BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SỰ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - - Nguyễn Thị Lan Hương TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP HỒ CHÍ MINH CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Mã số: 604240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS.TRẦN THANH THỦY Tp.Hồ Chí Minh - 2009 Trang LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Thanh Thủy dìu dắt giúp đỡ từ thực luận văn tốt nghiệp đến thực luận văn thạc sĩ sinh học Cô có mặt bên cạnh, giúp đỡ em gặp khó khăn suốt trình nghiên cứu, thực luận văn Tôi xin ghi nhớ công ơn PGS.TS Lương Đức Phẩm tận tình hướng dẫn, bảo trình thực luận văn Tôi gửi lời cảm ơn đến thầy cô phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, trường Đại học Sư phạm tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành công viêc nghiên cứu thực luận văn Xin chân thành cảm ơn bạn học viên Cao học khóa 17 18 ngành Vi sinh vật học, trường Đại học Sư phạm TpHCM nhiệt tình giúp đỡ suốt trình nghiên cứu thực luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua TpHCM, tháng năm 2009 NGUYỄN THỊ LAN HƯƠNG Trang LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu luận văn trung thực thể qua kết thí nghiệm chưa công bố Tác giả luận văn Nguyễn Thị Lan Hương MỞ ĐẦU RNM Cần quần thể TV đa dạng sinh học Chiến tranh, bom đạn loại chất độc hóa học hủy hoại gần hoàn toàn khu rừng Từ năm 1978 đến nay, Thành ủy UBND Tp.HCM phục hồi thành công HST RNM đa dạng độc đáo Đồng thời, từ tạo nên địa điểm lý tưởng phục vụ cho nghiên cứu khoa học du lịch sinh thái Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ nơi lưu giữ nhiều nguồn gen SV quý hiếm, bền vững có khả chịu đựng điều kiện khắc nghiệt MT sống Trong đó, ĐV TV nghiên cứu thống kê chi tiết Riêng hệ VSV phong phú RNM Cần Giờ nhiều bí ẩn chưa khai thác mức Trong số VSV NS chiếm số lượng lớn, giữ vai trò quan trọng tuần hoàn vật chất lượng nhờ có hệ enzym phong phú cellulase, protease, amylase,… Nổi bật ứng dụng nhiều hệ enzym thủy phân NS amylase Loại enzym phân giải tinh bột mang lại vị cho thiên nhiên người nghiên cứu từ lâu, đến nhà khoa học biết rõ Hiện amylase hệ enzym quan trọng ngành công nghệ sinh học chúng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, công nghiệp lên men, công nghiệp dệt, Tiếp tực tìm hiểu, khám phá bí ẩn cấu trúc đặc tính amylase để nâng cao hiệu suất xúc tác chúng đề tài hấp dẫn nhiều nhà nghiên cứu Tuy vậy, nước ta chưa lưu ý nhiều đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chế phẩm amylase từ VSV NS Việc sản xuất amylase từ NS có nhiều ưu việt rút ngắn trình sản xuất, tận dụng nguồn nguyên liệu, phế phẩm nông nghiệp góp phần giảm ô nhiễm MT, enzym có hoạt tính cao giảm giá thành sản phẩm so với enzym có nguồn gốc từ TV ĐV Đặc biệt thu chủng NS có khả sinh amylase cao sinh trưởng điều kiện khắc nghiệt RNM Cần Giờ có ích bổ sung thêm chủng NS có đặc tính quý, đầy tiềm ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi Mặc dù vậy, việc nghiên cứu NS sinh amylase từ RNM chưa khai thác mức Trước thực tế này, nhằm đa dạng hóa nguồn thu nhận amylase từ NS, mong muốn thu nhận nguồn amylase mang đặc tính