Khóa luận tốt nghiệp Khoa Công Nghệ Sinh Học VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENDOGLUCANASE TỪ HỆ VI SINH VẬT RUỘT MỐICOPTOTERMES GESTROI TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIACOLIBL21(DE3) Hà Nội - 2016 Người hướng dẫn : TS Đỗ Thị Huyền Sinh viên thực : Nguyễn Thành Duy Lớp : K19-1203 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS Trương Nam Hảivà TS Đỗ Thị Huyền Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền,Viện Công nghệ sinh học,Viện Hàn lâmKhoa học Công nghệ Việt Nam thu nhận hướng dẫn, quan tâm nhiệt tình tạo điều kiện cho em nghiên cứu trang thiết bị máy móc để em hoàn thành luận văn Luận văn thực phòng Kỹ Thuật Di truyền, phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện khoa học Công nghệ Việt Nam, với giúp đỡ NCS ThS Nguyễn Thị Thảo Anh (Chị) phòng Kỹ thuật di truyền Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới thầy cô môn khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội giảng dạy bảo cho em kiến thức chuyên môn kỹ cần thiết Cuối em xin chân thành cảm ơn người thân gia đình bạn bè tạo điều kiện ủng hộ em suốt thời gian học tập Hà nội, ngày tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thành Duy SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENDO-BETA-1,4–GLUCANASE 1.1.1 Sinh vật sản xuất endoglucanase 1.1.2.Cấu trúc chế xúc tác endo-beta-1,4-glucanase 1.1.3.Ứng dụng endoglucanase 1.2 BIỂU HIỆN GEN ENDOGLUCANASE TRONG E COLI 1.2.1 Hệ biểu E coli 1.2.2 Chủng biểu E.coli BL21 10 1.3.3 Vector biểu pET22b(+) 10 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13 NGUYÊN LIỆU 13 2.1.1 Chủng vi sinh vật plasmid 13 2.1.2 Hóa chất, enzyme, máy móc thiết bị 13 2.1.3 Dung dịch môi trường nuôi cấy 14 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) 16 2.2.2 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose QIAquick Gel Extration kit 18 2.2.3 Điện di ADN gel agarose 18 2.2.4 Biến nạp gen vào tế bào E coli DH10b phương pháp sốc nhiệt 19 2.2.5 Tách chiết ADN plasmid từ tế bào E coli 21 2.2.6 Xử lý ADN enzyme hạn chế 22 2.2.7 Phản ứng ghép nối gen 22 2.2.9 Điện di protein gel polyacrylamide-SDS 23 SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 2.2.10 Điện di protein gel polyacrylamide không SDS dùng xác định hoạt tính zymography 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Thiết kế vector biểu pET22-egc 26 3.1.1 Khuếch đại gen egc 27 3.1.2 Cắt sản phẩm PCR gen egc pET22b(+) NcoI+XhoI 28 3.1.3 Nối ghép gen egc vào vector biêu pET22b+ 29 3.1.4 Tách chiết DNA plasmid pET22-egc tế bào E coli DH10b 29 3.1.5 Kiểm tra có mặt gen egc vector tái tổ hợp pET22-egc 30 3.2 Biểu gen egc chủng E coli BL21 (DE3) 32 3.3.1 Nhiệt độ………………………………………………………………………… .34 3.3.2 Nồng độ chất cảm ứng IPTG……………………………………………………….37 3.4 KIỂM TRA HOẠT TÍNH CỦA ENDOGLUCANASE 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 Tài liệu tham khảo 43 SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Amp bp CMC DNA EDTA E coli Egc Tên tiếng anh Ampicilin Base pair Cacboxymethylcellulose Deoxyribonucleic acid Ethylene diamine tetraacetic acid Escherichia coli Endoglucanase gene EtBr IPTG Kb kDa LB LBA Ethidium bromide Isopropy beta - D-1 thiogalactopyranoside Kilo base Kilo Dalton Luria and bertani Luria-bertani ampicilin M OD Marker Optical density Tên tiếng việt Ampicilin Cặp bazơ Cơ chất cacboxymethyl cellulose Axit deoxyribonucleic Axit ethylene diamine tetraacetic Escherichia coli Gen mã hóa endoglucanase ruột mốiCoptotermes gestroi Ethidium bromide Chất cảm ứng Isopropy beta - D1 thiogalactopyranoside Kilo base Đơn vị đo khối lượng protein