Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học LỜI CẢM ƠN Để hoàn àn thành khóa luận lu này, xin gửi lời cảm ơn chân thành ttới PGS.TS Lê Mai Hương, ương, TS Tr Trần Thị Hồng Hà, Ths Nguyễn ễn Đình Luyện toàn thể cán ộ đđang công tác phòng Sinh học thực ực nghi nghiệm – Viện hóa học Các Hợp chất ất Thiên Thi Nhiên, Viện Khoa học vàà công ngh nghệ Việt Nam tận tình hướng dẫn, ẫn, giúp đỡ trình thực tập ại ph phòng Tôi xin chân thành ccảm ơn thầyy cô khoa Công ngh nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà N Nội tận tình giảng dạy, giúp đỡ su suốt trình học tập khoa Tôi ng xin chân thành th cảm ơn gia đình bạn bè đãã giúp đỡ, động viên ên hoàn thành khóa luận lu Xin chân thành ccảm ơn! Hà nội, ngày 25 tháng năm m 2016 Sinh viên Đỗ Thị Bảo Đỗ Thị Bảo i CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học MỤC LỤC MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii DANH MỤC CHỮ VIẾT VIẾ TẮT viii MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG NG QUAN TÀI T LIỆU 1.1 Sơ lược lịch ịch sử nghiên cứu nấm Cordyceps militaris 1.1.1 Trên thếế giớ giới 1.1.2 Nghiên cứu ứu v nấm Cordyceps militaris Việt Nam 1.2 Giá trị dược ợc liệu liệ 1.2.1 Giá trịị dược d liệu số chấtt có nấ nấm Cordyceps militaris ………………………………………………………………… ………………………………………………………………….9 1.2.2 Đối với ới hệ thống miễn dịch 11 1.2.3 Đối với ới hệ hô hấp 12 1.2.4 Đối với ới hệ tuần hoàn tim não 12 1.2.5 Đối với ới hệ thống nội tiết 12 2.1 Đối tượng, địa điể điểm, hóa chất thiết bị sử dụng ng nghi nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tượng ng nghiên nghi cứu 13 2.1.2 Địa điểm m nghiên nghi cứu 13 2.1.3 Hóa chất vàà thiết thi bị sử dụng nghiên cứu 13 2.2 Nội dung nghiên ên cứu c 14 Đỗ Thị Bảo ii CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học 2.3 Mục tiêu nghiên ccứu 14 2.4 Phương ng pháp nghiên cứu c 15 2.4.1 Xác định nh môi trường tr phù hợp dùng để nhân giống ng cấp ch chủng nấm Cordyceps militaris 15 2.4.2 Nghiên ứu thành phần môi trường nuôi cấy chủng ch nấm Cordyceps militaris môi trường lỏng 15 2.4.2.1 Ảnh hưởng ởng c nguồn cacbon tới khả hình ình thành phát triển chủng ng nấm Cordyceps militaris 16 2.4.2.2 Ảnh hưởng ởng nguồn ngu nitơ đến khả hình ình thành phát tri triển chủng nấm Cordyceps militaris 16 2.4.2.3 Ảnh hưởng ởng c nhiệt độ tới thời gian sinh trưởng ởng v phát triển chủng nấm Cordyceps militaris 16 2.4.2.4 Ảnh hưởng ởng c giá trị pH môi trường tới sinh tr trưởng phát triển chủng ng nấm Cordyceps militaris 17 2.4.3 Nghiên ứu kỹ thuật nuôi trồng tạo thểể nấ nấm Cordyceps militaris môi trường tr rắn 17 2.4.3.1 Nghiên cứu ứu ảnh hưởng chất đến khả ăng hhình thành phát triển quảả thể th nấm Cordyceps militaris môi trư trường rắn 17 2.4.3.2 Nghiên ứu ảnh hưởng cường độ chiếuu sáng tớ tới phát triển thể chủng ch nấm 18 2.4.3.3 Nghiên ccứu ảnh hưởng công thức phối ối trộ trộn phụ gia đến khả hình ình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps militaris19 2.4.4 Phương ng pháp thu thập th xử lí số liệu 20 2.4.5 Phương ng pháp tách chi chiết chủng nấm Cordyceps militaris hai môi trường rắn vàà lỏng l với dung môi làà ethanol etyl acetat 21 Đỗ Thị Bảo iii CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học 2.4.6 Xác định nh hoạt hoạ tính sinh học chủng nấm Cordyceps militaris 22 PHẦN 3: KẾT QUẢ Ả NGHIÊN NGHI CỨU 27 3.1 Xác định nh môi trường tr phù hợp dùng để nhân giống cấp ấp ch chủng nấm Cordyceps militaris 27 3.2 Kết nghiên ên cứu c thành phần môi trường nuôi cấy ên môi tr trường lỏng 28 3.2.1 Ảnh hưởng ởng củ nguồn cacbon 28 3.2.2 Kết ảnh hưởng h nguồn nitơ tới phát triển