ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Như Quỳnh NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI ADN VÙNG PROMOTER THUỘC GEN MMP-9 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Trịnh Hồng Thái TS Đỗ Minh Hà Hà Nội – Năm 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trịnh Hồng Thái, người thầy quan tâm, tận tình bảo, hướng dẫn suốt trình học tập thực luận văn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc giúp đỡ nhiệt tình, ý kiến đóng góp quý báu dẫn tận tình TS Đỗ Minh Hà suốt trình thực hoàn thành luận văn Trong trình học tập, làm việc thực luận văn, nhận giúp đỡ ThS Phạm Thị Bích, ThS Nguyễn Thị Tú Linh, ThS Lê Lan Phương bạn sinh viên làm việc Phòng Proteomics Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein , trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Trong trình thực luận văn, nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ cán nhân viên thuộc khoa Tế bào Giải phẫu bệnh, bệnh viện K, Hà Nội; khoa Giải phẫu bệnh, bệnh viện Việt Đức, Hà Nội; khoa sàng lọc máu Viện Huyết học truyền máu Trung ương Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình làm luận văn Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ, động viên bên suốt thời gian qua Hà Nội, tháng năm 2015 Học Viên Nguyễn Thị Nhƣ Quỳnh MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 Khái quát ung thƣ đại trực tràng Error! Bookmark not defined 1.1.1 Ung thƣ đại trực tràng Error! Bookmark not defined 1.1.2 Nguyên nhân gây ung thƣ đại trực tràngError! Bookmark not defined 1.1.3 Chẩn đoán điều trị bệnh Error! Bookmark not defined 1.1.4 Các giai đoạn UTĐTT Error! Bookmark not defined 1.2 Matrix Metalloproteases (MMP) Error! Bookmark not defined 1.2.1 Khái quát chung họ Matrix Metalloprotease (MMPs) Error! Bookmark not defined 1.2.2 Vai trò họ Matrix MetalloproteinaseError! Bookmark not defined 1.2.3 Một số nghiên cứu họ MMP ung thƣ đại trực tràng Error! Bookmark not defined 1.2.4 Một số nghiên cứu đa hình đơn nucleotide gen MMP Error! Bookmark not defined 1.2.5 Một số nghiên cứu đa hình vùng promoter gen MMP-9 Error! Bookmark not defined CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁPError! Bookmark not defined 2.1 Nguyên liệu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp tiến hành nghiên cứu 22 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số từ mô Error! Bookmark not defined 2.2.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu Error! Bookmark not defined 2.2.3 Khuếch đại đoạn gen vùng promoter gen MMP-9 phƣơng pháp PCR 24 2.2.4 Phƣơng pháp RFLP Error! Bookmark not defined 2.2.5 Điện di 26 2.2.6 Tinh sản phẩm PCR Error! Bookmark not defined 2.2.7 Giải trình tự trực tiếp Error! Bookmark not defined 2.2.8 Nhân dòng phân tử 28 2.2.9 Xử lý số liệu tính toán thống kê 32 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Kết phân tích biến đổi gen MMP-9 từ mẫu mô bệnh nhân UTĐTT 33 3.1.1 Kết phân tích biến đổi gen MMP-9 kỹ thuật PCR-RFLP 33 3.1.2 Kết giải trình tự trực tiếp nhân dòng 35 3.2 Kết phân tích biến đổi ADN gen MMP-9 từ mẫu máu 42 3.2.1 Kết khuếch đại đoạn gen có chứa vị trí biến đổi promoter gen MMP-9 42 3.2.2 Kết phân tích RFLP đoạn gen chứa biến đổi vùng promoter gen MMP-9 43 3.3 Phân tích mối liên hệ biến đổi