THƯ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH LÊ THỊ HUỆ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CUA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN: PGS.TS ĐỒNG THỊ THANH THU TP.HCM, 2010 MỞ ĐẦU Vi sinh vật nhóm sinh vật có số lượng nhiều có khả chuyển hóa vật chất thiên nhiên mạnh Hiện người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật ứng dụng nhiều đời sống, sản xuất So với nguồn khai thác enzyme từ động vật thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật có nhiều ưu điểm hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, sản xuất hoàn toàn theo qui mô công nghiệp Nhiều enzyme khai thác từ vi sinh vật tập trung nghiên cứu có nhiều ứng dụng thời gian qua protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau người ta ý nhiều loại enzyme khác chitinase, enzyme thủy phân chitin Chitin polymer sinh học so sánh với polysaccharide cellulose Chitin phân bố rộng rãi dạng cấu trúc thành tế bào nấm xương tôm cua côn trùng Đây polymer có trọng lượng phân tử cao, không tan nước, chứa đơn phân N-acetyl-glucosamine liên kết liên kết 1,4-β-glucoside Chitin có nhiều công dụng nhiều lĩnh vực y học công nghiệp… Những enzyme có liên quan đến chuyển hóa phân giải chitin nghiên cứu nhiều năm gần Chitin bị phân giải hệ enzyme có tên gọi chung chitinase Enzyme sản xuất tổ chức sống tế bào để phục vụ nhu cầu chức sinh lý chúng Sự phân giải chitin tác động enzyme phụ thuộc vào yếu tố hóa lý (tỉ lệ chất enzyme, pH, nhiệt độ…) Trong nguồn thu nhận chitinase chitinase từ vi sinh vật nguồn quan trọng Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter Streptomyces, chủng nấm sợi thuộc chi Asperillus, Penicillium, Trichoderma, số động vật nguyên sinh Những năm gần có nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase tiềm ứng dụng to lớn enzyme nhiều lĩnh vực khác thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine N-acetyl glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng y học, việc kiểm soát nấm kí sinh trồng…v.v… Vì ứng dụng rộng rãi chitinase trên, mục đích đề tài nhằm nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ số chủng nấm sợi bước đầu khảo sát số ứng dụng enzyme Chúng thực đề tài: Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi có khả tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế phẩm chitinase từ canh trường bước đầu nghiên cứu số ứng dụng chitinase Nhiệm vụ đề tài - Khảo sát khả sinh tổng hợp chitinase vài chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma Chọn chủng nấm sợi sinh tổng hợp chitinase cao để nghiên cứu tiếp - Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng trình sinh tổng hợp chitinase chủng nấm sợi chọn tối ưu hóa phương pháp qui hoạch thực nghiệm - Thu nhận chế phẩm chitinase - Khảo sát điều kiện hoạt động tối ưu chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ chất, thời gian thủy phân chất - Bước đầu thử nghiệm số ứng dụng chế phẩm chitinase từ nấm sợi Thời gian địa điểm nghiên cứu đề tài Thời gian : từ tháng 8/2009 – 7/2010 Địa điểm : Đề tài thực Phòng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI 1.1.1 Khái quát enzyme 1.1.1.1 Cấu trúc [1, 23] Enzyme loại phân tử protein sinh vật tổng hợp nên tham gia xúc tác cho phản ứng sinh học Enzyme có phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, cấu tạo từ L-acid amin liên kết liên kết peptid Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi trung tâm hoạt động enzyme Enzyme gồm hai nhóm: nhóm enzyme cấu tử gồm enzyme có thành phần hóa học protein; nhóm enzyme hai cấu tử gồm enzyme có hai thành phần: phần protein gọi apoenzyme có vai trò xúc tác, phần thứ hai phi protein coenzyme chất hữu đặc hiệu có vai trò thúc đẩy trình xúc tác Ngoài có số kim loại Zn, Cu, Mn, Fe đóng vai trò liên kết enzyme chất trình xúc tác phản ứng, liên kết apoenzyme coenzyme, tham gia trực tiếp vào trình vận chuyển điện tử 1.1.1.2 Cơ chế hoạt động [16, 23] Trung tâm hoạt động enzyme (E) có