ển củ sợi nấm 30 3.2.3 Kết ảnh hưởng h nhiệt độ tới phát triển sợ sợi nấm 32 3.2.4 Kết quảả ảnh hưởng h pH 34 3.3 Nghiên cứu kỹỹ thuật thu nuôi trồng tạo thể nấm Cordyceps militaris môi trường rắn 34 3.3.1 Nghiên cứu ứu ảnh ả hưởng chất đến khả ăng hhình thành phát triển quảả thể th nấm Cordyceps militaris môi trư trường rắn 35 3.3.2 Ảnh hường ờng c cường độ sáng đến khả hình ình thành phát triển nấm Cordyceps militaris 37 3.3.3 Kết quảả ảnh hưởng h công thức bổ sung dưỡng ỡng ch chất đến khả hình ình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps militaris 39 3.4 Kết đánh ánh giá hoạt ho tính sinh học cặn chiết ết củ chủng nấm Cordyceps militaris hai môi tr trường nuôi cấy rắn lỏng 41 PHẦN KẾT LUẬN 45 DANH MỤC BẢNG Đỗ Thị Bảo iv CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học Bảng 2.1: Ảnh hưởng ởng củ loại chất đến khả hình ình thành phát tri triển thểể nấm nấ Cordyceps militaris 18 Bảng2.2: Ảnh hưởng ng củ cường độ chiếu sáng tới phát triển v thể chủng ng nấm Cordyceps militaris 19 Bảng 2.3: Ảnh hưởng ởng ccủa công thức phối trộn phụ gia đến kh khả hình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps militaris 19 Bảng 3.1: Ảnh hưởng ởng ccủa môi trường nhân giống cấp lên ên trình sinh trưởng khuẩn khu lạc nấm Cordyceps militaris 27 Bảng 3.2: Kết ảnh nh hưởng h nguồn cacbon tới khả ăng hhình thành phát triển chủng ch nấm Cordyceps militaris 29 Bảng 3.3: Kết nghi nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ tới ới kh khả hình thành phát triển tri chủng nấm Cordyceps militaris 30 Bảng 3.4:Kết ảnh nh hưởng h nhiệt độ đến khả hình ình thành phát triển củaa thể th nấm Cordyceps militaris 32 Bảng 3.5: Kết ảnh nh hhưởng loại chất đến khả ăng hhình thành phát triển qu thể nấm Cordyceps militaris 35 Bảng 3.6: Kết ảnh nh hưởng h cường độ chiếu sáng tới ự phát tri triển thể chủng chủ nấm Cordyceps militaris 37 Bảng 3.7: Kết ảnh nh hưởng h công thức phối trộn phụụ gia đến đế khả hình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps mil militaris 39 Bảng 3.8: Hoạtt tính kháng vi sinh vật v kiểm định cặnn chiế chiết 42 Bảng 3.9: Hoạtt tính chống chố oxy hóa dịch chiết chủng nấm ấm 42 Bảng 3.10: Hoạtt tính gây độc tế bào cặn chiết chủng nấm ấm 43 Đỗ Thị Bảo v CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Quy trình thu nhận nh chiết từ dịch nuôi cấyy củ chủng nấm Cordyceps militaris 22 Hình 3.1: Hệ sợi nấm ấm Cordyceps militaris tr môi trường ờng MT1, MT2 vvà MT3 sau 10 ngày cấy c 28 Hình 3.2: Hệ sợi nấm ấm Cordyceps militaris tr môi trường ng CT1 vvà CT3 sau ngày cấy 30 Hình 3.3: Hệ sợi nấm ấm Cordyceps militaris tr môi trường ng CT1, CT3, CT5 sau 11 ngày nuôi cấy c 32 Hình 3.4: Hệ sợi nấm ấm Cordyceps militaris tr môi trường NĐ2 Đ2 vvà NĐ4 sau ngày nuôi cấy 34 Hình 3.5: Quả thể nấm ấm Cordyceps militaris công thứcc TN1 (A) vvà TN5 (B) sau 50 ngày nuôi cấy c 37 Hình 3.6: Quả thể nấm ấm Cordyceps militaris công thức cường ờng độ sáng 2000 lux 39 Hình 3.7: Quả thể nấm ấm Cordyceps militaris công thức PT3 sau 40 ngày (A) 50 ngày (B) nuôi cấy c 41 Đỗ Thị Bảo vi CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Ảnh hưởng ởng c nguồn cacbon tới khả hình ình thành phát triển củaa chủng chủ nấm Cordyceps militaris 29 Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng ởng c nguồn nitơ tới khả hình ình thành phát tri triển chủng ng nấm nấ Cordyceps militaris 31 Biểu đồ 3.3: Ảnh hưởng ởng c nhiệt độ đến khả hình ình thành phát tri triển thểể nấm n Cordyceps militaris 33 Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng ởng c loại chất đến khả hình ình thành phát triển củaa