C-1562T với số đặc điểm bệnh học bệnh nhân UTĐTT 44 3.4 Phân tích biến đổi C-1562T bệnh nhân UTĐTT ngƣời bình thƣờng 50 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Hình ảnh đại trực tràng Error! Bookmark not defined Hình 2: Các giai đoạn bệnh UTĐTT Error! Bookmark not defined Hình 3: Cấu trúc vùng MMP Error! Bookmark not defined Hình 4: Chu trình nhiệt thực phản ứng PCR 25 Hình 5: Vector plasmid pJET1.2 Error! Bookmark not defined Hình 6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR promoter gen MMP-9 từ ADN tổng số tách từ mô 33 Hình 7: Hình ảnh điện di kết cắt enzyme sản phẩm PCR từ ADN tổng số mô 34 Hình 8: Hình ảnh kết giải trình tự trực tiếp 36 Hình 9: Hình ảnh khuẩn lạc sau plasmid đƣợc biến nạp vào E Coli DH5α 37 Hình 10: Hình ảnh điện di ADN plasmid đƣợc tách từ E.Coli DH5α 38 Hình 11: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ plasmid sản phẩm cắt enzyme giới hạn 39 Hình 12: Kết phân tích trình tự plasmid 40 Hình 13: Kết so sánh trình tự mẫu không mang biến đổi với trình tự tham khảo sử dụng chƣơng trình BLAST 41 Hình 14: Kết so sánh trình tự mẫu mang biến đổi với trình tự tham khảo sử dụng chƣơng trình BLAST 41 Hình 15: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ mẫu máu thƣờng bệnh 42 Hình 16: Hình ảnh cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR từ mẫu máu ngƣời bình thƣờng cho máu mẫu máu bệnh nhân UTĐTT 43 Hình 17: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RE mẫu mô u-mô lân cận u mẫu máu bệnh nhân 44 Hình 18: Biểu đồ phân bố biển đổi C-1562T theo vị trí môError! Bookmark not defined Hình 19: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo vị trí ung thƣ 46 Hình 20:Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo độ tuổi 47 Hình 21: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T theo giai đoạn TNM 48 Hình 22: Biểu đồ phân bố biến đổi C-1562T bệnh nhân UTĐTT ngƣời bình thƣờng 50 DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các giai đoạn bệnh TNM tỉ lệ sống sót giai đoạn bệnh khác Error! Bookmark not defined Bảng 2: Bảng phân loại nhóm họ MMP (ở ngƣời)Error! Bookmark not defined Bảng 3: Hoạt động ảnh hƣởng họ MMP tiến triển giai đoạn ung thƣ Error! Bookmark not defined Bảng : Các hóa chất đƣợc sử dụng nghiên cứuError! Bookmark not defined Bảng 5: Các thiết bị đƣợc sử dụng nghiên cứuError! Bookmark not defined Bảng 6: Trình tự cặp mồi đƣợc sử dụng phản ứng PCRError! Bookmark not defined Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR Error! Bookmark not defined Bảng 8: Thành phẩn phản ứng cắt sử dụng enzyme giới hạn SphI Error! Bookmark not defined Bảng 9: Thành phần phản ứng tạo đầu Error! Bookmark not defined Bảng 10: Thành phần phản ứng chèn sản phẩm PCR vào vector Error! Bookmark not defined Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi MP9 Error! Bookmark not defined Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với cặp mồi pJet1.2 Error! Bookmark not defined Bảng 13: Phân bố biến đổi C-1562T promoter gen MMP-9 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo số đặc điểm bệnh học bệnhError! not defined.5 Bookmark Bảng 14: Tần suất xuất alen C T đoạn ADN có chứa biến đổi promoter gen MMP-9 bệnh nhân ung thƣ đại trực tràng theo số đặc điểm bệnh học bệnh 49 Bảng 15: Tần