ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THANH BÌNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA TẾ BÀO TUA TRONG VIỆC ĐỊNH HƢỚNG TẾ BÀO TIÊU DIỆT CẢM ỨNG BỞI CYTOKINE TIÊU DIỆT TRÚNG ĐÍCH UNG THƢ Ngành: Sinh lý học Người Động vật Mã số ngành: 62420104 Khóa học năm: 2015 Xác nhận Cán hướng dẫn: TS Phạm Văn Phúc ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƢỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THANH BÌNH ĐỀ CƢƠNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA TẾ BÀO TUA TRONG VIỆC ĐỊNH HƢỚNG TẾ BÀO TIÊU DIỆT CẢM ỨNG BỞI CYTOKINE TIÊU DIỆT TRÚNG ĐÍCH UNG THƢ Ngành: Sinh lý học Người Động vật Mã số ngành: 62420104 Khóa học năm: 2015 Người hướng dẫn khoa học: TS BS Lê Tấn Đạt TS Phạm Văn Phúc Tp HCM, năm 2016 Phần 1: Tiểu luận tổng quan Tính cấp thiết, ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Ung thư nguyên nhân gây tử vong toàn giới (Jemal et al., 2008) Nhiều bệnh nhân bị ung thư chữa trị liệu pháp truyền thống Phẫu thuật, xạ trị hóa trị có nhiều tác dụng phụ thường không loại bỏ hoàn toàn tế bào ung thư nên bệnh có khả tái phát sau vài năm (Bretthauer, 2010; Ishikura, 2012; Videtic, 2012) Các nghiên cứu cho thấy nhiều loại bướu đặc chứa quần thể tế bào có đặc điểm tương tự tế bào gốc, chúng có vai trò khởi phát trì khối u nguyên nhân dẫn đến di gây tử vong cho bệnh nhân ung thư, quần thể tế bào tế bào gốc ung thư (TBGUT) (Al-Hajj, Wicha, BenitoHernandez, Morrison, & Clarke, 2003; Clarke, 2005) Khoa học kĩ thuật ngày phát triển, chất lượng sống người ngày nâng cao, đặt yêu cầu cao hoạt động nghiên cứu điều trị bệnh Liệu pháp miễn dịch nói chung liệu pháp miễn dịch tế bào nói riêng nhắm đến việc kích hoạt hệ miễn dịch người bệnh, thúc đẩy đáp ứng miễn dịch với ung thư, cho phép khả tự nhiên thể nhận diện tốt cuối tiêu diệt tế bào ung thư Liệu pháp miễn dịch chiến lược đầy hứa hẹn việc điều trị nhiều loại ung thư với mục đích thiết lập kiểm soát ung thư lâu dài Việc kết hợp liệu pháp truyền thống phẫu thuật, hóa trị xạ trị với liệu pháp miễn dịch hướng điều trị ung thư để giảm số bệnh nhân tử vong ung thư Do đáp ứng miễn dịch đặc hiệu nên sử dụng điều trị ung thư để loại bỏ khối u mà không tác động lên tế bào bình thường Liệu pháp miễn dịch nhắm đến việc tăng cường đáp ứng miễn dịch thể khối u (miễn dịch chủ động) hay cung cấp kháng thể tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên khối u (miễn dịch thích ứng-adoptive immnunotherapy) (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2012; Dougan & Dranoff, 2012; Rescigno, Avogadri, & Curigliano, 2007; Smith, Oertle, & Prato, 2014; Vanneman & Dranoff, 2012) Tế bào tua (dendritic cell – DC) tế bào miễn dịch có chức trình diện kháng nguyên Chúng có khả hoạt hóa tế bào T trợ giúp CD4 trinh nguyên tế bào T gây độc CD8 (cytotoxic T lymphocyte – CTL) chưa cảm ứng Đây xem hướng tiếp cận liệu pháp miễn dịch chủ động, nghĩa liệu pháp dựa vào tế bào DC sử dụng nhằm tạo tế bào trình diện kháng nguyên chuyên biệt khối u tạo đáp ứng tế bào T gây độc tiêu diệt tế bào ung thư (Barth et al., 2010; Gilboa, 2007; Kalinski & Okada, 2010; Lesterhuis et al., 2011; Steinman, 