thể nấm Cordyceps militaris 36 Biểu đồ 3.5: Ảnh hưởng ởng c cường độ chiếu sáng tới phát tri triển thể chủng ủng nnấm Cordyceps militaris 38 Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng ởng c công thức phối trộn phụ gia đến kh khả hình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps militaris 40 Đỗ Thị Bảo vii CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học DANH MỤC M CHỮ VIẾT TẮT CL Cấy lỏng CR Cấy rắn CS% Cell survival % (% tế t bào sống sót) DMSO Dimethyl sulfoxid (Dimetyl sulfoxit) DPPH 1,1 – diphenyl - – picrylhydrazyl ĐTHT Đông ông trùng hạ h thảo EtOAc Ethylacetat ( etyl axetat) EtOH Ethanol (Etanol) MIC Minimum inhibitory concentration (Nồng (N độ ức chếế tối thiểu) OD Optical Density (M (Mật độ quang) SC% Scavenging capacity (% khả kh bẫy gốc tự do) SRB Sulforhodamine forhodamine B ( Sunforodamin B) TCA Trichloacetic acid (Axit tricloaxetic) VSVKĐ Vi sinh vậật kiểm định Đỗ Thị Bảo viii CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học MỞ ĐẦU ùng hhạ thảo (ĐTHT) loại nấm m kí sinh tr côn trùng, Nấm Đông trùng không đượcc nhà nh khoa học nghiên cứu, mà ợc xã hội quan tâm đến, nấm loại ại ddược liệu quý, tốt cho sức khỏee ng người, phù hợp với lứa tuổi, từ trẻ con, phụ nữ mang thai, thiếu ếu ni niên, người già Theo tài liệu li ghi chép đông dược cổ, ĐTHT m vị thuốc bồi bổ hết sứcc quý giá, có tác dụng d tích cực với bệnh rối loạn tình dục, thận hư, liệt dương, ương, di tinh, đau lưng, mỏi gối, ho hen, vàà có tác ddụng tốt trẻ em còi xương ương chậm ch lớn Một số nghiên cứu ện đạ đại gần nấm ĐTHT THT có tác dụng làm tăng cường ng công nă tuyến thượng thận, nâng cao hệ miễn dịch, kháng khuẩn, n, kháng virus, ch chống ung thư chất phóng xạ Dùng D thường xuyên ĐTHT giúp tăng tu tuổi thọ, ngăn ngừa hạn chế trình tr lão hóa, tốt cho người giàà người ngư suy nhược thể thờii gian dài d [10, 7] Do tác dụng dược ợc lý r tốt nấm Đông trùng mà ện nhu cầu c sử dụng loại nấm ất lớn lớ Hiện tự nhiên nấm Đông ông trùng bị khai thác kiệt quệ, trữ lượng ợng không đủ đáp ứng nhu cầu người ời sử dụng Vì có nhiều nước tiến ến hành h nghiên cứu để tìm kỹ thuậtt nuôi trồng trồ loài nấm cách hiệuu quả Ví dụ,, Công ty Biofact life (Malaysia) kết hợp công nghệ tiên tiếnn củ Nhật nước khác nuôi cấy thành ành công nnấm Cordyceps môi trường trư nhân tạo để tạo hai hoạt ạt ch chất Copdycepin Adenosin nosine tạo từ hệ sợi nấm Các nư ước Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ, ỹ, Nhật Nh Bản, Malaysia sản xuất ợc nấ nấm ĐTHT quy mô công nghiệp ệp từ nh năm 1995, kỷ XX Ở Việt Nam việc ệc nghiên nghi cứu nấm ĐTHT chỉỉ bắt đầ đầu, gặp nhiều khó khăn, ăn, c sở vật chất kiến thức Nấm ấm ĐTHT Đ Việt Nam có nhiều loạii khác tìm thấy vùng khác Trong ssố Đỗ Thị Bảo CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học loài nấm Cordyceps nuôi trồng nghiên cứu Việt Nam vvà giới có chủng nấm ấm Cordyceps militaris có giá trị dược liệu ệu cao vvà dễ nuôi trồng Tuy nhiên ên Việt Nam việc nuôi trồng hạn ạn ch chế giá thành cao khó phổ ph biến đến người tiêu dùng Để góp phần vào nghiên ccứu môi trường nuôi cấy thích hợ ợp nấm ĐTHT Việt Nam, mà cụ ụ thể l chủng nấm Cordyceps militaris với ới mụ mục đích giảm giá thành nuôi trồng, ng, chi phí ssản xuất, nuôi trồng đơn giản, thực th đề tài: “Nghiên Nghiên cứu c môi trường nuôi cấy đánh ánh giá m số hoạt tính sinh học từ chủng ủng nấm n Cordyceps militaris” Đỗ Thị Bảo CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học Theo kết quảả bảng 3.2 biểu đồ trên, thấy công thức th CT4 (40g/l đường)) phù hợp h cho phát triển nấm m sinh kkhối thu đạt cao nhấtt (15,1 (15,1g/l) Khi hàm lượng đường giảm dần ần (30g/l xu xuống 10g/l đường) nấm ấm c phát triển yếu dần thể thờ ời gian hệ sợi chuyển sang màu àu vàng dài (t (từ 12 ngày xuống 16 ngày), ày), sinh kh khối thu thấp (11,9 g/l CT1) Hình 3:Hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường ng CT1 CT3 sau ngày cấy 3.2.2.Kết ảnh hưở ởng nguồn nitơ tới phát triển củ sợi nấm Môi trường ng nuôi ccấy tiến hành thay đổi hàm lượng ợng pepton môi trường bản, đư ược sử dụng phối trộn theo công thức ức thể th bảng 3.3, sau cấy gi giống quan sát sinh trưởng nấm ấm tr môi trường thu đư ược kết bảng 3.3: Bảng 3.3:Kết nghiên cứu c ảnh hưởng nguồn nitơ tớii kh khả hình thành phát triển tri chủng nấm Cordyceps militaris CTTN Đỗ Thị Bảo Hàm lư lượng pepton (g/l) Ngày lan kín bề mặt bình tam giác 250ml(ngày) 30 Ngày hệệ sợi chuyểnn sang m màu vàng(ngày) Sinh khối thu được(g/l) CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học 11 14 12,1 CT2 11 14 12,5 CT3 10 13 13,1 CT4 12 14,6 CT5 10 11 15,2 Ngày 16 16 14 14 12 12 10 10 8 6 4 2 0 Sinh khối (g/l) CT1 10 Ngày lan kín bề b mặt bình tam giác 250ml (ngày) Ngày hệ h sợi chuyển sang màu vàng (ngày) Sinh khối kh thu (g/l) Biểu đồ 3.2: Ảnh hưởng ng c nguồn nitơ tới khả hình ình thành phát tri triển củ chủng nấm Cordyceps militaris Từ bảng kếtt 3.3 biểu đồ 3.2 thấy, ấy, ttăng hàm lượng pepton từ 5g/l llên 10g/l thời gian hệ sợi nấm m lan kín bbề mặt chuyển từ màu trắng ng sang màu m vàng giảm dần,trong đóó sinh kh khối thu tăng dần vàđạt cao ất CT5 (15,2g/l) Như hàm lượng ng pepton ttốt để nấm phát triển 10g/l g/l Đỗ Thị Bảo 31 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học CT1CT2CT5 Hình 4: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường ng CT1, CT3, CT5 sau 11 ngày nuôi cấy 3.2.3.Kết ảnh hưở ởng nhiệt độ tới phát triển sợ ợi nấm Các môi trường ờng đ cấy giống lượng nhau, cho vào ttủ nuôi nhiệt độ khác Sau quan sát phát triển hệ h sợi, ăn kín bề mặt, sau hệ sợi ợi ăăn kín bề mặt, mang khỏi tủ ấm để ddưới ánh sáng đèn chiếu sáng 8h/ngày ày Xác định thời gian chuyển sang màu àu vàng ccủa sinh khối, tiến hành ành thu sinh khối kh mang xác định trọng lượng ng sinh kh khối khô, thu kết bảng ảng 3.4dưới đây: Bảng 3.4:Kết ết ảnh hưởng nhiệt độ đến khả ăng hhình thành phát triển thểể nấm nấ Cordyceps militaris Đỗ Thị Bảo 32 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học CTTN Nhiệt ệ độ nuôi cấy Ngày lan kín bề mặt bình tam giác 250ml(ngày) Ngày hệ sợi chuyểnn sang màu vàng(ngày) Sinh khối thu được(g/l) NĐ1 20 11 14,8 NĐ2 25 16,1 NĐ3 30 12 13,8 NĐ4 35 12 14 11 16 18 16 14 12 10 14 12 10 g/l Sinh khối (g/l) Ngày 20 25 30 35 Ngày lan kín bề b mặt bình tam giác 250ml (ngày) Ngày hệ sợi chuyển sang màu vàng (ngày) Sinh khối khố thu (g/l) Biểu đồ 3.3: Ảnh hưở ởng nhiệt độ đến khả hình ình thành phát tri triển củủa thể nấm Cordyceps militaris Qua bảng 3.4 biểu bi đồ 3.3, ta thấy nhiệt độ thích hợp nh cho hình thành phát triển ển ccủa thể nấm 25ºC Tại nhiệt độ 20 20ºC, nấm phát triển chậm yếu hơn, ơn, thể th thời gian hệ sợi chuyểnn sang màu vàng dài Đỗ Thị Bảo 33 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học Khi nhiệt độ tăng ăng lên 30ºC 30º 35ºC, nấm phát triển yếu ếu nh nhất, thời gian ăn lan kín bề mặt bình ình ttăng lên (12 ngày) sinh khốii thu đđược thấp (11g/l) NĐ2 NĐ4 Hình 5: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris môi trường NĐ22 NĐ4 sau ngày nuôi cấy 3.2.4 Kết ảnh hưở ởng pH Để lựa chọn ợc giá trị tr pH tối ưu cho phát triển, nấm ấm đđược nuôi nhiệt độ 25ºC, C, môi tr trường dịch thể PDA, hàm lượng ợng đđường 40g/l, pepton 10g/l g/l