Môi trường LB Môi trường LB có bổ sung ampicillin Thang chuẩn Mật độ quang học ORF Open reading frame Khung đọc mở PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi rRNA Ribosome ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulfate Axit ribonucleic mã hóa ribosome Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE TAE SDS - Polyacrylamide Gel Electrophoresis Tris – acetat – EDTA Tris – acetat – EDTA TE Tris-EDTA Tris-EDTA TEDMED Tetramethylethylenediamine Tetramethylethylenediamine w/v Weight/volume Trọng lượng/thể tích SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Điện di gel polyacrylamide Page DANH MỤC HÌNH Hình 1 Cấu trúc không gian Cel5 (Endoglucanase Z) Hình Cấu trúc mô hình xúc tác cellulase nói chung endoglucanase nói riêng22 Hình Vector pET22b(+) 28 12 Hình Sơ đồ thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen egc 26 Hình Điện di đồ sản phẩm PCR gen egc gel agarose 0,8% 27 Hình 3 Điện di đồ sản phẩm tinh sản phẩm PCR vector pET22b(+) cắt NcoI+XhoI trước lai thành vector pET22-egc 28 Hình Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid pET22-egc 30 Hình Điện di đồ sản phẩm cắt dòng pET22-egc tái tổ hợp cặp enzyme hạn chế NcoI XhoI gel agarose 0,8% 31 Hình Điện di đồ protein tổng số thể biến nạp E coli BL21(DE3) mang gen egc gel polyacrylamide 12,6% 33 Hình Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra protein pha tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) biểu chủng E coli BL1(DE3) mang gen egc 34 Hình Điện di đồ SDS-PGE kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) biểu nhiệt độ khác chủng E coli BL21(DE3) tế bào phá hạt thủy tinh 36 Hình Điện di đồ kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) biểu nhiệt độ khác chủng E coli BL21(DE3) phá tế bào siêu âm 37 Hình 10 Đồ thị thể giá trị OD600 thời điểm thu mẫu tế bào cảm ứng nồng độ IPTG khác nhau…………………………………………38 Hình 11 Điện di đồ protein tổng số biểu tế bào E coli BL21(DE3) mang gen egc nồng độ IPTG khác gel polyacrylamide 12,6 % có SDS 39 Hình 12 Điện di đồ kiểm tra protein pha tan biểu tế bào E coli BL21(DE3) nồng độ IPTG khác gel polyacrylamide 12,6 % có SDS 40 Hình 13 Điện di đồ kiểm tra hoạt tính protein tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) gel polyacrylamide % không biến tính kết hợp đệm biến tính mẫu nhuộm coomassie 41 SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page DANH MỤC BẢNG Bảng Thành phần điện di protein 16 Bảng Thành phần PCR 17 Bảng Thành phần cắt DNA plasmid enzyme hạn chế 22 Bảng Thành phần phản ứng nối ghép gen 23 SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page MỞ ĐẦU Endoglucanase ba loại enzyme quan trọng phân hủy cellulose Chúng phân cắt liên kết β-1,4-glycoside bên chuỗi polysaccharide dài vùng cellulose tinh thể vô định hình để tạo thành đoạn oligosaccharide kích thước ngắn có đầu tự Các đoạn oligosaccharide ngắn chất cho cellulase khác exoglucanase, beta glucosidase phân cắt tạo đường glucose dùng cho lên men sản xuất sản phẩm có giá trị, điển hình cồn sinh học Việt Nam nước nông nghiệp năm lượng phế thải lignocellulose rơm rạ, bã mía tạo với hàm lượng lớn (khoảng 40-50 tấn/năm) Ước tính lúa có – 1,2 rơm rạ1 Lượng phế thải thường đốt bỏ gây ô nhiễm không khí ảnh hưởng nghiêm trọng đến tầng ozon gây hiệu ứng nhà kính Thay đốt hay bỏ nguồn nguyên liệu phong phú cho trình lên men sinh khối cellulose tạo thành ethanol Tuy nhiên, việc sản xuất ethanol từ sinh khối gặp nhiều khó khăn giá thành enzyme chuyển hóa lignocellulose cao nên cồn sinh học chưa cạnh tranh thị trường Đây nguyên nhân dẫn đến việc sử dụng nhiên liệu sinh học