BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN =======***======= ĐẬU THỊ DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Buôn Ma Thuột, năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN =======***======= ĐẬU THỊ DUNG NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CELLULASE CỦA CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN ƯA NHIỆT THU THẬP TẠI BUÔN MA THUỘT Chuyên Ngành Sinh Học Thực Nghiệm Mã Số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn: TS.Võ Thị Phương Khanh Buôn Ma Thuột, năm 2010 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả enzyme cellulase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn cần giờ, Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường Đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh [2] Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học, tập : Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục, trang 45 – 94 [3] Nguyễn Thị Kim Cúc, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Lê Văn Nhương (1999), Phân lập ñịnh loại số tính chất chủng vi nấm, xạ khuẩn có tiềm ứng dụng quy trình xử lý vỏ cà phê , Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc; NXB KHKT; tr 206-213 [4] Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất enzyme cellulase số chủng vi sinh vật ưa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT; tr 790-796 [5] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, tập 2,3, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật [6] Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục [7] Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nhà xuất Khoa học kĩ thuật [8] Nguyễn Lân Dũng (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 2, NXB khoa học kỹ thuật [9] Lê Gia Hy, (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh ñạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ sinh học [10] Nguyễn Lan Hương, Lê Văn Nhương, Hoàng Đình Hoà (1999); Phân lập hoạt hóa vi sinh vật ưa nhiệt có hoạt tính cellulase cao ñể bổ sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT, tr 531-535 [11] Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hoà, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT; tr 177-182 [12] Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả sinh tổng hợp Cellulase Atinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT; tr 804- 809 [13] Nguyễn Đức Lượng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Một số tính chất enzyme cellulase xạ khuẩn Actinomyces griseus, Báo cáo khoa học Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc, NXB KHKT, tr 580-583 [14] Đinh Thị Kim Nhung (2005), Ảnh hưởng nguồn cacbon nitơ cho việc tạo thành xenlulase Acetobacter xylinum, Đại học Sư Phạm Hà Nội 2; Những vấn ñề nghiên cứu khoa học sống, NXB KHKT [15] Ngô Đại Nghiệp (2009), Giáo trình enzyme học, Trường Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh [16] Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng (1982), Enzyme vi sinh vật, Nxb KH&KT [17] Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội [18] Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh Viện Công Nghệ Sinh Học, Viện KH&CNVN Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính Viện Công Nghệ Môi Trường, Viện KH&CNVN (2005), Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp xenlulaza cao, Những vấn ñề nghiên cứu khoa học sống, NXB KHKT; tr 872-875 [19] Lương Đức Phẩm, Hồ Sường (1978), Vi sinh tổng hợp, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội [20] GS.TS Nguyễn Xuân Thành (2007), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Giáo dục [21] Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất giáo dục [22] Hồ Sĩ Tráng (2004), Cơ sở hoá học gỗ cellulose tập 1,2, NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội [23] Allister J Lyons, JR., and Thomas G Pridham (1965), Colorimetric Determination of Color of Aerial Mycelium of Streptomycetes, Journal of bacteriology, American Society for Microbiology, 89(1), pp 159-169 [24] Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology (1989), Vol [25] Becker, B., M.P Lechevalier and H.A.Lechevalier (1965), Chemical composition of cell wall preparations from Strains of various form – genera of aerobic Actinomyce, J.Appl Microbiol., 13, pp 236-243 [26] Eberhard Kuster (1972), Simple working key for the classification and identification of named taxe included in the International Stepmyces project, Inter.J Syst Bac., 3, pp.139-148 [27] Faiez Alani, William A Anderson, Murray Moo-Young (2007), New isolate of Streptomyces sp with novel thermoalkalotolerant cellulases, Biotechnol Lett DOI 10.1007/s10529-007-9500-9 Original research paper [28] Hung-Der Jang and Kuo-Shu Chen (2002), Production and characterization of thermostable cellulases from Streptomyces transformant T31, World Journal of Microbiology & Biotechnology 19: 263–268, 2003 Kluwer Academic Publishers Printed in the Netherlands [29] John G Holt, Noel R Krieg, Peter H A Sneath, James T Staley , Stanley T Wikkiams, 1994, Bergey’s Mannual of determinative bacteriology, Ninth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, p 605-703 [30] Lechevalier, M P and H.A.Lechevalier (1970) Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes, Int J System Bact., 20, pp 435-443 [31] Sherling, E.B and D.Gottlieb (1966), Methods for characterization of Streptomyces species, Intern J Syst Bact., 16(3), pp 313-340 [32] Thomas G Pridham (1965), Color and Streptomycetes - Report of an International Workshop on Determination of Color of Streptomycetes, Applied microbiology, American Society for Microbiology., 13(1), pp 43-61 TP.Hồ Chí Minh [33] Tresner, H.D., E.J.Buckus (1963), System of color wheels for Streptomyces taxonomy, Appl.Microbiol, 11, pp 335-338 [34] Waksman, S.A (1961), The Actinomycetes, vol.2 Classification, idetification and description of the genera and species, The Williams and Wilkins Co., Baltimore [35] Williams, S.T., M.Goodfellow, G.Alderson, E.M Wellington, P.H.A.Sneath and M.J Sackin (1983), Numerical classification of Streptomyces and related genera, J.Gen Microbiol., 129, pp.1743-1813 [36] Witt, D., W Liesack and E Stackebbandt (1989), Identification of Streptomyces by 16S RNA Sequences and oligonucleotide probes, Recent advances in microbial ecology, Tokyo, Japan Scientific Press [37] Witt, D and E Stackebbandt (1990), Unification of the genera