quý, tiến hành đề tài “Tuyển chọn khảo sát khả sinh amylase số chủng NS từ RNM Cần Giờ Tp.HCM” Mục đích đề tài Tuyển chọn chủng NS sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ Nhiệm vụ đề tài - Phân lập chủng NS thu nhận từ RNM Cần Giờ - Tuyển chọn số chủng NS có khả sinh amylase cao - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phân loại đến loài NS tuyển chọn - Khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh trưởng, tổng hợp amylase chủng NS chọn - Nghiên cứu số tính chất enzym thu - Khảo sát đặc tính sinh học khác - Thu nhận amylase bán tinh khiết so sánh với enzym thương mại thị trường Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Các chủng NS phân lập từ xã: Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp Bình Khánh RNM Cần Giờ, Tp.HCM - Đề tài tiến hành nghiên cứu PTN Vi sinh – Sinh hóa, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm Tp.HCM thời gian từ tháng năm 2008 đến tháng năm 2009 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vài nét khái quát RNM Cần Giờ RNM (Mangrove) thuật ngữ dùng để loài TV khu rừng có nhiều loài sống vùng giao thoa đất liền biển Chúng mọc tốt vùng khí hậu nóng ẩm [4] Theo GS Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM giới khoảng 16.670.000 ha, khu vực Châu Á chiếm diện tích lớn Theo số liệu Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn cho thấy, năm 1943 diện tích RNM Việt Nam 400.000 ha, đến năm 1996 giảm 290.000 279.000 vào năm 2006 Với diện tích RNM Việt Nam chiếm phần lớn khu vực RNM nguyên sinh tự nhiên không Đa số RNM rừng trồng (62%) lại rừng thứ sinh nghèo rừng tái sinh bãi bồi HST RNM phân bố dọc bờ biển Việt Nam thuộc 28 tỉnh thành phố, tập trung chủ yếu tỉnh đồng sông Cửu Long, bán đảo Cà Mau hai tỉnh phía Bắc Nam Định Thái Bình Các tỉnh đồng sông Cửu Long có diện tích RNM chưa đến 100.000 Riêng RNM Cần Giờ hay rừng Sác, sau nỗ lực khôi phục thành công, có diện tích rừng đất rừng 38.664 [74] Với diện tích đạt trên, với độ đa dạng sinh học bậc RNM Đông - Nam Á , RNM Cần Giờ Tổ chức Văn hóa, Khoa học Giáo dục LHQ (UNESCO) công nhận Khu dự trữ sinh giới từ tháng 1-2000 Đây Khu dự trữ sinh RNM nước ta xem “lá phổi” quan trọng Tp.HCM [69] Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ hình thành hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm cửa ngõ Đông Nam Tp.HCM: Về tọa độ địa lý: vĩ độ Bắc 10o22’ – 100o40’09”, kinh độ Đông 106046’ – 107°00’59” Về ranh giới, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam 35km, từ Đông sang Tây 30km Tổng diện tích Khu dự trữ sinh RNM Cần Giờ 75.740 ha, đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, vùng chuyển tiếp 29.880 [5] RNM Cần Giờ phát triển đầm mặn mới, phù sa sông mang đến lắng đọng tạo thành đất Đất tạo tổng hợp trình lắng tụ trầm tích đất sét, phèn hóa nhiễm mặn Cho đến lớp đất sâu chưa kết chặt nên khả tạo thành đất rắn chắc, có hàm lượng lưu huỳnh dạng khử cao lượng muối cao lợi cho nông nghiệp [21] Khí hậu nóng ẩm chịu chi phối quy luật gió mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng đến tháng 10, mùa khô từ tháng đến tháng Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400mm hàng năm Độ ẩm cao nơi khác khu vực