chưa phổ biến Một chiến lược quan trọng để giảm giá thành nhiên liệu sinh học để đưa vào thực tiễn làm giảm giá thành enzyme thủy phân lignocellulose Vì vậy, năm qua giới có nhiều công trình nghiên cứu khai thác tìm enzyme cellulase có hoạt tính mạnh, tốc độ chuyển hóa nhanh cellulose thành đường đơn dùng cho lên men tạo ethanol sản phẩm có giá trị Các hướng nghiên cứu bao gồm tìm kiếm enzyme mới, gây đột biến định hướng làm tăng hoạt tính enzyme Ngày nay, dựa thành tựu giải trình tự gen nên DNA đa hệ gen SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page quần thể vi sinh vật môi trường sinh thái giải trình tự dễ dàng để khai thác gen từ vi sinh vật chưa nuôi cấy mà vi sinh vật chiếm hàm lượng lớn (99-99,9%) tùy theo môi trường sinh thái Từ năm 2013, Phòng Kỹ thuật di truyền giải trình tự DNA đa hệ gen vi sinh vật ruột mối khai thác 316 gen mã hóa enzyme cellulase, có 31 ORF mã hóa endo glucanase Bằng phần mềm tin sinh ước đoán tính chất enzyme, trình tự gen egc mã số GL0130684 mã hóa endo glucanase phân lập Trong công trình nghiên cứu này, tiến hành: “Tách dòng biểu gen mã hóa endoglucanase từ hệ vi sinh vật ruột mối Coptotermes gestroi tế bào Escherichia coli”nhằm tiến tới tinh chế nghiên cứu tính chất enzyme SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ ENDO-BETA-1,4–GLUCANASE Cellulase nhóm enzyme thủy phân có khả phân cắt mối liên kết beta-1,4-O-glucoside phân tử cellulose, oligosaccharide, disacharide số chất tương tự khác Cellulase chia làm ba dạng: (1) endobeta-1,4-glucanase (được gọi tắt endoglucanase) thủy phân liên kết bên phân tử; (2) exo-beta-1,4-glucanase thủy phân liên kết đầu khử đầu không khử phân tử cellulose; (3) beta-1,4-glucosidase thủy phân phân tử cellodextrin cellobiose thành glucose Enzyme tổng hợp chủ yếu từ vi sinh vật nấm2, vi khuẩn sống môi trường có cellulose Endoglucanasecó tên gọi kháclà1,4-beta-D-glucan-4-glucanohydrolase carboxylmethylcellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4) enzyme thủy phân có khả phân cắt mối liên kết beta-1,4-O-glucoside bên chuỗi polysaccharide dài vùng cellulose tinh thể vô định hình dẫn đến tạo thành đoạn oligosaccharide kích thước ngắn có đầu tự hay nói cách khác tạo đoạn cellulose dextrin, cellobiose (cắt đơn vị) 1.1.1 Sinh vật sản xuất endoglucanase Endo-beta-1,4-glucanase tổng hợp từ nhiều nguồn khác tự nhiên, chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật Trong tự nhiên có nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc số loại nấm men có khả sinh tổng hợp endo-beta-1,4-glucanase Ngoài ra, chúng tổng hợp thực vật Arabidopsis3, động vật nguyên sinh số động vật Mytilus edulis4 Vi khuẩn đối tượng có khả sinh tổng hợp endo-beta-1,4glucanase phong phú Nhiều loại vi khuẩn hiếu khí có khả sinh tổng hợp như: Acidothemus cellulobuticus5, Bacillus pumilis6, Cellulomonas flavigena7, Cellulomonas udai8, Pseudomonas fluoressens8, đặc biệt vi SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 3 (-) M kDa 116,0 66,2 EGC 45,0 35,0 25,0 18,4 14,4 Hình Điện di đồ protein tổng số thể biến nạp E coli BL21(DE3) mang gen egc gel polyacrylamide 12,6% Các chủng E coli tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LBA 30oC, 1.00 mM IPTG tiếng cảm ứng Đường chạy (-): đối chứng âm, protein tổng số dòng tế bào biểu mang vector pET22b(+) không mang gen egc; đường chạy 1-3: protein tổng số dòng tế bào biểu mang pET22-egc; M: DNA chuẩn kb (Fermentas) Phân tích kết điện di cho thấy, dòng 1, 2, mang gen egc, protein tổng số xuất băng protein có kích thước 38 kDa tương đương với kích thước tính toán lý thuyết dòng đối chứng không có, chứng