cấu trúc không gian tương ứng với chất mà chúng xúc tác, phản ứng hình thành trình enzyme tiếp xúc với chất “chìa khóa-ổ khóa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất Quá trình tác động enzyme vào chất để tạo sản phẩm trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với chất (S) nhờ liên kết tạo phức E-S Giai đoạn 2: Khi chất (S) tạo phức với enzyme (E), chất bị thay đổi cấu hình không gian mức độ bền vững liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, giải phóng nguyên vẹn Sản phẩm (P) tạo thành Sơ đồ chế tác động enzyme: E + S  E-S  E + P 1.1.1.3 Phân loại enzyme [16, 23] Có nhiều cách phân loại enzyme, đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc tác enzyme Tại Hội nghị Sinh Hóa học năm 1961 họp Moscow đề bảng phân loại mới, enzyme chia làm lớp chính: - Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hóa hoàn nguyên sinh học) - Transferase (lớp enzyme vận chuyển) - Hydrolase (lớp enzyme thủy phân) - Liase (lớp enzyme phân giải chất không theo đường thủy phân) - Ligase hay Synthetase (lớp enzyme tổng hợp chất) - Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hóa) 1.1.2 Enzyme chitinase [32] 1.1.2.1 Cấu trúc Chitinase [Poly- Beta- 1- – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác thủy giải liên kết 1,4 glucoside C1 C4 hai phân tử Nacetyl Glucosamine liên tiếp chitin Mã số enzyme chitinase EC 3.2.1.14 → Hydrolase → Glycosylase → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase có tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) chitodextrinase, β-poly-Nacetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus) Căn vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 Glycohydrolase 19 Glycohydrolase 20  Họ Glycohydrolase 18 Là họ lớn với khoảng 180 chi, tìm thấy hầu hết loài thuộc Eukaryote, Prokaryote virus Họ bao gồm chủ yếu enzyme chitinase, có enzyme khác chitodextrinase, chitobiase N-acetyl glucosaminidase Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm xoắn α/β cuộn tròn, chúng hoạt động thông qua chế kiểm soát mà đoạn β polymer bị phân cắt tạo sản phẩm β anomer [32] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 tổng hợp từ giống Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens… Hình 1.1 Cấu trúc không gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]  Họ Glycohydrolase 19 Họ gồm 130 chi, thường thấy chủ yếu thực vật, có xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với vòng xoắn hoạt động thông qua chế nghịch chuyển Họ Glycohydrolase 19 bao gồm chitinase thuộc nhóm I, II,IV Hình 1.2 Cấu trúc không gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [69]  Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces người Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), định vị enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành nhóm: Nhóm I: đồng phân enzyme phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua đoạn giàu glycin prolin đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết) Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng gắn kết enzyme chất chitin không cần cho hoạt động xúc tác Nhóm II: đồng phân enzyme phân tử có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein đầu N peptid nhận biết đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase nhóm I Chitinase nhóm II có thực vật, nấm, vi khuẩn Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I II Nhóm IV: đồng phân enzyme chủ yếu có hai mầm, 41-47% trình tự amino acid tâm xúc tác chúng tương tự chitinase nhóm I, phân tử có đoạn giàu cystein kích thước phân tử nhỏ đáng kể so với chitinase nhóm I Nhóm V: dựa liệu trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) giảm nhiều lần trình tiến hóa thực vật bậc cao 1.1.2.2 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase [11] Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- D-glucosaminidase (exochitinase) chitobiase Endochitinase enzyme phân cắt nội mạch chitin cách ngẫu nhiên tạo đoạn