Streptomyces and Streptoverticillium and amendation of Streptomyces Waksman and Henrici 1443, System.Appl Microbiol., 13, pp 361- 371 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đường chuẩn CMCase Nồng ñộ glucose (IU/ml) OD540nm 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.103 0.224 0.365 0.451 0.604 0.7 Đường chuẩn CMCase y = 1.2317x - 0.0066 R2 = 0.9789 O D 540n m 0.8 0.6 OD 540nm 0.4 Linear (OD 540nm) 0.2 0 0.2 0.4 0.6 Nồng ñộ glucose (mg/ml) 0.8 Phụ lục 2: Tương quan hàm lượng glucose(mg/ml) số OD540n.m Nồng ñộ glucose (IU/ml) 0.100 0.200 0.300 0.400 Chỉ số OD 0.103 0.106 0.100 0.224 0.226 0.222 0.368 0.363 0.364 0.551 Trung bình OD Sai số 0.103 0.00001 0.224 0.00029 0.365 0.0021 0.451 0.0114 0.604 0.0054 0.700 0.005 0.550 0.552 0.500 0.606 0.602 0.604 0.600 0.700 0.698 0.702 Phụ lục 3: Đường kính vòng phân giải nồng ñộ ñường khử môi trường nuôi cấy 12 chủng phân lập ñược STT Chủng 10 11 12 C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 Chỉ số OD 540n.m 0.718 0.695 0.702 0.744 0.924 0.903 0.876 0.996 0.987 0.826 0.741 0.891 0.785 0.775 0.750 1.124 1.193 1.081 1.060 1.046 1.090 0.705 0.624 0.684 0.905 0.980 0.960 0.692 0.622 0.602 0.576 0.656 0.568 0.545 0.525 0.616 Trung bình OD Nồng ñộ ñường khử(IU/ml) 0.705 0.579 0.857 0.702 0.953 0.780 0.819 0.672 0.770 0.632 1.132 0.926 1.065 0.871 0.671 0.551 0.948 0.776 0.638 0.525 0.601 0.495 0.562 0.463 Đường kính vòng thủy phân (mm) 32.0 29.0 26.0 33.0 30.0 30.0 30.0 28.0 29.0 31.0 28.0 30.0 37.0 30.0 25.0 32.0 31.0 30.0 35.0 36.0 31.0 18.0 23.0 22.0 20.0 22.0 20.0 28.0 30.0 25.0 29.0 25.0 20.0 20.0 18.0 20.0 Mức ñộ phân giải Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Mạnh Khá Khá Mạnh Mạnh Mạnh Phụ lục 4: Khả chịu nhiệt chủng xạ khuẩn Chủng Nhiệt ñộ 450C 500C A2 550C 600C 650C 450C 500C C2 550C 600C 650C 450C 500C C3 550C 600C Chỉ số OD 540n.m 0.858 0.910 0.920 0.775 0.826 0.756 0.536 0.436 0.551 0.379 0.324 0.327 0.392 0.445 0.438 0.750 0.706 0.739 0.920 0.786 0.776 0.773 0.758 0.782 0.611 0.478 0.531 0.781 0.753 0.774 0.903 0.740 0.757 0.756 0.749 0.805 0.532 0.556 0.536 0.365 0.381 0.290 Trung bình Sai số Nồng ñộ ñường khử(IU/ml) 0.890 0.00110 0.729 0.786 0.00131 0.645 0.508 0.00390 0.419 0.343 0.00100 0.285 0.425 0.00080 0.352 0.731 0.00052 0.600 0.827 0.00647 0.678 0.771 0.00015 0.633 0.540 0.00448 0.445 0.769 0.00021 0.631 0.800 0.00803 0.656 0.770 0.00093 0.632 0.541 0.00017 0.446 0.345 0.00236 0.287 650C 450C 500C C4 550C 600C 650C 450C 500C C6 550C 600C 650C 450C 500C C7 550C 600C 0.344 0.407 0.365 0.935 0.841 0.899 0.803 0.861 0.928 0.715 0.592 0.653 0.541 0.519 0.560 0.601 0.543 0.628 1.231 1.208 1.175 1.029 1.064 1.022 0.928 1.004 0.822 0.389 0.342 0.330 0.449 0.427 0.449 1.001 1.018 0.903 0.729 0.673 0.676 0.494 0.553 0.542 0.332 0.316 0.329 0.372 0.00102 0.309 0.892 0.00225 0.731 0.850 0.00391 0.697 0.653 0.00378 0.537 0.540 0.00042 0.445 0.02383 0.486 1.205 0.00079 0.985 1.038 0.00051 0.849 0.918 0.00836 0.752 0.354 0.00097 0.294 0.442 0.00016 0.365 0.974 0.00385 0.797 0.693 0.00099 0.569 0.530 0.00098 0.437 0.326 0.00001 0.271 0.590 650C 450C 500C Ctm 550C 600C 650C 0.319 0.328 0.316 0.768 0.689 0.749 0.817 0.906 0.860 0.630 0.690 