Tp.HCM: mùa mưa 79 – 83%, mùa khô 74 – 77% Nhiệt độ trung bình 25,8oC, biên độ dao động nhiệt ngày từ đến 7oC Chế độ bán nhật triều không Độ mặn dao động 1,8 – 3% [5] RNM Cần Giờ có 150 loài TV, loài chủ yếu bần trắng, mấm trắng, quần hợp đước đôi - bần trắng xu ổi, trang, đưng v.v… loại nước lợ bần chua, quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ biển với loài ưu Halophyla sp., Halodule sp., Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp trồng lúa, khoai mỡ, loại đậu, dừa v.v…; vườn ăn trái Thảm TV MT sống cho nhiều loài ĐV, theo thống kê năm 1999 như: 700 loài ĐV thuỷ sinh không xương sống, loài lưõng thê, 31 loài bò sát, 137 loài cá, khoảng 130 loài chim nhiều ĐV có xương sống có sách đỏ Việt Nam Ngoài có 63 loài phiêu SV, 130 loài tảo [4] Tuy chưa có nhiều số liệu thống kê hệ NS RNM Cần Giờ, thấy loài TV ĐV nguồn thức ăn tốt cung cấp cho hệ NS RNM Cần Giờ NS mắt xích quan trọng chuỗi thức ăn, tác nhân phân giải chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho SV khác HST, nhân tố thiếu tham gia khép kín chu trình sinh địa hóa RNM Cần Giờ HST nằm lưu vực ven bờ có nhiều thành phần C phức tạp thủy triều đưa vào NS có khả sinh loại amylase, protease, cellulase, chitinase, phân hủy chất hữu để sử dụng đồng thời góp phần làm giảm ô nhiễm MT RNM Cần Giờ Đặc biệt nơi có nguồn tinh bột sẵn có cây, thân (nhất mục thân mục) nguyên liệu cho amylase phân giải tạo glucose cho hoạt động sống chúng Hình 1.1 Bản đồ tổng quan RNM Cần Giờ vị trí xã thu mẫu [65] Ký hiệu : vị trí thu mẫu Do đặc điểm trên, RNM Cần Giờ có vai trò “lá phổi xanh” làm giảm ô nhiễm MT, giảm nóng lên Trái đất ngăn ngừa tình trạng dâng lên nước biển RNM Cần Giờ “chiếc lọc sinh học” xử lý chất thải, xử lý chất dinh dưỡng từ đất liền giữ vai trò vùng đệm chống lại dòng chảy ô nhiễm đồng thời lọc thức ăn cho ĐV biển; giúp bảo vệ loài ĐV đất liền nước triều lên cao sóng lớn; bảo vệ bờ biển cửa sông tránh tình trạng tác hại xói lở bão, sóng hệ thống đê biển, giảm chi phí tu bổ đê điều hàng năm; nơi có lợi nhuận kinh tế cao, cung cấp nguồn hải sản phong phú để sử dụng nước xuất nguồn lợi khác từ rừng, RNM HST có suất sinh học cao HST, nơi hội tụ đa dạng SV biển đất liền Vì thế, PTN sống để nghiên cứu khả chịu đựng phục hồi tổ hợp gen, khả phát tán định cư dạng sống [74] 1.2 Sơ lược NS 1.2.1 Hình thái cấu trúc NS NS VSV có nhân chuẩn, dị dưỡng Sợi nấm có vách ngăn lớp nấm bậc cao Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes hay vách ngăn nấm bậc thấp Oomycetes Zygomycetes Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài tăng trưởng phân nhánh tạo hệ sợi nấm gọi khuẩn ty Hệ sợi nấm phát triển thành dạng KL khác tùy theo chất rắn, lỏng hay mềm KL NS phát triển từ bào tử có dạng tròn hay gần tròn Bề mặt KL mượt, nhung mịn, nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, có vết khía xuyên tâm, có rãnh hay lồi lõm không đều; mép KL trơn hay cưa tùy vào loại nấm khác [11, 13, 61, 78] Phần lớn sợi nấm có dạng suốt, số sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ Sắc tố số nấm tiết MT làm đổi màu khu vực có nấm phát triển Một số nấm tiết chất hữu tạo nên tinh thể bề mặt KL Vì bào tử nấm thường có màu nên KL