olygosaccharides, nghiên cứu từ dịch chiết môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8) Chitin 1,4- - chitobiosidase enzyme phân cắt chitin tạo thành sản phẩm dimer chitobiose, cụ thể enzyme thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ± 0,2) N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) enzyme phân cắt chitin từ đầu cho sản phẩm monomer N-acetyl-D-glucosamine Chitobiase enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine Hình 1.3 Vị trí phân cắt enzyme chitinase [70] Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên nội mạch chitin chitooligomer, sản phẩm tạo thành hỗn hợp polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, chiếm đa số diacetylchitobiose (GlcNAc)2 hoạt tính endochitinase phân cắt thêm Hình 1.4 Cơ chế hoạt động enzyme chitinase Trichoderma [11] Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin chitooligomer mức trùng hợp lớn hay [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu không khử phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt chitooligomer hay chitin cách liên tục từ đầu không khử phóng thích đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc) Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm chất Các oligsaccharide thường thủy phân bên vài vị trí xác định cách ngẫu nhiên Một số enyme chitinase có khả thủy phân trisaccharid, số khác không Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: phân cắt bên tạo disaccharid trisaccharid; phân cắt bên tạo monosaccharid tetrasaccharid Tóm lại chitinase thực chất enzyme cắt ngẫu nhiên Endochitinase, chitobiosidase β –N- acetylhexosaminidase hoạt động chất dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer hoạt động chitin thô thu từ vỏ tôm Chitin vách tế bào nấm chứa chitin chất thích hợp cho endochitinase chitobiosidase -N-acetylhexosaminidase Chitooligomer (GluNAc)3 cao sợi chitin chất loại enzyme -N-acetylhexosaminidase hoạt động chậm việc làm giảm độ đục huyền phù chitin (GlcNAc)2 chất tốt -Nacetylhexosaminidase không chất endochitinase hay chitobiosidase Chính sử dụng để phân biệt hoạt tính endochitinase, chitobiosidase -N- acetylhexosaminidase Sản phẩm sau phân cắt N-acetyl glucosamine 1.1.2.3 Các đặc tính hệ enzyme chitinase [11] * Trọng lượng phân tử Enzyme chitinase tìm thấy thực vật bậc cao tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30kDa (kilodalton) Ở loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa cao khoảng 120kDa Trọng lượng phân tử enzyme chitinase thu nhận từ nấm vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa * Điểm đẳng điện, số Michaelis Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 thực vật bậc cao tảo; pI từ 4,7-9,3 côn trùng, giáp xác, thân mềm cá; pI từ 3,5 – 8,8 vi sinh vật Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml) * Ảnh hưởng nhiệt độ [32, 63] Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg Schnure, 1994; Huang cộng sự, 1996; Bhushan Hoondal, 1998; Wiwat cộng sự, 1999; Bendt cộng sự, 2001) Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase vi sinh vật hoạt động 400C, ngoại trừ chitinase Aspergillus niger hoạt động chất glycol chitin có nhiệt độ tối thích 50OC (Jeuniaux, 1963) Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà enzyme chitinase có giá trị nhiệt độ tối thích khác Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhóm III chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập suối nước nóng cho thấy khả chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C Bendt cộng (2001) phát hoạt tính thủy phân chitin mạnh chitinase từ Vibrio sp Từ 30-450C chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp BG-11 hoạt tính cao 40-600C Lorito (1998) khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Rifai nhận thấy enzyme có khả hoạt động khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C, nhiệt độ tối ưu 400C * Ảnh hưởng pH [32] Giá trị pH tối thích (pHop) hệ enzyme chitinase từ 4-9 enzyme chitinase thực