suất xuất alen C T đoạn ADN promoter gen MMP-9 mẫu mô bệnh nhân UTĐTT mẫu máu ngƣời bình thƣờng 50 Bảng 16: Tần suất xuất alen C T đoạn ADN promoter gen MMP-9 mẫu máu bệnh nhân UTĐTT mẫu máu ngƣời bình thƣờng 51 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid Deoxyribo Nucleic AFAP Actin Filament Associated Protein AJCC Ủy ban ung thƣ Mỹ - American Joint Committee on Cancer COPD Bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính - Chronic Obstructive Pulmonary Disease cs Cộng ECM Chất ngoại bào - Extralcellular Matrix EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid EtBr Ethidium Bromide FAP Đa polyp tuyến gia đình - Familial adenomatous polyposis FOBT Kiểm tra máu ẩn phân - Fecal occult blood test FISH Lai huỳnh quang chỗ - Fluorescence in situ hybridization HNPCC Ung thƣ đại trực tràng di truyền không đa polyp - Hereditary Non-Polyposis Colorectal Cancer MMP Matrix Metalloproteinase NK Giết tự nhiên – Nature killer PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp - Polymerase Chain Reaction RFLP Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn - Restriction Fragment Length Polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TBE Tris-Borate-EDTA TGF Yếu tố sinh trƣởng kích thích chuyển dạng – Transforming growth factor TIMP Tissue Inhibitor of Metalloproteinase UTĐTT Ung thƣ đại trực tràng VEGF Yếu tố tăng trƣởng nội mô mạch máu – Vascular Endothelial Growth Factor MỞ ĐẦU Ung thƣ đại trực tràng (UTĐTT) loại ung thƣ phổ biến đứng đầu loại ung thƣ đƣờng tiêu hóa nƣớc giới Tại Việt Nam nƣớc châu Á, UTĐTT xếp thứ tƣ nam giới (sau ung thƣ gan, phổi dày) thứ ba nữ giới (sau ung thƣ cổ tử cung ung thƣ vú) Từ năm 2007 đến 2011, Việt Nam, tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, ghi nhận 3557 ca mắc bệnh UTĐTT (chiếm 10,74% tổng số ca mắc bệnh ung thƣ) [52] UTĐTT loại ung thƣ có độ ác tính cao đồng nghĩa với tỷ lệ tử vong cao Tại Mỹ, năm 2013 ghi nhận tới 142820 ca UTĐTT đƣợc chẩn đoán, có 50830 ca có khả dẫn đến tử vong sớm (chiếm 35,59% trƣờng hợp mắc UTĐTT), năm 2014 thống kê có 136830 ngƣời mắc UTĐTT 50310 trƣờng hợp tử vong (chiếm 36,77% trƣờng hợp mắc UTĐTT) [53] UTĐTT kết nhiều trình với giai đoạn phức tạp biến đổi tế bào bình thƣờng thành tế bào ung thƣ liên quan tới gen gây ung thƣ, gen ức chế khối u vi môi trƣờng khối u Tƣơng tác mô đệm biểu mô đóng vai trò quan trọng sinh bệnh học ung thƣ Liên kết tế bào ung thƣ ác tính với mô đệm xung quanh (nguyên bào sợi, tế bào nội mô tế bào viêm) tảng cho phát triển di ung thƣ Ngoài tế bào mô đệm bên khối u, ECM (extracellular matrix – chất ngoại bào) có tác động quan trọng tiến triển ung thƣ ECM đƣợc cấu tạo chủ yếu sợi protein liên kết cacbohydrat kết hợp với số chất vô hữu khác ECM thực loạt chức việc giúp tế bào liên kết với tạo nên mô định thu nhận thông tin Tế bào ung thƣ tác động vào ECM làm thay đổi cấu trúc ECM, từ tế bào ung thƣ dễ dàng di chuyển từ u nguyên phát sang vị trí khác Các protein ECM đóng vai trò quan trọng tăng sinh di tế bào ung thƣ, protease khác điều khiển tu sửa nhƣ phân giải ECM Một nhóm cụ thể protease matrix metalloproteinase (MMP) – enzyme phân giải protein có chứa kim loại ngày đƣợc nghiên cứu rộng rãi giới Việt Nam [18] TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Thị