2012) Trên giới, nghiên cứu điều trị ung thư vú tế bào tua tiến đến bước thử nghiệm lâm sàng; nhiên, hiệu đẩy lùi bệnh ung thư thấp lý sau: (i) DC cần nguồn kháng nguyên ung thư chuyên biệt quan trọng việc cảm ứng tế bào hiệu tiêu diệt khối u, khía cạnh dù nỗ lực nhà khoa học xác định số kháng nguyên ung thư; (ii) DC tế bào trình diện kháng nguyên nên chúng có khả kích hoạt hệ thống miễn dịch kháng u mà chức thực trực tiếp công việc này, nên với hệ miễn dịch bị ức chế thể bệnh nhân ung thư gây chế bảo vệ tế bào ung thư và/hay từ phương pháp điều trị hóa trị, xạ trị làm tế bào miễn dịch trở nên dung nạp, nguyên nhân dẫn đến hiệu liệu pháp DC thấp Vì việc kết hợp liệu pháp sử dụng DC tế bào miễn dịch kháng u khác ngày có ý nghĩa không mặt nghiên cứu mà mặt thực tiễn lâm sàng Liệu pháp miễn dịch thích ứng liệu pháp cá thể hóa tiêm truyền tế bào miễn dịch kháng u bệnh nhân nuôi cấy ex vivo để tiêu diệt tế bào ung thư, hướng liệu pháp tiềm điều trị ung thư Liệu pháp miễn dịch thích ứng phương pháp hiệu sử dụng hệ thống miễn dịch thể để điều trị ung thư (Ma et al., 2012) Một loại tế bào lympho T giết tự nhiên (natural killer T lymphocyte – NKT) gọi tế bào tiêu diệt cảm ứng cytokine (cytokineinduced killer cell – CIK) cho thấy kết đáng khích lệ nghiên cứu lâm sàng tự thân ghép dị cá thể Tế bào CIK có khả tiêu diệt tế bào ung thư, chúng loại tế bào nuôi cấy biệt hóa dễ dàng so với loại tế bào miễn dịch khác Bên cạnh đó, thời gian hiệu lượng tế bào thu cao so với tế bào tiêu diệt hoạt hóa lymphokine (lymphokine-activated killer) Vì thế, CIK trở thành ứng viên đầy tiềm việc điều trị bệnh ung thư Tuy nhiên nay, Việt Nam chưa có phương pháp hay quy trình liên quan đến CIK công bố Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu tìm phương pháp áp dụng hiệu liệu pháp tế bào CIK điều trị ung thư vú mô hình chuột Đề tài đặt giả thuyết liệu việc kết hợp đồng nuôi cấy DC CIK có phải hướng tiếp cận hiệu điều trị ung thư hay không? Hướng kết hợp có lợi điểm điều trị trúng đích ung thư gây tác dụng phụ hay không? Cơ sở giả thuyết việc kết hợp loại tế bào miễn dịch có chức trình diện kháng nguyên chuyên biệt loại tế bào miễn dịch có chức tiêu diệt tế bào ung thư mang đặc tính tăng sinh mạnh khả gây độc tế bào mạnh kết hợp lợi điểm từ loại tế bào, đồng thời khắc phục hạn chế chúng đồng nuôi cấy với Kết nghiên cứu minh chứng rõ nét cho thấy hiệu liệu pháp miễn dịch kết hợp điều trị ung thư mô hình cận lâm sàng, làm sở thúc đẩy nhiều nghiên cứu liên quan nhằm mục tiêu ứng dụng vào thực tế điều trị cho bệnh nhân với hiệu đáp ứng cao Phần 2: Đề cƣơng luận án Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu xuyên suốt đề tài nhằm giải câu hỏi liệu việc kết hợp với DC có định hướng cho tế bào CIK tiêu diệt trúng đích ung thư, hiệu tác dụng phụ hay không? Đề tài hướng đến giải mục tiêu sau: 2.1 Khảo sát hiệu tiêu diệt trúng đích tế bào ung thư in vitro liệu pháp DC, CIK kết hợp DC/CIK 2.2 Xác định chế tác động vai trò DC việc định hướng tế bào CIK tiêu diệt tế bào ung thư vú in vitro 2.3 Nghiên cứu hiệu điều trị liệu pháp DC-CIK đồng loại mô hình chuột mang khối u vú 3 Đối tƣợng phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Đối tượng Dòng tế bào ung thư vú chuột 4T1 sử dụng để thiết lập dòng tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc điều trị ung thư doxorubicin Dòng tế bào thường (nguyên bào sợi chuột) phân lập từ chuột BALB/c khỏe mạnh phương pháp nuôi cấy sơ cấp biểu bì Nguyên bào sợi tăng sinh môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% FBS 1% kháng sinh/nấm Tế bào sử dụng từ lần cấy chuyền thứ 3-7, đồng thời lưu trữ ni tơ lỏng đến có nhu cầu sử dụng Chuột BALB/c khỏe mạnh, cân nặng 25-30 gram, 8-10 tuần tuổi sử dụng để thu nhận nguồn tế bào máu đơn nhân để nuôi cấy tế bào CIK DC, gây mô hình mang khối u vú thiết lập từ dòng tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc 3.2 Phương pháp 3.2.1 Phương pháp chọn lọc tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc tạo chuột mô hình mang khối u vú hình thành từ tế bào 4T1 kháng thuốc - Dòng tế bào ung thư vú chuột 4T1 mua từ ngân hàng dòng tế bào ATCC (Manassas, VA, Hoa Kỳ), nuôi môi trường DMEM/F12 bổ sung 10% huyết bào thai bò (FBS) 1x kháng sinh/nấm (Gibco) Tế bào nuôi 37°C, 5% CO2 Thay môi trường ngày - Chuẩn bị hóa chất kháng u: hòa tan mg doxorubicin (Sigma-Aldrich) ml ethanol vô trùng - Thu nhận tế bào 4T1: tế bào tách 0,25% trypsin/EDTA Sau rửa lần với PBS để loại trypsin thừa - Chọn lọc tế bào ung thư vú 4T1 kháng thuốc: tế bào 4T1 nuôi lô thí nghiệm khác nồng độ doxorubicin (tương ứng µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,25 µg/mL; 0,1 µg/mL 0,05 µg/mL) Ủ tế bào 24 giờ, đo đường cong tăng trưởng, thời gian nhân đôi tế bào thông qua số tế bào (cell index-CI) Chọn lọc tế bào từ lô thí nghiệm có kháng doxorubicin cao nhất, tiến hành nuôi cấy ổn định tế bào môi trường có bổ sung nồng độ thuốc tương ứng (đến lần cấy chuyền thứ 3) sử dụng chúng làm nguồn tế bào cho thí nghiệm - Tạo dòng tế bào ung thư vú kháng thuốc mang gen thị huỳnh quang gfp, cách sử dụng lentivirus Đánh giá chọn lọc dòng tế bào mang gen thị mà không thay đổi tính kháng thuốc - Chuột BALB/c 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, cân nặng 25–30 gram mua từ Charles Rivers (Sulzfeld, Đức) Chuột nuôi điều kiện khuẩn, tiến hành thí nghiệm dựa Quy tắc thí nghiệm động vật (PTN Tế bào gốc) - Tạo chuột mô hình mang khối u vú 4T1 kháng thuốc: + Tế bào huyền phù dung dịch PBS mật độ 1x106 tế bào/ml + Thao tác phòng vô trùng, xác định vùng vú chuột, tiến hành cạo lông, sát khuẩn Chuẩn bị kim tiêm vô trùng, tiêm da 0,1 ml huyền phù tế bào 4T1 kháng thuốc PBS vào vùng mỡ vú chuột + Theo dõi ghi nhận kích thước khối u ngày ghép tế bào ung thư 3.2.2 Phương pháp thu nhận biệt hóa tế bào CIK từ gan lách chuột tế bào DC từ tủy xương chuột - Chuột BALB/c 8-10 tuần tuổi, khỏe mạnh, cân nặng 25–30 gram mua từ Charles Rivers (Sulzfeld, Đức) Giết chuột cách kéo giãn đốt sống cổ, thu nhận gan, lách, xương đùi chuột vào lọ đựng mẫu chứa PBS bổ sung 1x kháng sinh/nấm - Thu nhận biệt hóa DC: + Thao tác tủ an toàn sinh học thu nhận tủy xương chuột cách cắt bỏ hai đầu xương đùi, dùng kim tiêm bơm môi trường RPMI 1640 bổ sung 1x kháng sinh/nấm dội rửa tế bào từ tủy