thường có màu Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt KL…có ý nghĩa định việc định tên nấm [3, 61] NS sinh sản chủ yếu bào tử Bào tử NS hình thành theo kiểu vô tính hay hữu tính Bào tử vô tính gồm dạng bào tử trần hay bào tử kín, bào tử trần phổ biến Trong sinh sản hữu tính, NS có hình thức đẳng giao, dị giao tiếp hợp [11] NS ngày quan tâm nghiên cứu ngày sâu rộng chúng có khả sinh nhiều chất có hoạt tính sinh học cao ứng dụng rộng rãi đem lại nhiều nguồn lợi kinh tế cao tạo loại enzym, chất KS, axit hữu cơ, chất có khả phân giải nguồn cacbuahydro (ứng dụng xử lý ô nhiễm MT tràn dầu), Hình 1.2 Sự phát triển sợi nấm [61] Hình 1.3 KL chủng Penicillium [64] Hình 1.4 Một số dạng bào tử NS [68, 70, 79]  Khả sinh enzym ngoại bào Enzym sản xuất từ VSV ngày nhiều VSV nhóm đối tượng sử dụng nguồn sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp So với ĐV TV, việc thu nhận enzym từ VSV nói chung NS nói riêng có nhiều ưu điểm như: tốc độ sinh sản nhanh, enzym thu có hoạt tính cao, trình sinh trưởng phát triển tổng hợp enzym VSV hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài, nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzym theo quy mô công nghiệp rẻ tiền dễ kiếm (đây lợi quan trọng) VSV sinh tổng hợp lúc nhiều loại enzym khác Ngày nay, nhiều loại enzym ngoại bào NS nghiên cứu, sản xuất ứng dụng phổ biến như: amylase, protease, cellulase, pectinase, chitinase, [9, 25]  Khả sinh chất KS KS trường hợp riêng biệt tính đối kháng, tượng VSV với sản phẩm trao đổi chất có tác dụng kìm hãm ức chế phát triển VSV khác KS tạo từ VSV quan tâm ngày phát triển mạnh mẽ thời đại Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ lớn, đa số thuộc lớp Nấm bất toàn Các chất KS sử dụng chủ yếu y tế Penicillin, Cephaco-sporin-C, [11]  Khả sinh axit hữu chất kích thích sinh trưởng [19,73] Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu ngày nhiều thực phẩm, công nghiệp Một số axit hữu phổ biến sản xuất từ NS như: axít xitric từ Asp.niger; axít gluconic thu nhận từ Asp.niger Asp foetidus; axít lactic sản xuất từ Rhizopus oryzae (Mattey, 1992) Tại Nhật Bản, nhà khoa học tổng hợp chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng NS Furasium monoforme Furasium oxysporum Ngoài lên men sản xuất KS, enzym, axit hữu cơ, , Penicillium chrysogenum Asp niger tạo lượng lớn sản phẩm phụ lên men Khuẩn ty nấm không độc thành phần thức ăn lý tưởng có hàm lượng đạm thô cao (xấp xỉ 12% trọng lượng tươi) Khuẩn ty sử dụng thành phần thức ăn gia súc NS sử dụng làm giàu thêm đạm cho thức ăn gia súc, Tuy vậy, nhiều loài NS gây tác hại cho đời sống mọc nguyên vật liệu, đồ dùng, thực phẩm hư hỏng hay giảm chất lượng sản phẩm Một số NS tiết độc tố gây ung thư (Asp.flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan), gây bệnh cho người, ĐV TV, [56, 72, 73, 74] 1.2.2 Phân loại NS Hiện định tên khoảng 10.000 chi 70.000 loài số khoảng triệu đến 1,5 triệu loài nấm có tự nhiên Riêng loài nấm thuộc Nấm bất toàn nước ta phát 338 loài thuộc 306 chi khác (Bùi Xuân Đồng, 2004) Bảo tàng giống chuẩn VSV (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội hợp tác với Viện NITE Nhật Bản điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm Việt Nam có nhiều khả tìm thấy loài Về phân loại nấm, tồn hệ thống phân loại nấm không thống với nhau, chủ yếu hệ thống phân loại theo Ainsworth cộng (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1983), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996) Trong luận văn này, phân loại nấm dựa vào đặc điểm mô tả theo hệ thống phân loại Ainsworth cộng (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Lân Dũng (2006) [61] Ngày nay, với tiến khoa học kỹ thuật, để phân loại VSV nói chung, NS nói riêng, người ta thường dùng phương pháp nhân gen giải trình tự gen (PCR – Plymerase Chain Reaction) để thu kết nhanh xác Nguyên tắc phương pháp PCR khuếch đại trình tự lên nhiều lần cặp mồi chuyên biệt Phản ứng PCR chu kỳ nối tiếp nhau, chu kỳ gồm bước: - Bước (biến tính): dung dịch đầy đủ thành phần cho chép, DNA biến tính nhiệt độ cao Tmax phân tử, thường 94 – 95oC vòng 30 giây đến phút - Bước (lai): nhiệt độ hạ thấp để mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ dao động khoảng 40 – 70oC kéo dài 30 giây đến phút - Bước (tổng hợp): nhiệt độ nâng lên đến 72oC để DNA polymerase hoạt động tốt Thời gian giai đoạn phụ thuộc vào độ dài ngắn trình tự DNA, thường kéo dài khoảng 30 giây đến vài phút Sau đó, người ta tiến hành giải trình tự axit nucleic Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic dựa vào nguyên tắc - Nguyên tắc hóa học (Phương pháp Maxam Gilbert): dựa vào phản ứng thủy giải hóa học đặc hiệu phân tử DNA tạo thành tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nucleotid - Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger phương pháp cải biên) : dựa vào tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase Với việc tổng hợp thêm deoxynucleotid với deoxynucleotid thông thường Kết tổng hợp hình thành tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nucleotid Ở phương pháp, phân đoạn DNA phân tách qua điện di gel polyacrylamid Nếu sử dụng đánh dấu đồng vị phóng xạ kết trình tự cần xác định đọc phóng xạ ghi từ điện di [61] 1.2.3 Tình hình nghiên cứu NS sinh amylase Ở nước ta giới có nhiều công trình nghiên cứu NS sinh amylase đặt móng cho việc sản xuất chế phẩm enzym sở để ứng dụng vào đời sống Trên giới, thời gian gần có số công trình nghiên cứu amylase NS bật như: Từ năm 1990, Marianne Graber Didier Combes có công trình nghiên cứu “Kiểu hoạt động anpha-amylase từ chủng Asp.oryzae MT đậm đặc” [52] Trong công trình nghiên cứu năm 1997, P.Woloshuk nghiên cứu chất gây cảm ứng sinh tổng hợp aflatoxin từ hạt ngô bị xâm nhập tạo hoạt tính amylaza từ Asp flavus [56] Để tận dụng phế phẩm nông nghiệp sản xuất men phân giải tinh bột, Akpan M.o.Bankole A.M.Adesemowo, sử dụng Asp.niger công trình nghiên cứu năm 1999 [50] Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B N Okolo tiến hành tinh xác định số tính chất amylaza phân giải tinh bột sống từ Asp.carbonarius vào năm 2001 [55] Gần đây, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình nghiên cứu “Nghiên cứu alpha amylase ngoại bào chi Aspergillus”, (2008) Baldwin, Toby M, cho thấy liên quan việc sinh alpha amylase glucoamylase chi nấm [42] Tại Việt Nam, vào năm 1974, D.V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ Asp.niger L.V Chứ, Đ.T.T Thu nghiên cứu với đối tượng Asp.awamorii năm 1977 [14] Đến năm 1984, N.B.Ngà N.L.Dũng nghiên cứu chọn lọc chủng thuộc loài Asp.awamorii, Asp.niger Asp.oryzae có hoạt tính α – amylase glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn [14] Năm 1977, với đối tượng nghiên cứu Asp.niger, L.V.Nhương cộng thành công thu nhận sử dụng pectinase, amylase để xử lý dược liệu nguồn gốc TV [14] Nghiên cứu glucoamylase có công trình “Nghiên cứu chọn lọc chủng Asp.niger TH3 – 19K Nhật Bản có hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” D.V.Hợp cộng sự, năm 1993 [14] Asp.niger BS Đặng Văn Lợi, Lê Văn Hoàng đưa vào nghiên cứu nhằm tối ưu hoá trình sinh tổng hợp enzim amylase cellulase [23] Năm 1998, Hoàng Kim Anh, Ngô Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy có công trình “Thu nhận amylase từ nấm mốc Asp sp” [2] Nổi bật nghiên cứu gần nhà khoa học thuộc Viện Sinh học Nhiệt đới nghiên cứu sản xuất thành công hai loại thức ăn kích thích tăng trưởng cho vật nuôi (kể thuỷ sản) sản phẩm lên men từ bã sắn góp phần giải ô nhiễm MT Hai sản phẩm có tên gọi ProBio-S Bio-E (quá trình lên men tạo ba loại enzym α – amylase, glucoamylase cellulase) Kết thử nghiệm sơ 15-20 lợn tháng tuổi cho thấy sau ba tháng ăn hai chế phẩm trên, lợn tăng trọng nhanh 1,1-1,3kg so với đối chứng [14, 40] 1.3 Tinh bột hệ enzym amylase 1.3.1 Tinh bột Tinh bột gồm hai cấu tử amylose (chiếm 20 – 30%) amilopectin (chiếm khoảng 70 – 80%) Amylose có phân tử lượng thấp, phân bố phía bên hạt tinh bột, cấu trúc thẳng, phân tử glucose liên kết với liên kết α-1,4-glucoside, dài khoảng 300 – 1000 gốc glucose xoắn theo kiểu lò xo, vòng xoắn có khoảng gốc glucose Nhờ cấu trúc xoắn amylose kết hợp với nguyên tử khác, tạo màu xanh kết hợp với iod Nếu đun nóng liên kết hydro bị cắt đứt, chuỗi amylose duỗi thẳng iod tách khỏi amylose dung dịch màu xanh Amilopectin có gốc glucose gắn với không nhờ liên kết α-1,4glucoside mà nhờ liên kết α-1,6-glucoside, liên kết hình thành cấu trúc nhánh amilopectin Phân tử amilopectin chứa khoảng 200.000 đến 1.000.000 phân tử glucose, phân bố mặt hạt tinh bột Amilopectin hoà tan đun nóng tạo nên dung dịch có độ nhớt cao, amilopectin tạo màu đỏ với iod [7, 8, 29, 33] 1.3.2 Hệ enzym amylase Amylase tên gọi nhóm enzym có tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside polysaccharide (tinh bột) dextrin cuối Cơ chất tác dụng amylase tinh bột glycogen Sản phẩm tạo thành trình thủy phân glucose, maltose dextrin [8,11] Cơ chất chủ yếu amylase tinh bột Đây polysaccharide phổ biến TV, tích lũy nhiều hạt hòa thảo, củ, thân Tinh bột có vai trò dinh dưỡng đặc biệt lớn trình tiêu hóa chúng bị thủy phân thành đường glucose chất tạo nên nguồn lượng cho SV Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: a α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase enzym phân cắt liên kết α-1,4glucoside mạch amylose amilopectin cách ngẫu nhiên Đây enzym có TV, ĐV đặc biệt có nhiều VSV, thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose glucose Dưới tác động α – amylase, tinh bột khả tạo màu với iod độ nhớt tinh bột giảm nhanh Nếu thời gian tác dụng dài sản phẩm thủy