Ngọc Hà (2010), “Vai trò Matrix Metalloproteinae -2 yếu tố ức chế mô (Tissue inhibitor of Metalloproteinase-2) lâm sàng bệnh ung thƣ vòm mũi họng”, Tạp chí Y Học TP Hồ Chí Minh,14(4), tr 115-122 Lê Thị Huyền Trang (2012), “Đột biến gen Matrix Metalloproteinase bệnh nhân bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 16(1), tr 54-57 Tài liệu Tiếng Anh Anon (2010), “Colorectal Cancer Facts & Figures 2008-2010.” Bendardaf R., Buhmeida A., Ristamaki R., Syrjanen K., Pyrhonen S (2007), “MMP-1 (collagenase-1) Expression in Primary Colorectal Cancer and Its Metastases.” Scandinavian Journal Of Gastroenterology, 42(12), pp 1473–78 Bode W., Maskos K (2001), “Structural Studies on MMPs and TIMPs”, Methods In Molecular Biology (Clifton, N.J.), 15, pp.145–77 Brabletz T., Jung A., Dag S., Hlubek F., Kirchner T (1999), “ΒCatenin Regulates the Expression of the Matrix Metalloproteinase-7 in Human Colorectal Cancer”, The American Journal of Pathology, 155(4), pp.1033–38 Brown L M., Fox H L., Hazen S A., Rannels S R (1997), “Role of the matrixin MMP-2 in muticellualar organization of adipocytes cultered in basement membrane components”, Am J Physiol., 272, pp.937–947 Checa M., Pardo A (2008), “MMP-1 Polymorphisms and the Risk of Idiopathic Pulmonary Fibrosis”, Human Genetics, 124(5), pp 465–72 Clapper M L., Hensley H H., Cooper H S (2011), “Detection of Colorectal Adenomas Using a Bioactivatable Probe Specific for Matrix Metalloproteinase Activity 1”, Neoplasia, 13(8), pp 685–91 10 Dragutinovic V., Radojic N., Petronijevic N (2011), “Matrix Metalloproteinase-2 (MMP-2) and -9 (MMP-9) in Preoperative Serum as Independent Prognostic Markers in Patients with Colorectal Cancer”, Molecular And Cellular Biochemistry, 355(1-2), pp 173–78 11 Ekbom A., Helmick C., Zack M., Adami H O (1990), “Increased Risk of Large-Bowel Cancer in Crohn’s Disease with Colonic Involvement”, Lancet, 336(8711), pp 357–59 12 Elander N., Söderkvist P., Fransén K (2006), “Promoter Polymorphisms in Colorectal Cancer”, Anticancer Research, 26, pp 791-796 13 Fisher C., Power E A., Petzold G., Poorman R (1994), “Interstitial collage-nase is required for angiogenesis in vivo”, Developmental Biology, 162, pp 499-510 14 Fukuda Y., Masuda Y., Kishi J., Hashimoto Y., Hayakawa T., Nogawa H., (1998), “The role of interstitial collagens in cleft formation of mouse embryonic subman-dibular gland during initial branching”, Development, 103, pp 259–267 15 Giacosa A., Franceschi S., Vecchia C L (1999), “Energy Intake, Overweight, Physical Exercise and Colorectal Cancer Risk”, European Journal Of Cancer Prevention, 8(1), pp 53–60 16 Gialeli C., Achilleas D T., Nikos K K (2011), “Roles of Matrix Metalloproteinases in Cancer Progression and Their Pharmacological Targeting”, The Federation of European Biochemical Societies Journal, 278(1), pp 16–27 17 Hiraoka N., Allen E., Apel I J., Gyetko M R., Weiss S J (1998), “Matrix metalloproteinase regulate neovasculariza-tion by acting as pericellular fibrinolysins”, Cell, 95, pp 365–377 18 Hua H., Minjing L., Ting L., Yancun Y., Yangfu J (2011), “Matrix Metalloproteinases in Tumorigenesis: An Evolving Paradigm”, Cellular And Molecular Life Sciences, 68(23), pp 3853–68 19 Ikeda K., Ihara K., Yamaguchi