vật bậc cao tảo; hệ enzyme chitinase động vật 4,8- 7,5 vi sinh vật 3,5- 8,0 Theo nhà khoa học, pHop enzyme chitinase có phụ thuộc vào chất sử dụng Đa số enzyme chitinase nghiên cứu có pHop khoảng 5,0 chất glycol chitin nằm khoảng pH kiềm yếu Các nghiên cứu chứng tỏ chitinase hoạt động khoảng pH từ 4,0-8,5 (Morrisey cộng sự, 1976; Wiwat cộng sự, 1999; Bendt cộng sự, 2001) Chitinase nấm hoạt tính cao pH = 5, vi khuẩn pH tối thích 8,0 Theo Bhushan Hoondal (1998), hoạt tính chitinase từ Bacillus sp BG-11 cao pH = 8,5 1.1.2.4 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase [11, 27] Enzyme chitinase diện hầu hết sinh vật Enzyme chitinase tìm thấy vi khuẩn Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus đặc biệt nhóm Streptomycetes Vi khuẩn tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân giải chitin môi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sinh trưởng phát triển Chitinase tạo loài nấm sợi thuộc chi Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia nấm lớn Lycoperdon, Coprinus Enzyme chitinase thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại nấm kí sinh gây bệnh cho trồng Những thực vật bậc cao có khả tạo chitinase thuốc (Nicotiana sp.), cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) đặc biệt số loài tảo biển nguồn cung cấp enzyme chitinase Từ số động vật nguyên sinh, từ mô tuyến khác hệ tiêu hóa nhiều loài động vật không xương ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt thu nhận enzyme chitinase Đối với động vật có xương sống, enzyme chitinase tiết từ tuyến tụy dịch dày loài cá, lưỡng cư, bò sát ăn sâu bọ, dịch dày loài chim, thú ăn sâu bọ Ngoài ra, enzyme chitinase thu nhận từ dịch biểu bì giun tròn suốt trình phát triển dịch tiết biểu bì loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng (cuticun) chúng trình biến thái hay lột xác 1.1.3 Chitin (cơ chất chitinase) 1.1.3.1 Lịch sử nghiên cứu chitin [56] Chitin mô tả lần Braconnot vào năm 1811, nghiên cứu loài nấm Agaricus volvaceus vài loài nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ông thu sản phẩm đặt tên chitin (chitin có nguồn gốc từ Hy Lạp “tunnic” nghĩa lớp vỏ bọc) Hai năm sau Odier bắt đầu ý đến chất, cấu trúc chitin Năm 1843, Lassaige chứng minh chitin có có mặt nitrogen 1.1.3.2 Chitin tự nhiên [30, 57, 58] Chitin polysaccharide phổ biến tự nhiên, polyme sinh học tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật Lượng chitin sản xuất hàng năm giới đứng sau cellulose, chúng tạo trung bình 20g năm/1m2 bề mặt trái đất Trong tự nhiên chitin tồn động vật thực vật Trong giới động vật, chitin thành phần cấu trúc quan trọng lớp vỏ số động vật không xương sống côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác giun tròn Trong giới thực vật, chitin có thành tế bào nấm số tảo Chlorophiceae Chitin tồn tự nhiên dạng tinh thể, cấu trúc gồm nhiều phân tử nối với liên kết hydro tạo thành hệ thống sợi Trong tự nhiên, chitin tồn trạng thái tự mà gần luôn liên kết dạng phức hợp chitin- protein Điều dẫn đến đề kháng với hóa chất enzyme thủy phân, gây nhiều khó khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng Tùy thuộc vào đặc tính thể thay đổi giai đoạn sinh lý mà loài thấy thay đổi lượng chất chitin Trong động vật thủy sản, đặc biệt vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin chiếm cao từ 14-35% so với trọng lượng khô Vì vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực nguồn nguyên liệu để sản xuất chitin sản phẩm từ chúng Chitin tìm thấy từ nhiều nguồn khác với hàm lượng khác [45,51] Bọ cánh cứng 37% Nhện 38% Bò cạp 30% Sâu 20-38% Nấm 5-20% Tôm 33% Cua 70% Mực 3-20% Mặc dù chúng phổ biến rộng rãi nguồn thu nhận chitin từ vỏ cua tôm Trong công nghệ chế biến, chitin tồn dạng phức hợp với số chất như: CaCO3, protein, lipid, chất hữu … nên việc tách chiết khó khăn phải đảm bảo hai yếu tố lúc vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính chất chitin 1.1.3.3 Cấu trúc phân tử tính chất chitin  