phân amylose chứa 13% glucose 87% maltose, với amilopectin tạo thành maltose, maltotriose dextrin phân tử thấp 5-10% glucose Enzym không tác dụng tinh bột nguyên thủy thủy phân hồ tinh bột nhanh Một số đặc tính α – amylase: - Dễ tan nước, dung dịch muối, rượu loãng Phân tử lượng α – amylase giảm (14.000 – 15.000) canxi tăng theo nhiệt độ nuôi cấy VSV Nếu tách hoàn toàn canxi khỏi phân tử enzym α – amylase khả thủy phân chất canxi tham gia hình thành ổn định enzym Canxi có tác dụng đảm bảo α – amylase có độ bền cực lớn với tác động gây biến tính phân hủy protease [7, 29] - pH tối thích α – amylase từ NS 4,5 – 4,8 (hoạt động 4,5 – 5,8), từ đại mạch thóc mầm 5,3 (4,7 – 5,4), VK 5,8 – 6,0 (5,8 – 7,0) pH tối thích α – amylase từ Asp.oryzae 4,8 – 5,8 pH dextrin > maltose > lactose > glucose > saccharose > galactose > manose > arabinose - Đối với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltose > saccharose > glucose > lactose > arabinose > galactose > manose [31] Nồng độ nguồn C MT ảnh hưởng lớn đến tạo thành enzym Mỗi loài VSV tạo lượng amylase cao nồng độ hydratcacbon định Ví dụ MT Czapek, nồng độ tinh bột ảnh hưởng rõ rệt đến sinh tổng hợp enzym amylase Nồng độ tinh bột tối thích cho sinh tổng hợp α – amylase 6% , glucoamylase 3% Nguyên liệu sử dụng nuôi cấy NS thu amylase thường nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành loại hạt ngũ cốc khác Trong đó, cám gạo, cám mì sử dụng nhiều có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển Mặt khác tạo MT, chúng thường có tính chất vật lý thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển khối nguyên liệu [25] Bảng 1.1 Ảnh hưởng chất đến sinh tổng hợp α – amylase glucoamylase Asp.oryzae [25] Nguồn C Hoạt độ enzym (đv/100ml) α - amylase glucoamylase Tinh bột % Nguồn C Hoạt độ enzym (đv/100ml) α - amylase glucoamylase Bột 300 800 Ngô 250 760 220 800 Mì 250 760 110 800 Mì đen 300 770 70 710 Đậu nành Vết 810 Ngoài ra, để giảm giá thành sản phẩm ứng dụng sản xuất amylase cho chăn nuôi, người ta dùng khoai mì hay bã khoai mì chất cảm ứng rẻ tiền thường có sẵn thức ăn gia súc Ở nước ta, phụ phẩm nông nghiệp như: rơm, cám gạo, cám mì, bã khoai mì, trấu, có đến hàng 20 – 30 tấn/năm Đây nguồn thức ăn tốt cho chăn nuôi chất lên men rẻ tiền công nghệ lên men VSV [47,56]  Ảnh hưỏng nguồn N N cần cho hình thành axit amin để cấu tạo nên protein cấu trúc enzym Nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy N vô hay N hữu Việc chọn nguồn N bổ sung vào MT nuôi cấy cần thiết để bảo đảm hiệu suất sinh tổng hợp cao đồng thời có lợi mặt kinh tế Nguồn N vô thường dùng nitrat amon, nitrat natri (có hiệu loại khác) hay sulfat amon, urê, Nitrat natri nguồn dinh dưỡng N thường dùng để nuôi nhiều loại NS sinh amylase với hàm lượng 0,91% Các hợp chất N hữu nguyên liệu giàu đạm cao ngô, bột đậu tương, khô lạc, khô đâu, Ngoài ra, số axit amin thường bổ sung vào MT nuôi cấy VSV [7] Khi sử dụng nguồn N định cho vào MT nuôi cấy VSV kích thích tổng hợp amylase ức chế tổng hợp amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hóa, trình tổng hợp enzym chuyển theo hướng tích cực tổng hợp glucoamylase ức chế tổng hợp α – amylase Sự cân C N MT có ý nghĩa lớn sinh tổng hợp sinh khối VSV tạo thành amylase Khi MT có đủ lượng C N cần thiết tích lũy lượng amylase cực lớn Tỉ lượng tối ưu C N cho sinh tổng hợp amylase 10:1 đến 40:1 Trong MT Czapeck, tỉ lượng tinh bột NaNO3 tối ưu cho sinh tổng hợp amylase vào khoảng 18:1.