Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dòng biểu gene mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus 20 Crichmore N(2011), Bacillus thurigiensis Toxin Gene Nomenclature http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt,27/07/2012 thuringiensis subsp aizawai” , Những vấn đề nghiên cứu Khoa 21 Deacon J "The microbial world: Bacillus thuringiensis", học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, tr 830 – 832 www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 20/06/2012 13 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), “ Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT, tr 59 – 62 22 Promega (2010), Technical Manual: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems, Instructions for use of products A1360, A1380, A3600, A3610, USA 23 Sambrook J and Russell D.W.(2001), Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 24 Schnepf E, Crickmore N., Van Rie N., Lereclus D., Baum F., Feitelson J., Tiếng Anh Zeigler D.R., and Dean D.H.,(1998) “Bacillus thuringiensis and its pesticidal 14 Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD, Kahn TW, Sims LE (2002) crystal protein” Microbiol Mol Biol Rev 62: page 775-806 Genes encoding novel protein with pesticidal activity against coleopterans 25 Burges H D (2001), "Bacillus thuringiensis in Pest control", Pesticide 15 Wu, Cao XL, Bai YY, and Aronson AI (1991), “Sequensing of an operon Outlook, pp 90-98 containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis’’ FEMS 26 Nester E.W, Thomashow L S, Metz M and Gordon M (2002), 100 years Microbi Lett, page 31- 35 of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment, American Academy 16 Klier A (1985), “Biopesticide opportunities and challegene for anegement of Microbiology,Washington, USA insect Parteun International Symposia”, page 16 27 Theiry and E Franchon (1997), “Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bateria”, Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology, Edited by Lawrence A Lacey, Academic Press, pp 55 – 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 Wijnands L.M., Dufrene J.B., Van Leusden F.M (2002), Characterization of Bacillus Cereus RIVM report 250912002/2002, The National Institue for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands 29 Barjac D H (1981), “Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis”, page 36–42 30 Barjac D H and Bonnefoi A (1962), “Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B Bacillus thuringiensis.” Entomophaga 7, pp – 31 31 Li, Caroll J J., and Ellar D J (1991), "Crystal structure of insecticidal δ endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution", Nature 353, pp 815-821 32 Höfte H and Whiteley H R (1989) “Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis”, Microbio Rev, 53 (2), page 242-25 33 Metahelix Life Sciences Private Limited, Bio- Safety Evaluation of Cry1C Protein Expressed in Bt cotton carrying Cry1C genes, Review Committee on Genetic Modifications Department of Biotechnology MST, GOI New Delhi 110003 event MLS9124 34 Proceedings of the 2nd Canberra B thuringiensis meeting September, Lanberra, 1993 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... CS đã khảo nghiệm 5 loại thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô vàTrung Quốc đã cho kết quả rất khả quan Tuy nhiên, những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu tiên được Nguyễn Công Bình và CS thực hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại Viện Sinh vật nay là Viện Công nghệ sinh học Cho đến nay Bt đã được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều cơ sở tại Việt Nam như Viện Công nghiệp Thực phẩm, Viện Bảo vệ Thực... dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng Bt phân lập tại Việt Nam Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng gene và biểu hiện gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C, Cry1D diệt sâu khoang từ các chủng Bt subsp aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh Protein tái tổ tế bào phồng lên, bị phân hủy dẫn đến sâu chết [8, 26] hợp có hoạt tính diệt sâu cao hơn so với các chủng đối chứng [12] Ở Việt Nam, ...năng duy trì cấu trúc cơ bản của tấm 1 và 2 Vùng 2 là vùng không bền vững của độc tố [20] Vùng 3: chứa những tấm  dạng bánh kẹp Sandwich Vùng này chứa đầu nhóm carboxyl và có cấu trúc bền vững [8] Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21] 1.1.9 Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không... da láng (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) theo phương pháp của Thiery và Frachon ở nồng độ 107 và 109 bào tử/ml đối với sâu xanh da láng và nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 105 và 107 bào tử/ml đối với sâu tơ 105 Mỗi nồng độ thử nghiệm với 3 đĩa petri - Đẩy nước lên tới 500µl và mỗi đĩa 10 con sâu tơ và 3 con sâu đối với sâu xanh... Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến insect – resistant transgenic indica rice with a synthetis Cry1C (2010), “35 năm nghiên cứu và phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus Breed, 18, pp 1- 10 thuringiensis tại Việt Nam , Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tr 288 – 300 11 Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm... sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt diệt côn trùng bộ cánh vảy và làm nguyên liệu chuyển gene cry1C vào cây trồng tạo khả năng kháng lại côn trùng cánh vảy Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn Hoài Trâm (2000), Nghiên cứu sự phân bố và đa dạng sinh học của Bacillus thuringiensis phân lập từ một số tỉnh ở Việt Nam “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học” Báo cáo... PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối - Bảo quản tế bào ở - 80ºC + Biến nạp: - Lấy tế bào khả biến từ - 80ºC để vào đá 30 phút - Hút 5µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gene vào dung dịch tế bào khả T4- DNA ligase Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng: Đệm 5µl Vector 1µl T4-DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 3µl biến và trộn... http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 1 TÀI LIỆU THAM KHẢO KẾT LUẬN Tiếng Việt Từ 150 chủng Bacillus cereus chưa qua phân loại, đã xác định được 54 1 Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, chủng B thuringiensis sinh tinh thể, trong đó 26/54 chủng sinh 2 loại tinh thể trang 153 dạng lưỡng tháp và cầu và được nhận dạng bằng type huyết thanh chuẩn... đĩa petri Nhúng lá vừa cắt vào dịch Bt đã pha loãng và để - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, thu tủa 10 phút cho hai mặt lá được ngấm hết dịch Bt, lấy ra để khô ở nhiệt độ phòng - Làm khô, hòa tủa trong 35µl dH2O Sau đó cho lá đã khô dịch vào các đĩa petri, mỗi đĩa thử 10 con hoặc 3 con sâu - Bảo quản ở - 20ºC xanh da láng Nuôi ở nhiệt độ phòng và nơi thoáng mát và theo dõi tỉ lệ sâu chết... một bộ xương ngoài và tách ra thành ba phần : phần đầu, phần ngực, phần bụng Chúng có 3 cặp chân ở ngực, hai mắt kép lớn và một thuôn dài trên miệng được gọi là vòi Còn ấu trùng Dưới loài Bta Bta là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B thuringiensis, thuộc typ huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de Barjac, 1963 Trong số các chủng B thuringiensis phân lập ở Việt Nam thì có tới 15%