Cấu trúc phân tử [58, 59] Qua nghiên cứu thủy phân chitin enzyme hay HCl đậm đặc người ta thấy chitin polymer tạo thành từ đơn vị N-acetyl-β-D-Glucosamine liên kết với liên kết 1-4 glucoside Hình 1.5 Cấu trúc chitin [62] Chitin có cấu trúc lạp thể gồm dạng : α, β γ, khác thể xếp chuỗi Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau, nhiên, chúng có cặp xếp chiều, chuỗi β – chitin chuỗi xếp theo chiều định, chuỗi γ – chitin có cặp chuỗi xếp chiều so le với chuỗi ngược chiều cấu trúc Hình 1.6 Cấu trúc alpha-chitin [62]  Tính chất chitin [27, 31] Chitin thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ liên kết hydro mạch Chitin không tan nước, dung dịch acid kiềm loãng, cồn dung môi thông thường Nó tan số acid vô đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tạo thành enzyme nấm sợi môi trường lên men bán rắn [14, 35, 36] 1.1.4.1 Thành phần môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase [4, 11, 29]  Nguồn dinh dưỡng cacbon Nấm sợi có khả đồng hóa nhiều nguồn cacbon khác nhau, nguồn cacbonhydrat dễ hấp thu nhất, glucose nguồn cacbon tham gia vào phản ứng ba chu trình chuyển hóa: đường Embden Meyerhof (1930), Pentose Entner Doudoroff Do chitinase vừa enzyme cấu trúc, vừa enzyme cảm ứng nên môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh chitinase, cần có nguồn chitin chất cảm ứng nguồn cacbon nhằm tăng khả sinh tổng hợp enzyme chitinase Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzyme chitinase chitin (có thể dạng huyền phù, dạng bột hay dạng thô) dẫn xuất chitin Nghiên cứu Jesús de la Cruz cộng (1922) Trichoderma harzianum tạo chitinase có nguồn cacbon từ chitin không từ nguồn khác cellulose hay chitosan  Nguồn dinh dưỡng nitơ Nguồn nitrogen có ý nghĩa lớn đến trình sinh tổng hợp enzyme nấm sợi Theo Kapat cộng (1996), loại ure khỏi môi trường nuôi cấy làm tăng khả tổng hợp chitinase Takashi cộng (2002) nghiên cứu khả sinh chitinase từ nấm sợi Aspergillus sp hoạt tính chitinase cao sử dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4 Theo Nampoothiri cộng (2003), bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào môi trường nuôi cấy bán rắn khả tạo chitinase Trichoderma harzianum tăng đáng kể Tuy nhiên, theo Kovacs cộng (2003), nuôi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào môi trường cám gạo-chitin không ảnh hưởng đến khả tạo chitinase Suresh Chandrasekharan (1999) ghi nhận gia tăng sản lượng enzyme môi trường nuôi cấy Trichoderma harzianum cung cấp muối amonium phosphat cao nấm men N N Nawani B P Kapadnis trình nghiên cứu tối ưu hóa phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa toán thống kê cho thấy Streptomyces sp NK 1057 cung cấp nguồn nitơ từ hai nguồn cao nấm men (NH4)2SO4 sản lượng chitinase tăng từ – 10% so với dùng riêng lẻ nguồn [33]  Nguồn dinh dưỡng khoáng Các chất khoáng Fe, Mn, Zn, Mo, Cu có vai trò quan trọng tham gia vào trình chuyển hóa vật chất qua màng thành tế bào nấm sợi, tham gia thành phần cấu tạo protein, enzyme, điều hòa pH môi trường nuôi cấy nên ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp enzyme nói chung, chitinase nói riêng 1.1.4.2 Yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh enzyme chitinase nấm sợi - Ảnh hưởng độ ẩm Độ ẩm có ý nghĩa nuôi cấy bán rắn Theo Matsumoto cộng (2001), với độ ẩm 75%, chủng Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh chitinase có hoạt tính cao Đối với Trichoderma harzianum, hoạt tính chitinase cao độ ẩm môi trường 65% (Nampoothiri cộng sự, 2003) Takashi cộng (2002) nấm sợi Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao điều kiện độ ẩm môi trường 57% - Ảnh hưởng pH Giá trị pH môi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng nấm sợi Tùy thuộc vào loài, chủng mà pH môi trường ban đầu thích hợp acid, trung tính hay kiềm Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao điều kiện pH = 5-6 (Takashi cộng sự, 2002) Nhiều nghiên cứu Trichoderma harzianum pH thích hợp cho nấm sinh