[25]  Các nguồn dinh dưỡng khoáng Magie ảnh hưởng đến độ bền nhiệt enzym Thiếu MgSO4 ảnh hưởng xấu đến tổng hợp amylase NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967) Nồng độ tối ưu muối cho tổng hợp α – amylase glucoamylase 0,05% [...]... tổng hợp glucoamylase và ức chế tổng hợp α – amylase Sự cân bằng giữa C và N trong MT có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp sinh khối VSV và sự tạo thành amylase Khi MT có đủ lượng C và N cần thiết sẽ tích lũy được lượng amylase cực lớn Tỉ lượng tối ưu của C và N cho sinh tổng hợp amylase là 10:1 đến 40:1 Trong MT Czapeck, tỉ lượng giữa tinh bột và NaNO3 tối ưu cho sinh tổng hợp các amylase vào khoảng... ion Mn2+ và Fe2+ lại có tác dụng kích thích Sản phẩm của giai đoạn đường hóa chủ yếu tạo ra glucose Một số VSV có khả năng tổng hợp glucoamylase có ý nghĩa công nghiệp: nấm mốc Rhizopus, Asp.awamori, Asp.niger; nấm men Endomycopsis [25, 29] 1.3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của VSV a Giống VSV Giống VSV là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và lượng amylase. .. thành và lượng amylase Không phải tất cả các chủng VSV đều có khả năng tổng hợp amylase như nhau Các chủng cùng chi và thậm chí cùng loài vẫn rất khác nhau về lượng enzym tổng hợp được Vì thế, để thu được lượng amylase cao, công việc tuyển chọn chủng NS có khả năng sinh enzym này cao là điều quan trọng đầu tiên Ngoài ra chủng NS thu được cũng cần được bảo quản và nuôi cấy trong những điều kiện tốt nhất,... maltose, isomaltose và glucose Tuy nhiên, thông thường trong một thời gian ngắn (30 – 60 phút), α – amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp và một ít đường maltose Khả năng dextrin hóa cao của α – amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy người ta còn gọi loại amylase này là amylase dextrin hay amylase dịch hóa Những chủng VSV có khả năng tổng hợp α – amylase có ý nghĩa... mới từ Asp.carbonarius vào năm 2001 [55] Gần đây, tạp chí khoa học United States Patent Application có đăng công trình nghiên cứu “Nghiên cứu về alpha amylase ngoại bào của chi Aspergillus”, (2008) của Baldwin, Toby M, cho thấy sự liên quan giữa việc sinh alpha amylase và glucoamylase của chi nấm này [42] Tại Việt Nam, vào năm 1974, D.V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ Asp.niger và. .. rất nhiều các công trình nghiên cứu về NS sinh amylase đặt nền móng cho việc sản xuất chế phẩm enzym này và là cơ sở để ứng dụng vào đời sống Trên thế giới, trong thời gian gần đây có một số công trình nghiên cứu về amylase của NS khá nổi bật như: Từ năm 1990, Marianne Graber và Didier Combes đã có công trình nghiên cứu “Kiểu hoạt động của anpha -amylase từ chủng Asp.oryzae trong MT đậm đặc” [52] Trong... tối thích α – amylase từ NS là 4,5 – 4,8 (hoạt động 4,5 – 5,8), từ đại mạch và thóc mầm là 5,3 (4,7 – 5,4), và VK là 5,8 – 6,0 (5,8 – 7,0) pH tối thích của α – amylase từ Asp.oryzae là 4,8 – 5,8 pH