giá trị tr pH từ 5-8 Sau tiến hành ành nuôi cấy c nhận thấy giá trị pH tối tố ưu cho phát triển chủng ng nấm nấ Cordyceps militaris, nằm m giá trị tr pH trung tính pH=6,5-7 chủng nấm ấm phát triển tr tốt vàà không thích hợp h với môi trường kiềm m hay axit Do đđó giá trị pH lựa chọnn cho nghi nghiên cứu tối ưu pH=7 3.3.Nghiên cứu kỹ thuật thu nuôi trồng tạo thể nấm Cordyceps militaris môi trường rắn Các phòng nuôi dùng cho thí nnghiệm thường có diện ện tích 16 16-20 m2, khép kín, nhiệt độ phòng ph điều chỉnh phù hợp ằng hệ h thống điều hòa, độ ẩm phòng òng nuôi cấy c điều chỉnh hệ thống ống phun ssương tự động ng thông qua máy đo độ ẩm đặt phòng, òng, trình chi chiếu sáng Đỗ Thị Bảo 34 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học cường độ mứcc sáng điều chỉnh hệ thống đèn èn huỳnh hu quang theo dõi õi 24h/ngày 24h/ngày 3.3.1.Nghiên cứu ảnh nh hưởng h chất đến khả ng hình h thành phát triển thểể nấm Cordyceps militaris môi trườ ờng rắn Các thí nghiệm ệm bổ trí sử dụng loại chất khác hau (Cơm (C gạo tẻ trắng, Cơm gạo lứt, vàà Cơm gạo nếp thơm) với5 công thứcc nghi nghiên cứu Kết thu bảng ảng sau: sau Bảng 3.5:Kết ảnh nh hưởng hư loại chất đến khả hình ình thành phát triểnn ccủa thể nấm Cordyceps militaris CTTN Cơ chất nuôi trồng ồng Thời gian thể bắt đầu hình thành (ngày) TN1 Cơm gạo tẻ trắng ắng 19 15 60 12,2 Dài 6,1-7,2cm, mập, màu vàng nhạt TN2 Cơm gạo lứt 18 16 59 13,1 Dài 7,0-7,5cm, mập, màu vàng cam TN3 Cơm gạo nếp thơm ơm 19 15 58 13,8 Dài 6,0-6,7cm, mập, màu vàng cam TN4 50% Cơm gạo nếp ếp thơm+50% Cơm gạạo tẻ trắng 22 12 60 10,68 Dài 6,4-6,8cm, mập, màu vàng cam TN5 50% Cơm gạo o nếp thơm+ 50% Cơm ơm gạo lứt 18 17 57 16,8 Dài 7,1-7,5cm, mập, màu vàng cam Đỗ Thị Bảo Số lượng thể /bình (quả) Thời gian thu hoạch thể (ngày) Khối lượng ng thể tươi ươi/ bình (g) Đặc điểm thể 35 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học Số lượng quảả thể /bình (quả) 17 16 15 12.2 Cơm gạo tẻ trắng Khối lượng thể tươi/ ươi/ bình (g) 15 13.1 13.8 16.8 12 10.68 Cơm m gạo gạ lứt Cơm gạo nếp 50% Cơm gạo 50% Cơm Cơ gạo thơm nếp nếp ếp th thơm+ thơm+50% 50% Cơm Cơ gạo Cơm gạo tẻ lứ lứt trắng Biểu đồ 3.4: Ảnh hưở ởng loại chất đến khả hình ình thành phát triểnn ccủa thể nấm Cordyceps militaris Từ kết bảng ảng biểu đồ trên, thấy ssự khác biệt lớn công thức ức thí nghiệm, nghi công thức TN5cho cho số lượng thể/bình 17 quả,, khối khố lượng thể tươi/bình 16,8g, qu thể dài 7,17,5cm, mập vàà có màu vàng cam Các công thức thí nghiệm m khác th cho kết thấp không khác gi thí nghiệm òn llại Như TN5 chất tốtt nhấ cho hình thành phát triển nấ nấm Cordyceps militaris Tuy nhiên đểể tiết ti kiệm chi phí sản xuất đơn giản ản tr trình nuôi trồng lựa ch họn công thức thí nghiệm làà TN1 làm c chất nuôi trồng Đỗ Thị Bảo 36 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học B A Hình 6: Quả thể nấm m Cordyceps militaris công thứcc TN1 (A) TN5 (B) sau 50 ngày nuôi cấy 3.3.2 Ảnh hường củaa ccường độ sáng đến khả hình thành phát triển nấm Cordyceps militaris Chúng lựa ựa chọn ch TN1 chất bảnn cho nuôi tr trồng thử nghiệm thí nghiệm ệm tiếp ti theo nghiên cứu ảnh hưởng ccường độ sáng đến khả hình ình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps m militaris phần 2.4.3.2, chúng úng thu kết bảng 3.6 dướ ới đây: Bảng 3.6:Kết ết ảnh hưởng cường độ chiếuu sáng tới ssự phát triển quảả thể chủng nấm Cordyceps militaris CTTN Cường độ ánh sáng(lux) Thời gian để bình hệ sợi chuyển màu vàng (ngày) Thời gian thể bắt đầu hình thành (ngày) Số lượng ợng thể /bình (quả) Thời gian thu hoạch thể (ngày) CS1 1500 17 22 15 61 CS2 2000 15 20 17 