trưởng tạo chitinase có hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 (Nguyễn Thị Hồng Thương đồng tác giả, 2003) - Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng khả sinh enzyme nấm sợi Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng đa số nấm sợi từ 28-320C, tối đa 500C Nhiệt độ cao thấp kìm hãm sinh trưởng, chí giết chết sợi nấm, trình tổng hợp enzyme bị ức chế Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao điều kiện nhiệt độ 370C (Takashi cộng sự, 2002) - Ảnh hưởng chất cảm ứng Chitinase enzyme cảm ứng enzyme cấu trúc Tuy nhiên môi trường nuôi cấy vi sinh vật người ta bổ sung thêm chất chitin nhằm tăng khả tạo chitinase Nhìn chung diện chitin môi trường nuôi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase (Monreal Reese, 1969; Ulhoa Peberdy, 1993) Trong số chất, chitin huyền phù có khả kích thích tạo chitinase cao (Bhushan, 2000; Nampoothiri cộng sự, 2003) Trong hầu hết trường hợp, nồng độ chitin khoảng 1-1,5% vi sinh vật có khả tạo chitinase (Felse Panda, 2000) Năm 2003, Binod cộng sử dụng nhiều chất khác (như vách tế bào nấm, vỏ tôm, cua ) để tạo chitinase từ nấm sợi nuôi cấy môi trường bán rắn Việc tận dụng phế liệu vừa đem lại hiệu kinh tế, vừa góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường Nghiên cứu Đinh Minh Hiệp đồng tác giả (2003) hệ enzym chitinase Trichoderma sp cảm ứng vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae, Phytophthora primulae), vách tế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes versicolor) chitin vỏ tôm, vách tế bào nấm cảm ứng trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase Trichoderma tốt chitin vỏ tôm 1.1.5 Những ứng dụng enzyme chitinase [30, 33] 1.1.5.1 Ứng dụng việc thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh) Thể nguyên sinh tế bào nấm sử dụng công cụ thí nghiệm có hiệu việc nghiên cứu trình hình thành thành tế bào, trình tổng hợp enzyme, trình tiết chất việc cải tiến chủng nấm ứng dụng công nghệ sinh học Do thành tế bào nấm có chứa chitin, hệ enzyme thủy phân chitin nhân tố sử dụng để phá vỡ thành tế bào, tạo tế bào trần từ tế bào nấm Dahiya cộng (2005) mô tả hiệu enzyme chitinase thu nhận từ chủng Enterobacter sp NRG việc tạo tế bào trần từ nấm Trichoderma reesei, Aspergilllus niger, Pleutotus florida Mizuno cộng (1997) tách tế bào trần từ Schizophyllum commune cách sử dụng dịch lọc môi trường nuôi Bacillus circulans KH – 304 Phức hợp enzyme từ Bacillus circulans WL – 12 với hoạt tính chitinase cao hiệu việc thu nhận tế bào trần từ Phaffia rhozyme (Johnson cộng sự, 1979) 1.1.5.2 Ứng dụng việc sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine N- acetyl glucosamine Chitooligosaccharides, glucosamine N- acetyl glucosamine chất có tiềm rộng lớn y dược Chitooligosaccharides có lợi ích tiềm sản xuất thuốc cho người Ví dụ, chitohexaose chitoheptaose phát có tính kháng khối u Chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus sử dụng để sản xuất chitopentaose chitotriose từ chất chitin huyền phù (Murao cộng sự, 1992) Sự kết hợp enzyme thủy phân chitin cần thiết để thu nhận oligomer có chiều dài chuỗi mong muốn Ví dụ, để tạo chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl glucosamindase exochitinase; để tạo N- acetyl glucosamine cần tỉ lệ cao exochitinase N-acetyl glucosamindase (Aloise cộng sự, 1996) nhận thấy ủ enzyme chitinase với tetramer pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thấy có hình thành hexamer Sashiwa cộng (2002) sản xuất N- acetyl glucosamine từ α-chitin cách sử dụng dịch enzym thô từ Aeromonas hydrophila H-2330 1.1.5.3 Ứng dụng việc nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học Chitin có mặt lớp vỏ ống tiêu hóa côn trùng Villagomez-Castro LopezRomero (1996) sự kiện thuộc hình thái học nấm có tham gia enzyme chitinase Allosamidin, chất ức chế mạnh enzyme chitinase, nhận thấy có khả kìm hãm sinh trưởng loài ve bét, ấu trùng nhặng sau chúng ăn vào (Sakuda cộng sự, 1987) 1.1.5.4 