0.711 0.548 0.519 0.437 0.290 0.318 0.329 0.321 0.00002 0.267 0.735 0.00170 0.603 0.861 000198 0.706 0.677 0.00177 0.556 0.501 0.00331 0.413 0.312 0.00040 0.200 Phụ lục pH thích hợp ñến hoạt tính enzyme cellulase chủng xạ khuẩn Chủng pH 55 60 65 A2 70 75 80 55 60 65 C2 70 75 80 Chỉ số OD 540n.m 0.470 0.381 0.425 0.440 0.362 0.422 0.300 0.318 0.286 0.178 0.217 0.198 0.322 0.296 0.337 0.176 0.149 0.219 0.390 0.339 0.376 0.430 0.360 0.420 0.263 0.259 0.228 0.357 0.257 0.328 0.361 0.292 0.372 0.143 0.134 0.134 Sai số Trung bình Nồng ñộ ñường khử (IU/ml) 0.00198 0.425 0.352 0.00167 0.408 0.338 0.00016 0.310 0.258 0.00038 0.198 0.167 0.00043 0.318 0.265 0.00125 0.181 0.154 0.00069 0.368 0.305 0.00143 0.403 0.334 0.00037 0.250 0.210 0.00265 0.314 0.262 0.00188 0.342 0.284 0.00001 0.137 0.118 55 60 65 C3 70 75 80 55 60 65 C4 70 75 80 0.417 0.305 0.435 0.326 0.301 0.421 0.336 0.304 0.524 0.345 0.379 0.330 0.406 0.352 0.441 0.302 0.276 0.301 0.360 0.232 0.446 0.334 0.318 0.360 0.362 0.319 0.383 0.278 0.285 0.282 0.298 0.345 0.332 0.232 0.170 0.202 0.00496 0.404 0.335 0.00401 0.349 0.290 0.01413 0.388 0.322 0.00063 0.351 0.292 0.00201 0.400 0.331 0.00022 0.293 0.244 0.01160 0.346 0.288 0.00045 0.337 0.280 0.00106 0.355 0.295 0.00001 0.282 0.236 0.00059 0.325 0.270 0.00096 0.201 0.170 55 60 65 C6 70 75 80 55 60 65 C7 70 75 80 0.365 0.479 0.360 0.426 0.454 0.416 0.500 0.546 0.521 0.586 0.441 0.480 0.577 0.576 0.501 0.557 0.432 0.531 0.252 0.284 0.307 0.328 0.412 0.380 0.438 0.428 0.439 0.454 0.431 0.461 0.413 0.343 0.490 0.412 0.399 0.511 0.00453 0.401 0.332 0.00039 0.432 0.357 0.00053 0.522 0.430 0.00190 0.502 0.141 0.00435 0.551 0.454 0.00076 0.507 0.418 0.00180 0.281 0.235 0.00001 0.373 0.309 0.00025 0.435 0.360 0.00544 0.449 0.371 0.00375 0.415 0.344 0.00113 0.441 0.365 55 60 65 Ctm 70 75 80 0.253 0.186 0.224 0.262 0.328 0.319 0.319 0.259 0.280 0.345 0.317 0.361 0.292 0.309 0.325 0.278 0.317 0.237 0.00001 0.221 0.186 0.00128 0.303 0.253 0.00093 0.286 0.239 0.00050 0.341 0.283 0.00027 0.309 0.257 0.00160 0.277 0.231 Phụ lục 6: Ảnh hưởng tỉ lệ ñường bổ sung ñến tốc ñộ sinh trưởng khả phân giải cellulose chủng xạ khuẩn tuyển chọn Ký hiệu chủng A2 C2 C3 C4 C6 C7 Tỷ lệ ñường bổ sung (%) 0% 0.05%G 0.1%G 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G Đường kính vòng thủy phân (mm) 28.7 29.0 29.7 32.7 29.0 30.7 28.7 34.3 33.0 34.2 30.1 29.7 28.0 30.8 34.5 32.0 31.3 34.8 36.7 30.7 33.5 34.5 31.7 32.7 33.5 32.7 32.5 31.0 28.0 27.2 29.7 29.5 27.3 31.0 31.7 27.3 25.7 26.7 27.7 Tốc ñộ sinh trưởng sau ngày nuôi cấy (lần) 6.519 2.359 6.522 3.508 4.931 2.279 2.757 2.082 5.349 12.633 2.531 2.592 3.598 2.854 2.062 3.653 2.719 7.385 1.986 3.974 3.812 5.400 4.169 5.016 3.312 4.262 2.160 2.088 1.037 3.712 3.068 6.316 2.465 2.653 2.438 2.720 4.541 2.333 3.010 Ctm 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 27.7 27.5 29.2 34,3 34.0 21.3 20.6 24.3 17.6 16.8 1.159 1.796 5.879 17,000 3.310 2.267 3.673 2.308 3.766 6.579 Phụ lục Bảng phân tích ảnh hưởng nhiệt ñộ Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY 45 50 55 60 65 Total 2.688 0.896 0.001108 2.357 0.785667 0.00131 1.523 0.507667 0.003908 1.03 0.343333 0.000956 1.275 0.425 0.000829 