xương Tế bào thu nhận nuôi môi trường có bổ sung 10% FBS 37°C, 5% CO2 + Chọn lọc tế bào tủy xương bám dính vào bề mặt nuôi Các tế bào bám cảm ứng tạo DC môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS 1x kháng sinh/nấm GM-CSF (1000U/ml), IL-4 (500U/ml) Môi trường thay sau ngày Đến D7, bổ sung thêm vào môi trường nuôi dịch ly giải tế bào 4T1 kháng thuốc DC nuôi thêm hai ngày, sau thu nhận - Thu nhận nuôi cấy tế bào CIK: Tế bào đơn nhân từ gan lách thu nhận, bổ sung môi trường RPMI 1640 10% FBS 1x kháng sinh/nấm IFN-γ (1000 U/ml) D0 Sau 24 nuôi, môi trường bổ sung thêm IL-2 (500 U/ml) anti-CD3 mAb (50 ng/ml) Môi trường thay sau ngày với IL-2 bổ sung CIK nuôi cấy đến D14 thu nhận - Đồng nuôi cấy tế bào DC CIK: Tế bào CIK DC thu nhận nuôi cấy theo quy trình Sau DC cảm ứng với dịch ly giải tế bào 4T1 kháng thuốc (D9), DC thu nhận đồng nuôi cấy với CIK thêm ngày Khảo sát tác động DC lên đặc điểm tế bào CIK với hình thức nuôi cấy: + Đồng nuôi cấy tiếp xúc + Đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert) 3.2.3 Phương pháp xét nghiệm apoptosis/necrosis Nguyên tắc: Annexin V propidium iodide (PI) hai thuốc nhuộm giúp phân biệt tế bào bị hoại tử (necrosis) hay chết theo lập trình (apoptosis) Phân tích gắn annexin V dựa vào chuyển vị phosphatidylserine từ màng màng bất ổn định màng trình apoptosis Khi gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang FITC phát tế bào bị apoptosis giai đoạn sớm PI thuốc nhuộm nhân màng tế bào tính nguyên vẹn, nên tế bào bị apoptosis muộn/necrosis PI vào nhân + Tế bào sống: Annexin V- PI+ Tế bào giai đoạn apoptosis sớm: Annexin V+ PI- + Tế bào giai đoạn apoptosis muộn necrosis: Annexin V+ PI+ 3.2.4 Các phương pháp đánh giá đặc điểm tế bào miễn dịch - Phương pháp flow cytometry: + DC đánh giá khả trưởng thành kháng thể đơn dòng kháng CD14/CD40/CD80/CD83/CD86/HLA-DR + CIK đánh giá khả hoạt tính kháng thể đơn dòng kháng CD3/CD56/NKG2D perforin/granzyme B + Tế bào Treg kiểm tra quần thể tế bào nuôi cấy CIK quần thể tế bào đồng nuôi cấy CIK/DC kháng thể đơn dòng kháng CD4 CD25 - Phương pháp ELISA: + Dịch nuôi lô tế bào DC, CIK đồng nuôi cấy CIK/DC kiểm tra diện loại cytokine IL-12 IFN-γ tế bào tiết + Ngoài ra, lô tế bào CIK đồng nuôi cấy CIK/DC kiểm tra diện loại cytokine IL-10 TGF-β tế bào Treg tiết 3.2.5 Phương pháp đánh giá tính gây độc tế bào ung thư in vitro sử dụng liệu pháp DC, CIK liệu pháp kết hợp - Tế bào ung thư 4T1 chọn lọc kháng thuốc nuôi đĩa 96 giếng Sau ủ 24 giờ, tế bào xử lý với nồng độ khác tế bào hiệu (DC, CIK DC/CIK) 48 Tỷ lệ tế bào ung thư:tế bào miễn dịch khảo sát 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 Môi trường thay ngày - Khảo sát tác động gây độc tế bào ung thư tế bào miễn dịch hình thức theo dõi: + Đồng nuôi cấy tiếp xúc + Đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert) - Khảo sát tác động tiêu diệt trúng đích tế bào miễn dịch: lô thí nghiệm tương tự tế bào ung thư, tế bào đích thay nguyên bào sợi chuột - Phương pháp đo thực thời dựa vào điện trở: Phương pháp sử dụng hệ thống xCelligence phát triển Roche ACE Biosciences để ghi nhận tăng sinh tế bào thực thời Các tế bào cấy