BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thanh Hương NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh-2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thanh Hương NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH LÊN MEN FED-BATCH Corynebacterium glutamicum THU NHẬN L-LYSINE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN THÚY HƯƠNG Thành phố Hồ Chí Minh-2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu riêng Kết trình bày luận văn trung thực Việc tham khảo nghiên cứu tác giả khác trích dẫn rõ ràng TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thanh Hương LỜI CẢM ƠN Hoàn thành luận văn bảo vệ luận văn, em xin gửi đến Cô, PGS.TS Nguyễn Thúy Hương lời cảm ơn sâu sắc Em xin cảm ơn Cô Con cảm ơn Mẹ cho chỗ dựa vững để vượt qua khó khăn Em xin cảm ơn chị hai, anh rể cháu ủng hộ em tinh thần vật chất để em có ngày hôm Em cảm ơn chị hai bên em Em cảm ơn Cô Minh Tâm giúp đỡ em trình làm luận văn Em xin gửi lời cảm ơn đến Cô Ly Tao, cán phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Bách khoa TP HCM tạo điều kiện thuận lợi cho em trình em tiến hành thực nghiệm Em xin cảm ơn Thầy, Cô tham gia giảng dạy lớp Cao học Sinh học Thực nghiệm K23, Trường Đại học Sư phạm TP HCM Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến người bạn bên Xin chân thành cảm ơn TP Hồ Chí Minh, ngày 31 tháng 10 năm 2014 TÁC GIẢ LUẬN VĂN Nguyễn Thanh Hương MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Quá trình lên men 1.1.3 Các hình thức lên men 1.2 Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum 11 1.2.1 Đặc điểm hình thái vị trí phân loại 12 1.2.2 Đặc điểm sinh lý 13 1.2.3 Đặc điểm sinh hóa 13 1.2.4 Đặc điểm di truyền 14 1.3 Amino acid L-lysine 16 1.3.1 Đặc điểm 16 1.3.2 Vai trò ứng dụng 17 1.3.3 Thu nhận L-lysine từ vi khuẩn 19 1.3.4 Bản chất trình sinh tổng hợp L-lysine vi khuẩn Corynebacterium glutamicum 20 1.3.5 Kỹ thuật lên men fed-batch thu nhận L-lysine từ Corynebacterium glutamicum 23 1.4 Những nghiên cứu nước liên quan đến hướng đề tài 26 Chương NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nguyên liệu 29 2.2 Bố trí thí nghiệm 33 2.2.1 Khảo sát số đặc điểm sinh học giống 33 2.2.2 Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine phương pháp quy hoạch thực nghiệm 33 2.2.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 35 2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 36 2.3.1 Phương pháp vi sinh 36 2.3.2 Phương pháp hóa sinh 38 2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu 39 Chương KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 3.1 Khảo sát số đặc điểm sinh học giống 40 3.2 Tối ưu hóa môi trường lên men Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine phương pháp quy hoạch thực nghiệm 42 3.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 50 3.3.1 Xác định thời điểm bắt đầu bổ sung chất 50 3.3.2 Khảo sát ngưỡng ức chế chất 53 3.3.3 Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các hóa chất phân tích .29 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng đề tài 30 Bảng 2.3 Các môi trường nuôi cấy sử dụng đề tài 31 Bảng 2.4 Các mức thí nghiệm sàng lọc .34 Bảng 2.5 Thí nghiệm sàng lọc yếu tố ảnh hưởng lớn đến hàm mục tiêu 34 Bảng 3.1 Đặc điểm chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 .40 Bảng 3.2 Kết thí nghiệm sàng lọc 42 Bảng 3.3 Mức ảnh hưởng yếu tố khảo sát 43 Bảng 3.4 Kết thí nghiệm khởi đầu 44 Bảng 3.5 Hồi quy-phương sai thí nghiệm khởi đầu 45 Bảng 3.6 Kết thí nghiệm bề mặt đáp ứng-cấu trúc tâm xoay RSM-CCD 46 Bảng 3.7 Khả sử dụng đường Corynebacterium glutamicum 52 Bảng 3.8 So sánh lên men batch fed-batch 61 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 (a) Tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng môi trường phức hợp (b) Tế bào quan sát kính hiển vi điện tử quét 12 Hình 1.2 Bản đồ gen Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 15 Hình 1.3 Mô hình ezyme aspartate kinase với hai tiểu phần lysCα lysCβ cấu tạo bốn chuỗi poplypeptide giống hệt 16 Hình 1.4 Cấu trúc