15 8.873 0.591533 0.04975 2.195 0.731667 0.000524 2.482 0.827333 0.006465 2.313 0.771 0.000147 1.62 0.54 0.004483 2.308 0.769333 0.000212 15 10.918 0.727867 0.012144 2.4 0.8 0.008029 2.31 0.77 0.000931 1.624 0.541333 0.000165 1.036 0.345333 0.00236 1.116 0.372 0.001029 15 8.486 0.565733 0.041068 2.675 0.891667 0.002249 2.592 0.864 0.003913 1.96 0.653333 0.003782 1.62 0.54 0.000421 1.772 0.590667 0.001886 15 10.619 0.707933 0.023832 3.614 1.204667 0.000792 3.115 1.038333 0.000506 2.754 0.918 0.008356 1.061 0.353667 0.000972 1.325 0.441667 0.000161 15 11.869 0.791267 0.121909 2.922 0.974 0.003853 2.078 0.692667 0.000992 1.589 0.529667 0.000984 0.977 0.325667 7.23E-05 0.963 0.321 3.9E-05 15 8.529 0.5686 0.065473 2.206 0.735333 0.0017 2.583 0.861 0.001981 2.031 0.677 0.001767 1.504 0.501333 0.003314 0.937 0.312333 0.000404 15 9.261 0.6174 0.040596 A2 Count Sum Average Variance C2 Count Sum Average Variance C3 Count Sum Average Variance C4 Count Sum Average Variance C6 Count Sum Average Variance C7 Count Sum Average Variance Ctm Count Sum Average Variance Total Count Sum Average Variance 21 18.7 0.890476 0.026306 21 17.517 0.834143 0.012085 21 13.794 0.656857 0.021925 21 8.848 0.421333 0.010281 21 9.696 0.461714 0.024932 ANOVA Source of Variation Sample Columns Interaction Within SS 0.71287 3.769126 1.056476 0.141214 df MS 0.118812 0.942281 0.04402 0.002017 F 58.89509 467.0904 21.82069 P-value 2.06E-25 1.15E-49 1.12E-23 Total 5.679685 24 70 104 F crit 2.231192 2.502656 1.673829 [...]... 0.00001 0.221 0.186 0.00128 0.303 0.253 0.00093 0.286 0.239 0.00050 0.341 0.283 0.00027 0.309 0.257 0.00160 0.277 0.231 Phụ lục 6: Ảnh hưởng của tỉ lệ ñường bổ sung ñến tốc ñộ sinh trưởng và khả năng phân giải cellulose của các chủng xạ khuẩn tuyển chọn Ký hiệu chủng A2 C2 C3 C4 C6 C7 Tỷ lệ ñường bổ sung (%) 0% 0.05%G 0.1%G 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G: 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 0% 0.05%G:... 0.548 0.519 0.437 0.290 0.318 0.329 0.321 0.00002 0.267 0.735 0.00170 0.603 0.861 000198 0.706 0.677 0.00177 0.556 0.501 0.00331 0.413 0.312 0.00040 0.200 Phụ lục 5 pH thích hợp ñến hoạt tính enzyme cellulase của các chủng xạ khuẩn Chủng pH 55 60 65 A2 70 75 80 55 60 65 C2 70 75 80 Chỉ số OD 540n.m 0.470 0.381 0.425 0.440 0.362 0.422 0.300 0.318 0.286 0.178 0.217 0.198 0.322 0.296 0.337 0.176 0.149 0.219... 0.1%G: 0.15%G 0.05%S 0.1%S 0.15%S 27.7 27.5 29.2 34,3 34.0 21.3 20.6 24.3 17.6 16.8 1.159 1.796 5.879 17,000 3.310 2.267 3.673 2.308 3.766 6.579 Phụ lục 7 Bảng phân tích ảnh hưởng của nhiệt ñộ Anova: Two-Factor With Replication SUMMARY 45 50 55 60 65 Total 3 2.688 0.896 0.001108 3 2.357 0.785667 0.00131 3 1.523 0.507667 0.003908 3 1.03 0.343333 0.000956 3 1.275 0.425 0.000829 15 8.873 0.591533 0.04975 3... 28.7 29.0 29.7 32.7 29.0 30.7 28.7 34.3 33.0 34.2 30.1 29.7 28.0 30.8 34.5 32.0 31.3 34.8 36.7 30.7 33.5 34.5 31.7 32.7 33.5 32.7 32.5 31.0 28.0 27.2 29.7 29.5 27.3 31.0 31.7 27.3 25.7 26.7 27.7 Tốc ñộ sinh trưởng sau 5 ngày nuôi cấy (lần) 6.519 2.359 6.522 3.508 4.931 2.279 2.757 2.082 5.349 12.633 2.531 2.592 3.598 2.854 2.062 3.653 2.719 7.385 1.986 3.974 3.812 5.400 4.169 5.016 3.312 4.262 2.160