tỏ protein EGC biểu chủng vi khuẩn E coli BL21 (DE3) tái tổ hợp Tuy nhiên, vấn đề thường gặp biểu gen ngoại lai chủng E coli protein tạo thành dạng không tan biểu protein mức dẫn đến không hình thành cấu trúc protein dạng hoạt tính sinh học Do đó, tiến hành kiểm tra khả tan protein EGC tế bào E coli BL1(DE3) Để kiểm tra protein pha tan, sinh khối tế bào phá triệt để siêu âm Khi siêu âm thời gian xung mẫu khoảng 1-2 giây có thời gian nghỉ để tránh cháy mẫu siêu âm, mẫu phải đặt đá lạnh Khi SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 33 thấy dịch siêu âm suốt kết thúc sản phẩm sau siêu âm biến tính chạy điện di SDS-PAGE TS T KT M kDa 116,0 66,2 45,0 EGC 35,0 25,0 18,4 14,4 Hình3 Điện di đồ SDS-PAGE kiểm tra protein pha tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) biểu chủng E coli BL1(DE3) mang gen egc M: Protein chuẩn (Thermo scientific) Chủng nuôi môi trường LBA 30oC sau tiếng cảm ứng với 1.00 mM IPTG.Kết (Hình 3.7) cho thấy lượng EGC nằm pha tan ít, phần lớn chúng nằm pha không tan Khi protein dạng không tan hoạt tính sinh học Đây điều mong muốn nên tiến hành tìm điều kiện tối ưu cho trình biểu thu protein tái tổ hợp 3.3.1 Nhiệt độ Nhiều nghiên cứu cho thấy, nhiệt độ thấp 37oC31,32, hình thành protein ngoại lai dạng tan vật chủ E coli cải thiện đáng kể Vì nhiệt độ thấp protein hình thành tế bào cuộn gấp cấu trúc chúng Vi khuẩn E coli đa số phát triển thích hợp nhiệt độ 37oC SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 34 nhiệt độ protease ảnh hưởng lớn đến khả sinh tổng hợp protein Vì vậy, chọn biểu gen mã hóa egc nhiêt độ 20oC, 30oC 37oC môi trường LBA lỏng cảm ứng 0,5 mM IPTG để xác định nhiệt độ tối ưu thu protein tái tổ hợp nhiều Sau nuôi cấy, tiến hành ly tâm 5000vòng/phút 10 phút để thu sinh khối tế bào mẫu tế bào đưa OD600= 10 xử lý tế bào siêu âm hạt thủy tinh để tối ưu phương pháp phá tế bào Sau tế bào xử lý cách khác sử dụng hạt thủy tinh, siêu âm sốc nhiệt để phá vỡ giải phóng protein pha tan, với mong muốn tìm phương pháp đơn giản để thu protein pha tan cách dễ dàng.Sản phẩm sau siêu âm hút ống eppendorf (tổng sô), dịch lại ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút thu dịch tan tủa (tủa bổ sung nước deion với lượng dịch hút ra) Sản phẩm điện di gel SDS-PAGE (Hình 3.8 3.9) Kết (Hình 3.8) cho thấy nhiệt độ 30-37oC, EGC tổng hợp nhiều Tuy nhiên nhiệt độ hầu hết EGC nằm pha không tan Ở 20oC, phần lớn EGC tổng hợp dạng tan, thể băng protein thu đậm điện di đồ Tuy nhiên, hạt thủy tinh khả phá tế bào tốt nên hầu hết protein chủng chủ nằm pha không tan Có thể phương pháp phá tế bào chưa phù hợp chưa đánh giá xác lượng EGC tan Vì vậy, tiến hành phá tế bào phương pháp siêu âm để so sánh SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 35 30 20 TS KT T M TS KT T 37 TS KT T kDa 116, 66,2 45 EGC 35,0 25,0 18,4 14,4 Hình Điện di đồ SDS-PGE kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) biểu nhiệt độ khác chủng E Coli BL21(DE3) tế bào phá hạt thủy tinh M: Protein chuẩn (Thermo scientific) Kết quả, phương pháp phá tế bào siêu âm (Hình 3.9) cho kết phá tốt Hầu hết protein chủng chủ nằm pha tan Một lần kết khẳng định 30-37oC, khả tổng hợp protein EGC chủng tốt nhất, enzyme chủ yếu tổng hợp dạng không tan Ở 20oC hàm lượng EGC dạng không tan băng tan đậm so với phương pháp sử dụng hạt thủy tinh Vì lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy chủng E coli tái tổ hợp để sinh tổng hợp EGC 20oC SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 36 20 TS KT 30 T M TS KT 37 T TS KT T kDa 116, 66,2 45 EGC 35,0 25,0 18,4 14,4 Hình Điện di đồ kiểm tra protein tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) biểu nhiệt độ khác chủng E coli BL21(DE3) phá tế bào siêu âm M: Protein chuẩn (Thermo scientific) 3.3.2 Nồng độ chất cảm ứng IPTG IPTG chất cảm ứng promoter T7 vector pET22b(+)để khởi đầu phiên mã gen egc vector Đây chất cảm ứng nồng độ cao gây độc cho tế bào nên tiến hành khảo sát để tìm nồng độ IPTG tối ưu cho thí nghiệm biểu gen egc tế bào E coli BL21 (DE3) Chất cảm ứng IPTG nhận biết promoter hoạt hóa trình phiên mã dịch mã để tạo protein ngoại lai với hàm lượng cao Nếu IPTG trình biểu không xảy có xảy hiệu suất thấp nên phải trọng đến nồng độ cảm ứng cuối tối ưu Chúng tiến hành kiểm tra ảnh hưởng mười nồng độ IPTG cảm ứng: 0; 0,02 ; 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 1,0; 2,0 mM lên khả biểu gen egc tế bào E coli BL21(DE3) Sau nuôi cấy chủng 20oC, 200 vòng/phút tiến hành đo OD600và đưa OD600= 10 Kết (Hình 3.11) cho thấy mẫu có IPTG nồng độ thấp 0,02 mM làm SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 37 sinh khối tế bào giảm Điều chứng tỏ sản phẩm biểu gen làm xáo trộn đến khả trao đổi chất cho sinh trưởng tế bào dẫn đến tế bào sinh trưởng Trên thực tế, nhiều protein độc biểu tế bào đến mức độ gây chết tế bào Các gen mã hóa protein độc cho tế bào muốn tổng hợp tốt chủng E coli chúng thường biểu dạng lai hay dạng dung hợp (fusion) với phân tử protein mang để làm giảm độc tính cảm ứng biểu mật độ tế bào gần vào pha cân OD 600 nm 3.5 2.5 1.5 0.5 0 0.5 1.5 2.5 Nồng độ IPTG cảm ứng Hình 10 Đồ thị thể giá trị OD600tại thời điểm thu mẫu tế bào cảm ứng nồng độ IPTG khác Tế bào thu lại cách ly tâm với tốc độ 5000 vòng/phút 10 phút Sau đưa OD600= 10 xử lý sóng siêu âm kết điện di gel polyacrylamide 12,6% SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 38 0,02 0,05 M 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0 kDa 116,0 66,2 45,0 EGC 35,0 25,0 18,4 14,4 Hình 11 Điện di đồ protein tổng số biểu tế bào E coli BL21(DE3) mang gen egc nồng độ IPTG khác gel polyacrylamide 12,6 % có SDS 0,0 - 2: Nồng độ IPTG M: Protein chuẩn (Thermo scientific) Từ điện di đồ cho thấy bắt đầu nồng độ từ đến 0,02 mM hàm lượng EGC 0,05 đến 1,0 có thấy băng protein khoảng 38 kDa tương ứng với kích thước protein EGC theo tính toán lý thuyết giảm chí giảm mạnh nồng độ mM Chúng tiếp tục kiểm tra khă tan protein nồng độ cảm ứng khác cách tiếp tục siêu âm để phá tế bào sau ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút để thu dịch tan tủa SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 39 0,02 0,05 0,1 M 0,2 0,3 0,4 0,5 1,0 kDa 116,0 66,2 45,0 EGC 35,0 25,0 18,4 14,4 Hình 12 Điện di đồ kiểm tra protein pha tan biểu tế bào E coli BL21(DE3) nồng độ IPTG khác gel polyacrylamide 12,6 % có SDS 0,0 - 2: Nồng độ IPTG M: Protein chuẩn (Thermo scientific) Kết (Hình 3.12) cho thấy pha tan cảm ứng nồng độ từ đến 0,02 mM lượng protein tan ít, khó quan sát Băng protein EGC quan tâm xuất (khoảng 38 kDa) cảm ứng nồng độ 0,05 mM trở lên băng tương đương băng protein tan giảm mạnh nồng độ mM Chúng chọn nồng độ cảm ứng IPTG 0,1 mM băng thu đậm phù hợp với giá trị kinh tế Với kết thu từ khảo sát Chúng rôi lựa chọn điều kiện tối ưu biểu gen egc mã hóa cho enzyme betaglucanase tế bào E coli BL21(DE3): biểu môi trường LBA nhiệt độ 20oC, nồng độ IPTG cảm ứng 0,1 mM SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 40 3.4 KIỂM TRA HOẠT TÍNH CỦA ENDOGLUCANASE Protein EGC biểu dạng tan sử dụng để kiểm tra hoạt tính endoglucanase môi trường chất đặc hiệu CMC phương pháp ép gel đề cập chương Kết quảthử Zymography (Hình 3.13) cho thấyvùng hoạt tính tương ứng với vị trí băng protein EGC