lên đĩa 96 giếng đặc biệt (E-plate) với vi điện cực vàng bao phủ lớp đáy Về nguyên tắc: nhiều tế bào bám dính vào đáy giếng, trở kháng điện cực s tăng phản ánh thông qua số tế bào (cell index-CI), theo quy tắc sau: + Khi tế bào, tế bào không bám dính vào điện cực đáy, số CI + Trong điều kiện sinh lý, nhiều tế bào bám, số CI lớn + Hơn nữa, thay đổi trạng thái tế bào hình thái, bám trải, sức sống s dẫn đến thay đổi CI Điểm ưu việt hệ thống khả ghi nhận số liệu thực thời xác đến phút, cho phép theo dõi tăng sinh tế bào, ảnh hưởng tác nhân lên tế bào mà không cần phải can thiệp trực tiếp vào tế bào phương pháp khác MTT, BrdU Phương pháp cho phép xác định liệu pháp miễn dịch hiệu việc tiêu diệt tế bào ung thư 4T1 với tỷ lệ tế bào đích:tế bào miễn dịch tương ứng 3.2.6 Phương pháp đánh giá hiệu liệu pháp DC, CIK liệu pháp kết hợp điều trị mô hình chuột ung thư vú Mô hình chuột mang khối u vú 4T1 chọn lọc kháng thuốc sử dụng để đánh giá hiệu điều trị in vivo sử dụng liệu pháp DC, CIK liệu pháp kết hợp DC/CIK - Tế bào ung thư 4T1 chọn lọc kháng thuốc chuyển gen thị (gfp) huyền phù 0,1 ml dung dịch PBS (1x106 tế bào/ml) Tiêm vô trùng, da huyền phù tế bào vào vùng mỡ vú chuột - Sau ngày ghép tế bào ung thư, khối u xác định đo kích thước - Thu nhận tế bào miễn dịch từ lô thí nghiệm tương ứng DC, CIK, DC/CIK, huyền phù PBS - Chuột ghép tế bào miễn dịch qua tĩnh mạch đuôi lân cận khối u Dựa vào kết thử nghiệm tiêu diệt tế bào ung thư in vitro tế bào hiệu quả, lựa chọn tỷ lệ tế bào ung thư:tế bào miễn dịch tối ưu ghép vào chuột Mỗi lô thí nghiệm có chuột - Ghi nhận thông số kích thước khối u, thời gian sống chuột so với lô không điều trị (không ghép tế bào miễn dịch) lô đối chứng (tiêm PBS) - Phân tích thành phần tế bào miễn dịch (bằng phương pháp flow cytometry) máu ngoại vi chuột (1 lần/tuần) Chuột theo dõi tiêu sinh lý quan sát đo đạc được: cân nặng, biểu bên (lông, mắt ), tình trạng tiêu hóa - Khảo sát sống sót/tồn tại/di tế bào ung thư hệ thống phân tích hình ảnh chuột (Xenogen IVIS Spectrum In Vivo Imaging System), lần/tuần - Sau 30 ngày ghép tế bào miễn dịch Tiến hành mổ chuột, xác định, thu nhận khối u lại Cắt lát mô, nhuộm H&E và/hay hóa mô miễn dịch xác định tồn tế bào ung thư, xâm nhập tế bào miễn dịch vào khối u Kiểm tra diện tế bào miễn dịch quan: gan, lách sau điều trị chuột (bằng phương pháp flow cytometry) 3.2.7 Phương pháp xử lý thống kê Tất thí nghiệm thực lặp lại lần Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị trung bình xử lí phân tích Student s t-Test ANOVA GraphPad Prism Khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị p < 0,05 Nội dung phạm vi vấn đề sâu nghiên cứu 4.1 Nội dung 1: Khảo sát hiệu tiêu diệt trúng đích tế bào ung thư in vitro liệu pháp DC, CIK kết hợp DC/CIK - Chuột BALB/c sử dụng để thu nhận tủy xương chọn lọc tế bào đơn nhân (mononuclear cell – MNC) Xác nhận quy trình tạo DC từ MNC với chất cảm ứng tiền trưởng thành GM-CSF IL-4; sau đó, cảm ứng trưởng thành DC (mDC) cách bổ sung vào môi trường nuôi dịch ly giải tế bào ung thư 4T1 chọn lọc kháng thuốc - Thu nhận gan lách từ chuột trên, sau quần thể tế bào đơn thu nhận Tế bào lympho