Ứng dụng việc ước tính sinh khối nấm Các nhà nghiên cứu mô tả loại phương pháp khác để ước tính lượng nấm có đất Kỹ thuật bao gồm việc quan sát kính hiển vi ly trích chất thị đặc trưng cho nấm glucosamine ergosterol Có liên quan chặt chẽ hoạt tính chitinase lượng nấm có đất Sự liên quan không thấy xuất với vi khuẩn xạ khuẩn Chính thế, chitinase trở thành yếu tố thị thích hợp cho mức sinh trưởng nấm đất (Miller cộng sự,1998) Tương tự, chitinase protein gắn kết với chitin sử dụng để dự báo lây nhiễm nấm người (Laine Lo, 1996) 1.1.5.5 Ứng dụng việc kiểm soát muỗi Chitinase đóng vai trò quan trọng hình thái nấm men, côn trùng Kuranda Robbins (1991) vai trò chitinase phân chia tế bào suốt trình sinh trưởng nấm men Sacharomyces cerevisiae Người ta ấu trùng muỗi Aedes aegypti bị giết vòng 48 với tác động chế phẩm thô từ nấm Myrothecium verrucaria Nấm gây bệnh côn trùng Beauveria bassiana gây nhiễm trứng muỗi Aedes aegypti Điều mở tiềm việc sản xuất chất kiểm soát côn trùng truyền bệnh muỗi 1.1.5.6 Ứng dụng y học Hiện nay, nhà khoa học nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase việc chẩn đoán bệnh truyền nhiễm nấm gây Chitin diện vách hầu hết nấm gây bệnh, giai đoạn chu trình sống nấm Hay nấm men chitin diện vết chồi Do dùng phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo sở xây dựng phương pháp chẩn đoán nhanh loài nấm gây bệnh Các nhà khoa học đề xuất phương pháp chẩn đoán bệnh truyền nhiễm nấm cách sử dụng chitinase phân lập tạo dòng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1), enzyme kết hợp chặt chẽ với chitin sử dụng mẫu dò việc chẩn đoán với độ nhạy cao để nhận diện cách đặc hiệu vách tế bào nấm hay vết chồi nấm men lát cắt mẫu mô bệnh [32] Ngoài ra, chitinase có tiềm việc sản xuất loại kem hay thuốc bôi da chứa chất chống nấm bệnh thường xảy nước vùng nhiệt đới khả phân hủy vách tế bào vi nấm chúng 1.1.5.7 Ứng dụng việc kiểm soát nấm gây bệnh trồng Nhiều loài côn trùng nấm mốc có hại cho trồng vật nuôi gây nhiều loại dịch bệnh, ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nông nghiệp Vì chitin thành phần phổ biến thực vật động vật có xương nên người ta sử dụng tác nhân kìm hãm sinh tổng hợp chitin nấm côn trùng 1-(2,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin, polyoxin D Khi áp dụng cảnh, lương thực động vật, tác nhân chứng tỏ có nhiều ưu việc tiêu diệt nấm mốc, côn trùng có hại mà không gây hại đáng kể cho thực vật động vật có xương sống Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase có mặt thể thực vật không chứa chitin Chitinase β-1,3-glucanase tạo mô thực vật tế bào bị kích thích nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác thủy phân vách tế bào nấm ngăn cản phát triển bệnh Chitinase sản xuất Enterobacter sp NRG4 có hoạt tính cao Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxii Rhizopus nigricans (Dahiya cộng sự, 2005) Bhushan Hoodal (1998) nghiên cứu tính tương thích chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp BG-11 với thuốc diệt côn trùng thuốc diệt nấm thường sử dụng Chitinase từ Bacillus cereus YQ308 ức chế phát triển nấm bệnh thực vật Fusarium oxyporum, F Solani, Penicillium ultimum (Change cộng sự, 2003) CHIT42, CHIT40 CHIT72 từ Trichoderma harzianum P1 Trichoderma virens 41 tác động nảy mầm kéo dài sợi nấm nhiều nấm gây bệnh thực vật Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago avenae, chúng ủ với dịch enzyme 1.1.5.8 Ứng dụng sản xuất protein đơn bào Chất thải rắn từ trình chế biến tôm chứa chủ yếu chitin, CaCO3 protein RevahMoiseev Carrod (1981) đề nghị sử dụng loại chất thải để chuyển đổi phương pháp sinh học chitin thành protein đơn bào nhờ sử dụng enzyme thủy phân chitin Họ sử dụng enzyme chitinase thu nhận từ Saccharomyces marcescens để thủy phân chitin sau nuôi Pichia Kudriavazevii để sản xuất protein đơn bào (với 45% protein 8-11% acid nucleic) Những nấm thường dùng để sản xuất protein đơn bào Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, Sacharomyces