58 CS3 2250 15 21 16 59 Đỗ Thị Bảo 37 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Ngày 70 Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học 61 60 17.5 Quả 59 58 17 17 16.5 50 40 30 20 16 16 17 22 15 15 20 15 15.5 21 15 14.5 10 14 2000 2250 1500 Thời ời gian để bình hệ sợi chuyển màu vàng (ngày) Thời ời gian qu thể bắt đầu hình thành (ngày) Thời ời gian thu hoạch ho thể (ngày) Số ố lượng ượng qu thể /bình (quả) Biểu đồ 35: Ảnh hưởng ng c cường độ chiếu sáng tới phát tri triển thể chủng nấm Cordyceps militaris Từ kết bảng ảng 3.6 biểu đồ 3.5, thấy cư cường độ sáng 1500 lux nấm m phát triển tri chậm nhất, số lượng thể/bình ình 15 qu Khi tăng cường độ sáng lên ên 2000 lux nấm phát triển tốt nhất, số lượng thể/bình đạt cao làà 17 qu Nhưng tiếp tục tăng lên nnấm phát triển yếu Điều ày phù hợp h với đặc điểm loài nấm ĐTHT Nh Như vậy,cường độ sánghiệu ất để nấm hình thành phát triển làà 2000 lux Đỗ Thị Bảo 38 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học Hình 7: Quả thể nấm m Cordyceps militaris công thức cường ng đđộ sáng 2000 lux 3.3.3.Kết ảnh hưởng hư công thức bổ sung dưỡng ng ch chất đến khả hình ình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps militaris Từ kết nghiên ên cứu c trên, lựa chọn chất gạo tẻ trắng cường ng độ chiếu sáng 2000 lux 8h, độộ ẩm nuôi tr trồng 80-90% 90% Tuy nhiên nh nhận thấy chưa có khác biệt ệt rrõ ràng chất tới khảả hình h thành phát triển thểể nấm nấ Cordyceps militaris thểể mọ mọc không đều, phát triển chậm, thờii gian chuy chuyển sang màu vàng kéo dài Do đó, tiếp tục tiến hành ành nghiên ccứu ảnh hưởng công thức ức phối phố trộn phụ gia đến khả hình ình thành phát tri triển thể nấm Cordyceps militaris militaris Để tiết kiệm m chi phí, llựa chọn loại chất nuôi trồng ồng cơm gạo tẻ trắng đem phối trộn ộn th thêm phụ gia khác nhằm tìm ìm công thức phối trộn hiệu ất Tiến hành ành thí nghiệm nghi nói phần 2.4.3.3, kết ết qu thu bảng 3.7 đây: Bảng 3.7:Kết ảnh hưởng hư công thức bổ sung dưỡng chấtt đến khả hình thành phát triển tri thể nấm Cordyceps militaris CTTN PT1 Công thức phối trộn phụ gia 85%CCC+ 15% cám gạo Đỗ Thị Bảo Thời gian qu thể bắt đầu đ hình thành (ngày) Số lượng thể /bình (quả) 17 15 Thời Khối gian thu lượng hoạch thể tươi/ thể bình (g) (ngày) 62 39 14,8 Đặặc điểm thể Dài 6,0 6,0-6,5cm, mập, màu vàng nhạt CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội PT2 PT3 85%CCC+ 15% bột ngô 85%CCC+ 15% bột nhộng tằm Quả Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học 18 15 60 15,2 15 18 59 16,4 18.5 18 17.5 17 16.5 16 15.5 15 14.5 14 13.5 18.5 18 17.5 17 16.5 16 15.5 15 14.5 14 13.5 85%CCC+ 85%CCC+ 85%CCC+ 15% cám 15% bột ngô 15% bột gạo nhộng tằm Dài 6,5-7,0cm, mập, màu vàng cam Dài 6,8 6,8-7,2cm, mập, màu vàng cam Ngày Số lượng thể /bình (quả) Thời gian thể bắt đầu hình thành (ngày) ng ccủa công thức phối trộn phụ gia đếnn kh khả hình Biểu đồ 3.6: ảnh hưởng thành phát triển tri thể nấm Cordyceps militaris Từ bảng kếtt 3.7 biểu đồ 3.6, thấyy công th thức phối trộn với nhộng tằm cho kết ết qu tốt thể qua thờii gian hhình thành thể ngắn (15 ngày), ày), số s lượng thể/bình cao nhấtt (18 quả) Công thức phối trộn với cám gạo ạo bột ngô nấm phát triển chậm hơn, ơn, ssố lượng thể/bình công thức th 15 Chúng lựaa chọn bbổ sung bột nhộng tằm cho thành ành phần ph môi trường tối ưu Đỗ Thị Bảo 40 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học B A Hình 8: Quả thể nấm Cordyceps militaris công thức PT3 sau 40 ngày (A) 50 ngày (B) nuôi cấy 3.4 Kết đánh ánh giá hoạt ho tính sinh học cặn chiết củ chủng nấm Cordyceps militaris hai môi trường tr