K (2008), “Genetic analysis of MMP gene polymorphisms in patients with Kawasaki disease”, Pediatric Research, 63, pp 182–185 20 Jafari M., Pirouzi A., Mohsenzadeh M., Kusari A A., Hajihosseini S (2014), “Association of MMP-9 -1562 C/T Single Nucleotide Polymorphism with the Susceptibility to Lung Cancer Disease in South Iranian Population”, British Journal Of Medicine & Medical Research, 4(13), pp 2294-2302 21 Joos L., He J., Shepherdson M (2002), “The Role of Matrix Metalloproteinase Polymorphisms in the Rate of Decline in Lung Function”, Human Molecular Genetics, 11(5), pp 569–76 22 Kohno S., Sekine I., “Expression of Matrix Metalloproteinase-1 in Human Colorectal Carcinoma”, Modern Pathology, 11, pp 1925–33 23 Langenskiold M., Holmdahl L., Falk P (2005), “Increased Plasma MMP-2 Protein Expression in Lymph Node-Positive Patients with Colorectal Cancer”, International Journal Of Colorectal Disease, 20(3), pp 245–52 24 Leeman M F., Mckay J A., Murray G I (2002), “Matrix Metalloproteinase 13 Activity Is Associated with Poor Prognosis in Colorectal Cancer”, Journal of Clinical Pathology, 55, pp 758–762 25 Maurel J., Nadal C., Gallego R (2007), “Serum Matrix Metalloproteinase Levels Identifies Poor Prognosis Advanced Colorectal Cancer Patients”, International Journal Of Cancer: Journal International Du Cancer, 121(5), pp 1066–71 26 Meyerhardt J., Holmes M.D (2006), “Physical Activity and Survival after Colorectal Cancer Diagnosis”, Journal Of Clinical Oncology: Official Journal Of The American Society Of Clinical Oncology, 24(22), pp 3527–34 27 Ming-yii H., Hui-jen C., Fu-yen C , Ming-je Y (2010), “MMP13 is a Potential Prognostic Marker for Colorectal Cancer”, Oncology Report, 24, pp 1241–47 28 Minematsu N., Nakamura H., Tateno H (2001), “Genetic polymorphism in matrix metalloproteinase-9 and pulmonary emphysema”, Biochemial And Biophysical Research Communications, 289(1), pp 116-9 29 Moskal A., Norat T., Ferrari P., Riboli E (2007), “Alcohol Intake and Colorectal Cancer Risk: A Dose-Response Meta-Analysis of Published Cohort Studies”, International Journal Of Cancer: Journal International Du Cancer, 120(3), pp 664–71 30 Pannu H., Kim D., Guo D (2006), “The Role of MMP-2 and MMP-9 Polymorphisms in Sporadic Intracranial Aneurysms”, Journal Of Neurosurgery, 105(3), pp 418–23 31 Peng B., Cao L., Wang D (2010), “Meta-Analysis of Association between Matrix Metalloproteinases 2, and Promoter Polymorphisms and Cancer Risk”, Mutagenesis, 25(4), pp 371–79 32 Potter J (1996), “Nutrition and Colorectal Cancer”, Cancer Causes & Control, 7(1), pp 127–46 33 Raimondi S., Page P (2008), “Smoking and Colorectal Cancer”, Journal of the American Medical Asociation, 300(23), pp 2765–78 34 Reis S D., Pontes J., Villanova F (2009), “Genetic polymorphisms of matrix metalloproteinase: Susceptibility and prognostic implication for prostate cancer’, The Journal Of Urology, 181, pp 2320-25 35 Sadeghi M., Motovali-bashi M., Hojati Z (2009), “MMP-9 Promoter Polymorphism Associated with Tumor Progression of Breast Cancer in Iranian Population”, International Journal Of Integrative Biology, 6(1), pp 33–37 36 Samad A K A., Taylor R S., Marshall T., Chapman M S (2005), “A Meta-Analysis of the Association of Physical Activity