thu nhận cảm ứng với IFN-γ, anti-CD3 mAb IL-2 môi trường biệt hóa tế bào CIK 14 ngày - Khảo sát tác động gây độc tế bào ung thư tế bào miễn dịch hình thức theo dõi: đồng nuôi cấy tiếp xúc đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert) để trả lời câu hỏi tế bào miễn dịch sử dụng đề tài tiêu diệt tế bào ung thư nhân tố tiết (Perforin/Granzyme B) hay qua tương tác tiếp xúc tế bào + Tế bào ung thư 4T1 chọn lọc kháng thuốc nuôi đĩa 96 giếng (E-plate) Sau ủ 24 giờ, tế bào xử lý với nồng độ khác tế bào hiệu (DC, CIK DC/CIK) 48 Tỷ lệ tế bào ung thư:tế bào hiệu khảo sát 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 Dựa vào số tế bào, xác định đường cong tăng trưởng, thời gian nhân đôi tế bào - Đồng thời, khảo sát tác động tiêu diệt tế bào miễn dịch liệu có trúng đích, mà không gây hại đến tế bào bình thường? Thiết kế thí nghiệm gây độc tế bào tương tự tế bào ung thư, tế bào đích thay nguyên bào sợi chuột 4.2 Nội dung 2: Xác định chế tác động vai trò DC việc định hướng tế bào CIK tiêu diệt tế bào ung thư vú in vitro - Khảo sát tác động DC lên đặc điểm tế bào CIK với hình thức nuôi cấy: + Đồng nuôi cấy tiếp xúc + Đồng nuôi cấy không tiếp xúc (sử dụng cell insert) - Đánh giá tỷ lệ tế bào sống sau trình nuôi cấy lô DC, CIK CIK/DC: sử dụng phương pháp flow cytometry đánh giá tỷ lệ tế bào biểu Annexin V/PI - Đánh giá kiểu hình (thụ thể/đồng thụ thể đáp ứng miễn dịch) lô nuôi cấy DC, CIK CIK/DC phương pháp flow cytometry - Đánh giá chức (tiết cytokine) lô nuôi cấy DC, CIK CIK/DC phương pháp ELISA 4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu hiệu điều trị liệu pháp DC, CIK CIK/DC đồng loại mô hình chuột mang khối u vú - Tạo chuột mô hình mang khối u vú 4T1 kháng thuốc - Sau đó, chuột ghép tế bào từ lô thí nghiệm tương ứng DC, CIK, DC/CIK thông qua việc đánh giá kết gây độc tế bào ung thư in vitro - Ghi nhận thông số thay đổi kích thước khối u, thời gian sống Chuột theo dõi triệu chứng sinh lý bất thường: sút cân, lông xù, tiêu chảy Ở lô DC/CIK, chuột có khả loại bỏ khối u thời gian sống lâu có tác dụng phụ lô thí nghiệm khác - Phân tích thành phần tế bào miễn dịch (gồm tế bào T: TH,TC, Treg; tế bào B, tế bào NK, DC ) máu ngoại vi chuột (1 lần/tuần) - Khảo sát sống sót/tồn tại/di tế bào ung thư hệ thống phân tích hình ảnh chuột (Xenogen IVIS Spectrum In Vivo Imaging System) - Sau 30 ngày ghép tế bào miễn dịch Tiến hành mổ chuột, xác định, thu nhận khối u lại Cắt lát mô, nhuộm H&E và/hay hóa mô miễn dịch xác định tồn tế bào ung thư, xâm nhập tế bào miễn dịch vào khối u Kiểm tra diện tỷ lệ loại tế bào miễn dịch quan: gan, lách sau điều trị chuột Dự kiến kết đạt đƣợc (kết nghiên cứu, báo khoa học) Kết nghiên cứu giải mục tiêu đề tài việc kết hợp với DC giúp định hướng cho tế bào CIK tiêu diệt trúng đích ung thư, hiệu tác dụng phụ Trong thời gian thực luận án có công bố quốc tế liên quan đến nội dung luận án tiến hành Nơi thực đề tài Phòng thí nghiệm Nghiên cứu Ứng dụng Tế bào Gốc – Trường ĐH KHTN – ĐHQG Tp Hồ Chí Minh B2-3, sở Linh Trung, Tp Hồ Chí Minh Phân bố thời gian thực đề tài Thời gian thực năm Tài liệu tham khảo Abbas, A K., Lichtman, A H., & Pillai, S (2012) Cellular and molecular immunology Philadelphia: Elsevier/Saunders Al-Hajj, M., Wicha, M S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S J., & Clarke, M F (2003) Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells Proc Natl Acad Sci U S A, 100(7), 3983-3988 doi: 10.1073/pnas.0530291100 Barth, R J., Jr., Fisher, D A., Wallace, P K., Channon, J Y., Noelle, R J., Gui, J., & Ernstoff, M S (2010) A randomized trial of ex vivo CD40L activation of a dendritic cell vaccine in colorectal cancer patients: tumor-specific immune responses are associated with improved survival Clin Cancer Res, 16(22), 5548-5556 doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-2138 Bretthauer, M (2010) Evidence for colorectal cancer screening Best Pract Res Clin Gastroenterol, 24(4), 417-425 doi: 10.1016/j.bpg.2010.06.005 Clarke, M F (2005) A self-renewal assay for cancer stem cells Cancer Chemother Pharmacol, 56 Suppl 1, 64-68 doi: 10.1007/s00280-005-0097-1 Dougan, M., & Dranoff, G (2012) Immunotherapy of cancer Innate Immune Regulation and Cancer Immunotherapy (pp 391-414): Springer Gilboa, E (2007) DC-based cancer vaccines J Clin Invest, 117(5), 1195-1203 doi: 10.1172/JCI31205 Ishikura, S (2012) Optimal radiotherapy for non-small-cell lung cancer: current progress and future challenges Gen Thorac Cardiovasc Surg, 60(3), 127-131 doi: 10.1007/s11748011-0832-y Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Murray, T., & Thun, M J (2008) Cancer statistics, 2008 CA Cancer J Clin, 58(2), 71-96 doi: 10.3322/CA.2007.0010 Kalinski, P., & Okada, H (2010) Polarized dendritic cells as cancer vaccines: directing effector-type T cells to tumors Semin Immunol, 22(3), 173-182 doi: 10.1016/j.smim.2010.03.002 Lesterhuis, W J., de Vries, I J., Schreibelt, G., Lambeck, A J., Aarntzen, E H., Jacobs, J F., Figdor, C G (2011) Route of administration modulates the induction of dendritic cell vaccine-induced antigen-specific T cells in advanced melanoma patients Clin Cancer Res, 17(17), 5725-5735 doi: 10.1158/1078-0432.CCR-11-1261 Ma, Y., Zhang, Z., Tang, L., Xu, Y C., Xie, Z M., Gu, X F., & Wang, H X (2012) Cytokine-induced killer cells in the treatment of patients with solid carcinomas: a systematic review and pooled analysis Cytotherapy, 14(4), 483-493 doi: 10.3109/14653249.2011.649185 Rescigno, M., Avogadri, F., & Curigliano, G (2007) Challenges and prospects of immunotherapy as cancer treatment Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Reviews on Cancer, 1776(1), 108-123 Smith, A J., Oertle, J., & Prato, D (2014) Immunotherapy in Cancer Treatment Open Journal of Medical Microbiology, 4(03), 178 Steinman, R M (2012) Decisions about dendritic cells: past, present, and future Annu Rev Immunol, 30, 1-22 doi: 10.1146/annurev-immunol-100311-102839 Vanneman, M., & Dranoff, G (2012) Combining immunotherapy and targeted therapies in cancer treatment Nature reviews cancer, 12(4), 237-251 Videtic, G M (2012) Locally advanced non-small cell lung cancer: what is the optimal concurrent chemoradiation regimen? Cleve Clin J Med, 79 Electronic Suppl 1, eS3237 doi: 10.3949/ccjm.79.s2.07