nuôi cấy rắn lỏng ng Từ nghiên cứu ứu tr lựa chọn hai môi trư ường nuôi cấy rắn (CR) lỏng làà (CL), tiến ti hành ành lên men nuôi trồng tr điều kiện tối ưu sau thời ời gian ph phù hợp tiến hành ành ngâm chiết chi dung môi ethanol etylaxetat Cô cất c chân không thu cặnn chiết l CL CR Nhằm đánh giá hoạt ạt tính sinh học h chủng nấm Cordyceps militaris hai loại môi trường ng nuôi cấy cấ khác Hoạtt tính kháng vi sinh vật v kiểm định (VSVKĐ) cặn chiết CL vàà CR c etylaxetat ethanol từ hai môi tr trường nuôi cấy tối ưu thử hoạt hoạ tính kháng loại VSVKĐ giếng ếng vi lượng l 96 giếng Bảng 3.8 thểể hoạt ho tính kháng VSVKĐ cặn ặn chi chiết Kết trình ình bày bảng cho thấy 022 ccặn chiết thể hoạtt tính kháng vi sinh vật v với nồng độ ức chế tối ối thiể thiểu tương đối cao Đỗ Thị Bảo 41 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà Nội N Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học 02 mẫu biểu u hi hoạt tính kháng vi khuẩn E.coli vvới nồng độ 200 CR 400 CL P aeruginosa 200 (µg/ml) 02 cặn c chiết biểu hoạt ạt tính kháng A niger vvà F oxysporum lần ần lượt l 100 200(µg/ml), biểu bi hoạt tính với chủng nấm m men Bảng 3.8:Hoạtt tính kháng vi sinh vật v kiểm định củaa ccặn chiết Nồng độ ức chế tối thiểu VSVKĐ,, MIC (µg/ml) Kí Vi khuẩn Vi khuẩn Gr (-) Gr (+) STT hiệu mẫu E coli P aeruginos a B S Nấm mốc A subtilis aureus niger F Nấm men C S oxyspor albic cerevisia um ans e CR 200 400 (-) (-) 100 200 ((-) (-) CL 400 400 (-) (-) 100 200 ((-) (-) Hoạt tính chống ng oxy hóa c cặn chiết lên men chủng ủng nấm n 02 cặn chiết t CL v CR thu từ nuôi i cấy c chủng nấm hai mô ôi trường khác nhau, c thử th nghiệm hoạt tính chống ng oxy hóa hệ h DPPH Kế ết quảđược thể bảng ng 3.9 Bảng 3.9: Hoạtt tính ch chống oxy hóa dịch chiết chủủng nấm TT Kí hiệu mẫu ẫu Đỗ Thị Bảo Scavenging capacity 42 SC50 K Kết CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học (SC, %) (µg/ml) Chứng (+) 80,87 ± 0,13 20,7 Dươ ương tính Chứng (-) 0,0 ± 0,0 - Âm tính CR 66,1±0,5 131,8 Dươ ương tính CL 63,4±0,08 138,3 Dươ ương tính Hoạt tính chống ng oxy hóa c 02 mẫu dịch chiết đượcc xác đđịnh dựa khả bẫy gốc tự DPPH ccủa mẫu thử Kết thử nghiệm trình bày bảng ng 3.8 cho thấy, 02 mẫu có biểu hiệện có hoạt tính chống oxy hóa, ưng tươ tương đối thấp nồng độ mứcc trung bình, vvới giá trị SC50 cao Kết hoạtt tính gây độc độ dòng tế bào ung thư Kết hoạtt tính gây độc tế bào 02 cặn chiết xác định tr dòng tế bào ung thư thựcc nghiệm nghiệ thể bảng 3.10 Bảng 3.10:Hoạạt tính gây độc tế bào cặn chiết chủng ng nnấm STT Ký hiệu ệu mẫu mẫ CR Đỗ Thị Bảo Dòng tế bào Cell survival (%) Hep-G2 RD 25,3±0,4 43 22,7±0,3 Kết ết lu luận Dương ng tính ddòng CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội CL Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học 64,1±0,05 2,7±0,02 Dương ng tính ddòng Theo đó, có cặnn chiết chi CR thể hoạt tính gây độc vớii 02 dòng ttế bào ung thư thử nghiệm m ung thư gan (Hep-G2)và ung thư mô liên kết k (RD) Cặn chiết CL có khả gây độc với dòng tế bào ung RD Đỗ Thị Bảo 44 CNSH 12 12-02 [...]... adenosine và cordycepin của chủng ủng nnấm trên hai môi trường nghiên cứu ứu rắn rắ và lên men lỏng 2.3 Mụcc tiêu nghiên cứu c Đánh giá hiệu u suất hình thành quả thể trên môi trường rắn ắn và v môi trường lỏng Nghiên cứuu các yếu yế tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát tri triển của hệ sợi và quả thể nấm, tìm ìm môi tr trường nuôi cấy tối ưu trên hai lo loại môi trường rắn và lỏng Xác định hoạtt tính sinh. .. ánh sáng, thờii gian vvà độ ẩm, tới hình thành và phát triển ển qu quả thể của Cordyceps militaristrên trên hai môi tr