with Reduced Risk of Colorectal Cancer.” Colorectal Disease,7(3), pp 204–13 37 Sato T., Foged N T., Delaisse J M (1998), “The migration of prurified osteoclasts through collagen is inhibited by matrix metalloproteinase inhibitors”, Journal Bone Mineral Research, 13, pp 59–66 38 Shi H., Xu J M (2006), “Transfection of Mouse Macrophage Metalloelastase Gene into Murine CT-26 Colon Cancer Cells Suppresses Orthotopic Tumor Growth, Angiogenesis and Vascular Endothelial Growth Factor Expression”, Cancer Letters, 233(1), pp 139–50 39 Singh R., Srivastava P., Srivastava A., Mittal R D (2010), “Matrix Metalloproteinase (MMP-9 and MMP-2) Gene Polymorphisms Influence Allograft Survival in Renal Transplant Recipients”, Nephrology, Dialysis, Transplantation, 25(10), pp 3393–3401 40 Snoek-van Beurden P A M., Von den Hoff J W (2005), “Zymographic Techniques for the Analysis of Matrix Metalloproteinases and Their Inhibitors”, BioTechniques, 38(1), pp 73–83 41 Sunami E., Tsuno N., Osaka T., Saito S., Kityama J., Tomozawa S., Tsuruo T., Shibata Y., Muto T., Nagawa H (2000), “MMP-1 Is a Prognostic Marker for Hematogenous Metastasis of Colorectal Cancer”, The Oncologist, 5, pp 108–14 42 Uzui H., Lee J., Shimizu H., Tsutani H., Ueda T (2000), “The role of protein-tyrosine phosphorylation and gelatinase production in the migration and proliferation of smooth muscle cells”, Atherosclerosis, 149, pp 51–59 43 Toshimichi A., Mitsuhiro T., Shaoqiang C., Norihiro T., Taro K., Motoki A., Osamu T., Masaki M., Jun-Ichi H., Tetsuya M., Satoshi K (2008), “Prognostic Values of Matrix Metalloproteinase Family Expression in Human Colorectal Carcinoma”, The Journal Of Surgical Research, 146(1), pp 32–42 44 Visse R., Nagase H (2003), “Matrix Metalloproteinases and Tissue Inhibitors of Metalloproteinases: Structure, Function, and Biochemistry”, Circulation Research, 92(8), pp 827–39 45 Vu T H., Werb Z (2000), “Matrix Metalloproteinases: Effectors of Development and Normal Physiology”, Gene & Development, 14, pp 2123–33 46 Walker J M (2001), “Matrix Metalloproteinase Protocols” 47 Xing L L (2007), “Matrix Metalloproteinase-9 -1562C > T Polymorphism May Increase the Risk of Lymphatic Metastasis of Colorectal Cancer”, World Journal Of Gastroenterology, 13(34), pp 4626–29 48 Xu Z., Shi H., Li Q (2008), “Mouse Macrophage Metalloelastase Generates Angiostatin from Plasminogen and Suppresses Tumor Angiogenesis in Murine Colon Cancer”, Oncology Reports, 20(1), pp 81–88 49 Yang W., Arii S., Rivas M G (2001), “Human Macrophage Metalloelastase Gene Expression in Colorectal Carcinoma and Its Clinicopathologic Significance”, Cancer, 91(7), pp 1277–83 50 Yang Y., Hennessy S., Lewis J (2004), “Insulin Therapy and Colorectal Cancer Risk among Type Diabetes Mellitus Patients”, Gastroenterology, 127(4), pp 1044–50 51 Zhou M., Huang S., Wan H (2004), “Genetic Polymorphism in Matrix Metalloproteinase-9 and the Susceptibility to Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Han Population of South China”, Chinese Medical Journal, 117(10), pp 1481–84 Website: 52 http://www.benhvienk.com 53 http://www.cancer.gov 54 http://www.cancer.org 55 http://www.parkwaycancercentre.com 56 http://www.ungbuouvietnam.com 57 http://www.thermoscientificbio.com IX