kích thước khoảng 40 kDa mẫu protein tổng số protein pha tan Mẫu đối chứng âm vùng hoạt tính Điều chứng tỏ protein EGC có hoạt tính endoglucanase Như vậy, định tính xác định hoạt tính endoglucanase protein EGC EGC EGC (-) EGC M TS T KT kDa (-) M TS T KT 170 130 95 72 55 43 34 26 17 Hình 13 Điện di đồ kiểm tra hoạt tính protein tan (T), pha không tan (KT) protein tổng số (TS) gel polyacrylamide % không biến tính kết hợp đệm biến tính mẫu nhuộm coomassie M: Protein chuẩn pageruler prestained (Fermentas) (-): Tế bào chủ mang pET22b(+) làm đối chứng SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu trình thực đề tài, rút số kết luận sau: Gen egc mã hóa endoglucanase vi sinh vật ruột mối biểu thành công chủng E coli BL21 EGC biểu pha tan tốt chủng E coli tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LBA có 0,1 mM IPTG 20oC EGC tái tổ hợp có hoạt tính sinh học thủy phân chất đặc hiệu CMC KIẾN NGHỊ Tinh chế EGC tái tổ hợp Xác định số tính chất enzyme SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hoàng Anh Lê, Nguyễn Thị Thu Hạnh & Lê Thùy Linh (2013) Ước tính lượng khí phát thải đốt rơm rạ đồng ruộng địa bàn tỉnh Thái Bình 26–33 Laboratory et al(Accessed: 18th April 2015) Induction and Catabolite Repression Mechanisms of Cellulase in Fungi Available at: http://www.sciencedirect.com.sci -hub.org/science/article/pii/S1389172301802310 Kim, S et al(2009).Arabidopsis thaliana Rubisco small subunit transit peptide increases the accumulation of Thermotoga maritima endoglucanase Cel5A in chloroplasts of transgenic tobacco plants Transgenic Res.19, 489–497 Xu, B., Hellman, U., Ersson, B & Janson, J.-C Purification (2000) Characterization and amino-acid sequence analysis of a thermostable, low molecular mass endo-β-1,4-glucanase from blue mussel, Mytilus edulis Eur J Biochem.267, 4970–4977 Bergquist, P L et al(1999) Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria FEMS Microbiol Ecol.28, 99– 110 O’Leary, W M (CRC Press, 1989) Practical Handbook of Microbiology SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 43 Rajoka, M I (2004) Influence of various fermentation variables on exoglucanase production in Cellulomonas flavigena Electron J Biotechnol.7, 07–08 Bagnara, C., Gaudin, C & Belaich, J P (1987) Physiological properties of Cellulomonas fermentans, a mesophilic cellulolytic bacterium Appl Microbiol Biotechnol.26, 170–176 Joe K Mauldin, Richard V Smythe, and Cyril C Baxter (1972) Cellulose catabolism and lipid synthesis by the subterranean termite, Coptotermes formosanus 2, 209 10 Khademi, S et al(2002) Determination of the structure of an endoglucanase from Aspergillus niger and its mode of inhibition by palladium chloride Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.58, 660–667 11 Sarkar, N & Aikat, K (2014) Aspergillus fumigatus NITDGPKA3 Provides for increased cellulase production Int J Chem Eng.2014, e959845 12 M K.L Das, J S P (1997) Endoglucanase production by paper- degrading mycoflora Lett Appl Microbiol.25, 313–5 13 Palonen, H., Tenkanen, M & Linder, M (1999) Dynamic Interaction of Trichoderma reesei Cellobiohydrolases Cel6A and Cel7A and cellulose at equilibrium and during hydrolysis Appl Environ Microbiol.65, 5229– 5233 SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 44 14 Sørensen, A., Lübeck, M., Lübeck, P S & Ahring, B K (2013) Fungal beta-glucosidases: A Bottleneck in industrial use of lignocellulosic materials Biomolecules3, 612–631 15 Liu, G., Wei, X., Qin, Y & Qu, Y (2010) Characterization of the endoglucanase and glucomannanase activities of a glycoside hydrolase family 45 protein from Penicillium decumbens 114-2 J Gen Appl Microbiol.56, 223–229 16 Henriksson, G et al(1999) Endoglucanase 28 (Cel12A), a new Phanerochaete chrysosporium cellulase Eur J Biochem FEBS259, 88– 95 17 El-Naggar, N E.