không gian cấu tạo phân tử lysine 17 Hình 1.5 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa từ glucose thành lysine vi khuẩn 20 Hình 1.6 Con đường hình thành L-lysine Corynebacterium glutamicum 21 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 32 Hình 3.1 Khuẩn lạc Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (a) hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 (b) 41 Hình 3.2 Đồ thị đường mức thể ảnh hưởng (NH4)2SO4 dịch bắp lên lượng L-lysine 48 Hình 3.3 Đồ thị tối ưu 49 Hình 3.4 Khả sinh trưởng, sinh L-lysine lượng đường sót lên men batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 50 Hình 3.5 Khả hình thành sinh khối, L-lysine lượng đường sót nuôi cấy Corynebacterium glutamicum nồng độ glucose khác 54 Hình 3.6 Khả sinh trưởng, sinh L-lysine lượng đường sót trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum-B-0632 57 Hình 3.7 Đồ thị so sánh lượng L-lysine lên men batch fed-batch 58 Hình 3.8 Đồ thị so sánh khả sinh trưởng Corynebacterium glutamicum lên men batch fed-batch 59 Hình 3.9 Đồ thị so sánh lượng đường sót lên men batch fed-batch 60 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Amino acid cần thiết cho sinh trưởng, phát triển người động vật, đặc biệt amino acid không thay Sự thiếu hụt amino acid nói chung amino acid không thay nói riêng dẫn đến tình trạng bệnh lý L-lysine amino acid thuộc nhóm không thay quan tâm nhiều cả, có nhu cầu cao, lại thường bị thiếu hụt phần ăn Mặt khác, L-lysine dễ bị phân hủy trình chế biến thức ăn thể tuyệt đối không tổng hợp Do đó, thiếu Llysine phổ biến, đặc biệt trẻ nhỏ Thiếu L-lysine làm giảm tổng hợp protein thể, trẻ biếng ăn, chậm lớn, thiếu men tiêu hóa… Hiện nay, việc sử dụng công nghệ vi sinh để sản xuất L-lysine hướng quan tâm Tuy nhiên, Việt Nam, quy trình sản xuất quy mô phòng thí nghiệm, số lượng nghiên cứu sản xuất L-lysine ít, chủng giống chưa đạt chuẩn, suất thấp [1] Với mục tiêu cải thiện trình lên men thu nhận L-lysine, chọn giải pháp tối ưu hóa môi trường lên men kỹ thuật lên men fed-batch Đây lý tiến hành đề tài: “Nghiên cứu trình lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine” Mục tiêu nghiên cứu Cải thiện trình lên men thu nhận L-lysine từ chủng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum-B-0632 Đối tượng nghiên cứu Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum VTCC-B-0632 từ trung tâm lưu giữ giống Đại học Quốc Gia Hà Nội Nhiệm vụ nghiên cứu Khảo sát số đặc điểm sinh học giống Tối ưu hóa môi trường lên men thu nhận L-lysine phương pháp quy hoạch thực nghiệm Thử nghiệm lên men fed-batch Corynebacterium glutamicum thu nhận L-lysine 2 Phạm vi nghiên cứu Tối ưu hóa môi trường dinh dưỡng lên men batch, tạo tiền đề cho bước đầu khảo sát lên men fed-batch gián đoạn thu nhận L-lysine quy mô phòng thí nghiệm Đóng góp luận văn Kết nghiên cứu đề tài cung cấp thông số tối ưu trình lên men batch bước đầu thử nghiệm lên men fed-batch Kết tiền đề cho nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận văn Về mặt khoa học: đề tài góp phần khẳng định ưu điểm phương pháp lên men fed-batch lên men tế bào vi khuẩn Corynebacterium glutamicum thu nhận amino acid L-lysine Về mặt thực tiễn: cải thiện trình lên men thu nhận L-lysine 3 Chương TỔNG QUAN 1.1 Kỹ thuật lên men thu nhận L-lysine 1.1.1 Khái niệm “Lên men” thuật ngữ sử dụng từ lâu, có nguồn gốc từ tiếng La tinh “fervere” có nghĩa “làm chín” để hoạt động nấm men dịch chiết trái ngũ cốc Trong lĩnh vực hóa sinh, lên men hiểu tạo thành lượng từ trình dị hóa hợp chất hữu Tuy nhiên, lĩnh vực vi sinh vật học, cụm từ lại dùng để chung cho trình tạo sản phẩm cách nuôi cấy vi sinh vật thích hợp [28] 1.1.2 Quá trình lên men Quá trình lên men trình phân giải carbohydrate điều kiện kỵ khí Quá trình lên men phân giải hợp chất chứa carbohydrate thành đường glucose kết thúc tạo thành CO2 số hợp chất chứa carbon chưa oxy hóa hoàn toàn ethanol, acid acetic, Người ta thường dùng tên sản phẩm điển hình tích lũy loại lên men để gọi trình lên men Ví dụ, trình lên men tích