cerevisiae Myrothecium verrucaria Vyas Deshpande (1991) dùng enzyme thủy phân chitin thu nhận từ Myrothecium verrucaria dùng Sacharomyces cerevisiae để sản xuất protein đơn bào từ chất thải chứa chitin Tổng hàm lượng protein thu 61%, với tỉ lệ thấp acid nucleic (3,1%) Các nghiên cứu Sacharomyces cerevisiae chủng tốt để sản xuất protein đơn bào (60% protein 1-3% acid nucleic) 1.2 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NGHIÊN CỨU 1.2.1 Các chủng thuộc chi nấm Aspergillus [7, 8, 61] 1.2.1.1 Vị trí phân loại Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Giống: Aspergillus 1.2.1.2 Đặc điểm hình thái Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt, số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác vùng định khuẩn lạc Aspergillus niger nuôi cấy môi trường thạch-khoai tây-dextrose 250C cho khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chóng chuyển sang màu đen với việc tạo vô số bào tử đính, mặt trái khuẩn lạc màu vàng nhạt trưởng thành tạo đường rãnh phóng xạ bề mặt thạch Aspergillus awamori nuôi cấy môi trường Czapek cho khuẩn lạc đạt kích thước 4,55,0cm sau ngày nhiệt độ 250C, môi trường MEA (cao malt) cho kích thước khuẩn lạc lớn Khuẩn lạc có màu nâu nhạt, dần chuyển sang đậm Hệ sợi trắng dần ngả vàng sậm Cuống mang bào tử bụi phồng lên ngọn, chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp hướng Bào tử trần vách ngăn, khác hình dạng, kích thước, màu sắc loài khác Theo Bùi Xuân Đồng, Aspergillus niger có bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn 4,05,0µm, xù xì không với gờ rõ gai không xếp thành vạch kẻ dọc theo chiều dài Aspergillus awamori có mau chóng chuyển màu nâu đỏ, mặt trái khuẩn lạc màu tương tự, cuống bào tử đính phần lớn phát triển dài 1,0-1,5mm, bào tử đính phần lớn đường kính 4,0 đến 4,5 µm A B Hình 1.7 Hình thái nấm Aspergillus niger [63, 64] (A): bào tử, (B): Khuẩn lạc môi trường PGA Hình 1.8 Hình thái nấm Aspergillus awamori [64] (A): Khuẩn lạc MT Czapek; (B): Khuẩn lạc MT MEA (C), (D), (E): hình thái bào tử 1.2.1.3 Đặc điểm sinh lý, hóa sinh Nấm Aspergillus có mặt khắp nơi tự nhiên, chúng phân bố rộng rãi dễ thích nghi chúng hình thành khuẩn lạc nhiều nguồn chất khác Nghiên cứu Andrea Astoreca cộng cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C Theo Takashi cộng (2002), nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp tổng hợp chitinase có hoạt tính cao 370C Wainwright cộng rằng, pH thích hợp cho sinh trưởng nấm Aspergillus awamori khoảng 5.0-7.0 Độ pH acid (khoảng 2-3) ngăn cản tạo thành bào tử, dẫn đến hệ sợi bị phân tán nuôi cấy chìm Đã có nhiều nghiên cứu tìm hiểu enzyme nấm Aspergillus niger, gồm amylase, amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase Ngoài chitinase nấm đề cập đến Hội nghị Quốc tế Aspergillus Nertheland vào tháng năm 2010 [61] Vấn đề độc tố Aspergillus niger đề cập đến, phần lớn chúng hại, số tạo độc tố gây hại đến động vật người Sự an toàn Aspergillus niger đề cập đến nhiều báo tác giả Schuster cộng (2002), Van Dijck cộng (2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer cộng (2006) [41] Theo thông tin tóm tắt từ báo tác giả này, khoảng 3-10% chủng Aspergillus niger có khả sinh độc tố điều kiện nuôi cấy xác định ochratoxin A 1.2.2 Trichoderma harzianum [5, 12, 55] 1.2.2.1 Vị trí phân loại Trichoderma nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn phân loại đặc điểm cần thiết cho việc phân loại chưa biết đầy đủ Theo Rifai (1969), Barnett Hunter (1972), Trichoderma thuộc lớp nấm, nấm bất toàn Deuteromycetes (Fungi imperfect), chúng phân loại sau: Giới: Nấm Nghành: Ascomycota Lớp: Deuteromycetes Bộ: Moniliales Họ: Moniliceae Giống: Trichoderma Một số tài liệu phân loại giống Trichoderma thuộc họ Moniliacae, Moniliales, lớp nấm, nấm bất toàn (Fungi imperfecti) 1.2.2.2 Đặc điểm hình thái [63, 64] Khuẩn lạc Trichoderma harzianum ban đầu có màu lục trắng, sau chuyển sang màu lục sẫm, mặt khuẩn lạc không màu