-A., Abdelwahed, N A M., Saber, W I A & Mohamed, A A (2014) Bioprocessing of some agro-industrial residues for endoglucanase production by the new subsp.; Streptomyces albogriseolus subsp cellulolyticus strain NEAE-J Braz J Microbiol.45, 743–756 18 Schlochtermeier, A., Walter, S., Schröder, J., Moorman, M & Schrempf, H (1992) The gene encoding the cellulase (Avicelase) cel1 from Streptomyces reticuli and analysis of protein domains Mol Microbiol.6, 3611–3621 19 Trần Ngọc Hùng, Phan Trọng Nhân, Ngô Thị Lành, Nguyễn Thị Minh Thanh & Hoàng Thị Xuân (2014) Sàng lọc số chủng Trichoderma sp Đối kháng với Colletotrichum sp gây bệnh thán thư ớt trồng Bình Dương Available at: http://sci-hub.org/ SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 45 20 Simpson, H D & Barras, F carbohydrate-binding domains (1999) Functional analysis of the of Erwinia chrysanthemi Cel5 (Endoglucanase Z) and an Escherichia coliputative chitinase J Bacteriol.181, 4611–4616 21 Lò Thanh Sơn, Hồ Mạnh Tường, Lê Văn Sơn, Nguyễn Vũ Thanh Thanh & Chu Hoàng Mậu (2013) Tách dòng, thiết kế vector chuyển gen GmEXP1 vào thuốc Nicotinana tabacum 44–52 22 Phạm Việt Cường (2010) Hoàn thiện công nghệ sản xuất chế phẩm chứa beta-glucan axitamin từ nấm men 15–17 23 GS.TS Nguyễn Gia Khánh & PGS.TS Nguyễn Thị Lam (2012) Ảnh hưởng sữa bổ sung pre-probiotic lên tình trạng ding dưỡng, nhiễm khuẩn hệ vi khuẩn đường ruột trẻ 6-12 tháng tuổi huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên 24 Omogbenigun, F O., Nyachoti, C M & Slominski, B A (2004) Dietary supplementation with multienzyme preparations improves nutrient utilization and growth performance in weaned pigs J Anim Sci.82, 1053– 1061 25 Howard R.L., Abotsi E, Jansen van Rensburg E.L & Howard S (2003) Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production 602–619 26 PGS TS Khuất Hữu Thanh (2006) Kỹ thuật gen nguyên lý ứng dụng (Nhà xuất khoa học kỹ thuật,) SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 46 27 J Mol Biol (1991) Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor 45–59 28 Lee, H H et al(2002) Crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of enoyl-acyl carrier protein reductase from Helicobacter pylori Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.58, 1071–1073 29 R.Glick, B & Jack J Pasternak (2007) Công nghệ sinh học phân tử, nguyên lý ứng dụng DNA tái tổ hợp (Nhà xuất khoa học kỹ thuật,) 30 QIAquick® Gel Extraction Kit (2015) 31 Timothy et al(2015) Large-scale overproduction and rapid purification of the Escherichia coli ssb gene product Expressioa of the ssb Gene under X PL Control 32 Martínez-Alonso, M., González-Montalbán, N., García-Fruitós, E & Villaverde, A (2009) Learning about protein solubility from bacterial inclusion bodies Microb Cell Factories8, SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 47 [...]... chế Biểu hiện gen egctrong tế bào E coli - Biểu hiện gen egc - Lựa chọn điều kiện biểu hiện gen Kiểm tra hoạt tính của EGC SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 25 3.1 Thiết kế vector biểu hiện pET22-egc Dựa trên trình tự gen mã hóa endoglucanase đã có sẵn từ dữ liệu giải trình tự DNA đa hệ gen của vi sinh vật trong ruột mối, toàn bộ gen (wegc) đã được phòng Kỹ thuật Di truyền Vi n Công nghệ sinh. .. cerevisiae), tế bào động vật và tế bào thực vật Để thu được protein ngoại lai với hàm lượng lớn và hoạt tính tốt thì