trường rắn và lỏng Nuôi cấy, lên ên men trên môi trường tr tối ưu đã nghiên cứu là rắn ắn vvà lỏng Tách chiết và đánh giá hoạt ho tính sinh học (Hoạtt tính kháng vi sinh vật, v hoạt tính gây độc tế bào, ào, hoạt ho tính chống oxy hóa), của chủng ng nấ nấm Cordyceps militaris Xác định... hệ sợi chủng nấm Cordyceps militaris militaristrên đĩa thạch nh môi tr trường phù hợp dùng để nhân giống cấp ấp 2 ch chủng nấm - Xác định Cordyceps militaris - Nghiên cứu thành ành phần ph môi trường nuôi cấy tối ưuu trên môi tr trường lỏng - Nghiên cứu ảnh hưởng h của cơ chất đến khả năng hình ình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường rắn - Nghiên cứu ảnh hưởng h của... ối rắn rắ 12 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học Thử hoạt tính sinh học nh căn chiết từ dịch nuôi cấy của chhủng nấm Hình 1: Quy trình thu nhận Cordyceps militaris 2.4.6 Xác định hoạtt tính sinh học h của chủng nấm Cordyceps militaris Hoạt tính kháng vi sinh vật v kiểm định (VSVKD) (Antimicrobial activity) Đánh giá hoạt ạt tính kháng VSVKD của c các mẫu chiết ết được đ tiến hành trên... độ tới thời gian sinh trưởng ng và phát triển tri của chủng nấmCordyceps Cordyceps militaris Bình môi trường ờng PDA có hàm lượng đường và pepton ttối ưu được nghiên cứu từ thí nghiệm nghiệ trên, được cấy giống vào nuôi cấy ấy tại tạ các nhiệt độ khác nhaulà 20, 25, 30, 35ºC 35 Theo dõi hình thái, màu sắc và sự ự phát tri triển của sinh khối nấm nấm trên ên các môi trường tr So sánh và tìm ra nhiệt... đến sự sinh trưởng và phát triển cũng như ư hoạt ho tính sinh học sinh ra từ môi trường ờng ccơ bản, và tiến hành thay đổi các thành ành phần ph nitơ và nguồn cacbon cũng ng nh như các yếu tố khoáng, tìm ra thành ph phần môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng ởng và v phát triển 2.4.2.1 Ảnh hưởng củ ủa nguồn cacbon tới khả năng hình ình thành và phát triển của chủng nấm Cordyceps militaris Giống nấmCordyceps... trên 3 môi trường và kết luận ận về v môi trường phù hợp nhất trong nhân gi giống cấp 1 chủng nấm Cordyceps militaris militaris 2.4.2 Nghiên cứu u thành phần ph môi trường nuôi cấy chủng nấấm Cordyceps militaristrên môi trườ ờng lỏng Song song với ới việc việ nghiên cứu nuôi trồng trên cơ chất ất rắ rắn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứu nuôi trồng tr trên môi trường lỏng Việcc nuôi trồng tr trên cơ... phát triển và ngày 12 mới m mọc kín hộp nồng nuôi cấy Từ những kết ết quả qu được ghi lại chúng tôi khẳng định, PDA là l môi trường thích hợp dùng ùng để đ nhân giống cấp 2 chủng nấm Cordyceps militaris militaris Vì trên môi trường này, ày, khuẩn khu lạc nấm phát triển ưu thế hơ ơn môi trường Czapek – Dox và SDA MT1 MT2 MT3 Hình 2: Hệ sợi nấm Cordyceps militaris trên các môi trường ng MT1, MT2 và MT3... cho sự s phát triển của chủng nấm, dải pH lựa chọn thử nghiệm từ 5, 6, 7, 8 Theo dõi hình thái, màu sắc s và sự phát triển ccủa sợi nấm trên các môi trường ng So sánh và tìm ra pH thích hợp nhấtt cho sự phát triển tri của chủng nấm 2.4.3 .Nghiên cứu kỹ thuật thu nuôi trồng tạo quả thể nấm Cordyceps militaris trên môi trường rắn Trong công nghệệ nuôi cấy quả thể nấm Cordyceps militaris giai đoạn tạo thành... rất dài và đòi hỏi độ ẩm phòng òng nuôi rất khắt khevà hiệu suấtt sinh hoạt hoạ tính sinh học không cao, nuôi cấy trên ên môi tr trường lỏng là lựa chọn hợp ợp lý cho nuôi cấy c vớii quy mô công nghiệp vvà thời gian Đỗ Thị Bảo 15 CNSH 12 12-02 Viện Đại học Mở Hàà N Nội Khoa Công Nghệ Ngh Sinh Học ngắn hơn rất nhiều Trên ên cơ c sở đó chúng tôi tiến hành ành nghiên ccứu thành phần môi trường nuôi cấy ấy