vi c chọn lựa hệ biểu hiện và vector biểu hiện phù hợp là quan trọng và cần thiết.E coli vẫn là một trong những đối tượng sử dụng rộng rãi hiện nay E coli là vi khuẩn gram âm, có dạng hình que và được sử dụng phổ biến trong các protein tái tổ hợp do có nhiều ưu điểm sau: có khả năng sinh. .. hữu trong vi c biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt la những gen được đưa vào hệ vector pET (plasmid for Expression by T7 ARN polymerase) 1.3.3Vector biểu hiện pET22b(+) Vector biểu hiện là vector có thể mang gen ngoại lai mong muốn, cho phép thực hiện sự phiên mã của các bản sao được tạo dòng và sự dịch mã các mARN của chúng trong hệ biểu hiện, từ đó tổng hợp protein mong muốn từ gen ngoại lai Vector có... đầu phiên mã, từ đó cho phép sản xuất một lượng lớn mARN từ các gen được nhân dòng sau khi được cảm ứng.Khi trong môi trường không có chất cảm ứng, gen lacI nằm trên hệ gen vi khuẩn được phiên mã sinh tổng hợp protein LacI LacI là chất ức chế, chúng có ái lực cao với lac operon và bám chặt vào operator làm cho lac promoter điều khiển phiên mã gen T7 RNA polymerase trong hệ gen chủng chủ và T7 promoter... , phiên mã, dịch mã độc lập với vật chủ Ngoài ra, vector còn phải chứa gen mã hóa cho protein có chức năng làm dấu hiệu chọn lọc Gen thường sử dụng trong vector biểu hiện là gen kháng kháng sinh Gen này tạo điều kiện thuận lợi cho vi c nhận biết các dòng tế bào mang ADN plasmid SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 10 Hệ vector pET đã được Studier và các cộng sự thiết kế dựa trên cơ sở hệ điều khiển... điều khiển promotor T7 mạnh có nguồn gốc từ bacteriophage T7, cho phép biểu hiện gen tách dòng ở các tế bào chủ là vi khuẩn (E coli, bacillus…) khi có mặt chất cảm ứng IPTG27 Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng vector pET22b(+) làm vector biểu hiện Vector pET22b(+) có chiều dài 5493 bp là vector được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp trong E coli Về cấu tạo, vector này bao... cũng như các quá trình phiên mã, dịch mã và quá trình sinh protein nội bào Bên cạnh đó, vi c sử dụng vi khuẩn E coli trong biểu hiện cũng có một SV: Nguyễn Thành Duy – Khóa 19.1203 Page 9 số hạn chế sau: các gen mã hóa protein có kích thước lớn hơn 50 kDa, protein giàu cystein hoặc những sản phẩm protein có liên kết disunfua (S – S) rất khó biểu hiện trong tế bào E coli ,biểu hiện các loại protein không... thu tế bào ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC 4 Thu tủa trong box cấy 5 Gom tủa vào một ống, hòa tủa trong 40 ml CaCl2 0,1 M (vô trùng, đã được làm lạnh) và ủ 30 phút trên đá 6 Ly tâm thu tế bào ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút 7 Thu tủa trong box, tế bào tiếp tục hòa vào 35 ml CaCl2 0,1 M và ủ 10 phút trên đá 8 Tiếp tục ly tâm thu tế bào ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút 9 Thu tủa trong. .. năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học, đồng thời phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin Trong công nghiệp tái chế glucanase được sử dụng để tẩy vết mực trên giấy 1.2.BIỂU HIỆN GEN ENDOGLUCANASE TRONG E COLI 1.2. 1Hệ biểu hiệnE coli Hiện nay có 5 hệ biểu hiện thường được sử dụng để biểu hiện gen như: E... nội bào) ,opmTprotease (một protease ngoại bào) bị đột biến nênlàm giảm khả năng thủy phân protein đáng kể Ngoài ra, DNA của hệ gen E coli BL21 còn chứa gen mã hóa cho T7RNA polymerase Đây là gen có nguồn gốc từ bacteriophage T7 được đưa vào hệ gen của E coli BL21 dưới sự điều khiển của promoter lac cảm ứng IPTG Chính nhờ những cải biến này mà E coli BL21 đã trờ thành vật chủ hiện hữu trong vi c biểu hiện