lũy chủ yếu acid lactic gọi lên men lactic (muối dưa, cà, làm sữa chua) Tuy nhiên, có nhiều vi sinh vật hiếu khí có khả oxy hóa không hoàn toàn chất tạo sản phẩm giống lên men kỵ khí, trình gọi lên men mà thực chất oxy hóa hiếu khí Rất nhiều trình oxy hóa không hoàn toàn có ý nghĩa quan trọng công nghiệp lên men, tạo sản phẩm có giá trị [2] 1.1.3 Các hình thức lên men Tùy theo cách phân loại mà có nhiều hình thức lên men khác nhau: Theo tính chất môi trường: lên men dạng lỏng, lên men dạng rắn bán rắn Theo đặc tính sử dụng oxy chủng vi sinh vật: lên men hiếu khí lên men kỵ khí Theo trạng thái: lên men tĩnh (không khuấy trộn hay sục khí) lên men động (có khuấy trộn sục khí) Theo mức độ kiểm soát quy trình: lên men có kiểm soát (kiểm soát độ tạp nhiễm, nồng độ chất, pH…) lên men không kiểm soát (tự nhiên) 4 Theo kỹ thuật lên men: lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục (continous) lên men dạng bán liên tục (fed-batch hay dạng mẻ có bổ sung) Trong phần này, đề cập sâu đến ba kỹ thuật lên men, lên men theo mẻ (batch), lên men liên tục lên men theo mẻ có bổ sung chất (fedbatch) 1.1.3.1 Lên men theo mẻ Lên men theo mẻ hay gọi lên men batch Đây phương pháp nuôi cấy mà suốt thời gian nuôi cấy, ta không thêm vào chất dinh dưỡng không loại bỏ sản phẩm cuối trình trao đổi chất, ngoại trừ ammoniac thêm vào để điều chỉnh pH (nếu có) [12], quần thể tế bào bị giới hạn khoảng không gian định Vi sinh vật bắt buộc phải trải qua pha sinh trưởng: pha lag, pha log, pha ổn định pha suy vong [2, 28] Trong giai đoạn đầu (pha lag), gần tăng trưởng đáng kể xảy ra, chủ yếu thích nghi tế bào với môi trường Trong thực tế sản xuất, cần phải rút ngắn thời gian pha nhiều tốt để đưa hệ thống lên men nhanh chóng bước vào pha tăng trưởng sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn Sau giai đoạn thích nghi giai đoạn tăng trưởng dần đạt đến tốc độ tối đa (pha log) [28] Sự tăng trưởng pha log biểu diễn theo phương trình sau: dx/dt = µx (1.1) Trong đó: x sinh khối vi sinh vật thời điểm nuôi cấy t giờ, µ tốc độ tăng trưởng (/giờ) Hằng số µ khác tùy vào giai đoạn chu kỳ tăng trưởng Từ phương trình (1.1) ta có: dx/x = µdt  𝑡 𝑡 ∫𝑡𝑡 𝑑𝑑/𝑥 = µ ∫𝑡𝑡 𝑑𝑑  lnxt – lnxto = µ(t-to) Trong đó, xto lượng sinh khối ban đầu, xt lượng sinh khối sau nuôi cấy t Trong pha log, chất dinh dưỡng nhiều, µ đạt µmax Mỗi chủng vi sinh vật điều kiện tối ưu có µmax khác Tốc độ tăng trưởng phụ thuộc lớn vào nguồn dinh dưỡng môi trường nuôi cấy sản phẩm trình sinh trưởng vi sinh vật tạo Nếu trì việc bổ sung dinh dưỡng vào môi trường nuôi cấy pha log tăng trưởng đạt tốc độ cao Sự tăng số lượng tế bào pha log diễn theo cấp số nhân với số theo phương trình sau: N = N0 2n Với N0 N số lượng tế bào ban đầu thời điểm khảo sát, n số hệ  lg(N/N0) = n.lg2  n = lg(N/N0) 1/0,301  n = lg(N/N0) 3,32 Thời gian hệ tính công thức sau: tg = t/n với t thời gian vi sinh vật nhân đôi qua n hệ Hằng số tốc độ phân chia K số lần phân chia sau nuôi cấy: K = n/t Pha cân bằng, lượng sinh khối tạo thành tính công thức: x = Y.(si – sr) Trong đó, x hàm lượng sinh khối, Y hiệu suất tổng hợp sinh khối, si hàm lượng chất ban đầu, sr hàm lượng chất lại Sự tăng trưởng ngừng lại (µ =0) sr = môi trường nuôi cấy có tích lũy chất độc vi sinh vật Giá trị Y giúp đánh giá hiệu suất chuyển đổi đơn vị chất thành sinh khối vi sinh vật Có thể dùng Y để tính toán lượng chất cần thiết để thu lượng sinh khối định Y thay đổi phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy như: nhiệt độ, pH, lượng oxy, giới hạn nồng độ chất…Theo Monod (1942), suy giảm tăng trưởng vi sinh vật phụ thuộc vào hàm lượng chất thể qua phương trình: µ = µmax sr/(Ks+sr) Trong đó, Ks số sử dụng chất Khi sr = µ = 0, nghĩa vi sinh vật bước vào giai đoạn cân chu kỳ sinh trưởng Đối với chất định, chủng vi sinh vật có Ks khác [28] 6 Pha suy vong, số lượng tế bào có khả sống giảm theo lũy thừa Nguyên nhân điều kiện bất lợi môi trường như: nguồn dinh dưỡng cạn kiệt làm giảm trình trao đổi chất, tích lũy số sản phẩm trao đổi chất gây độc cho vi sinh vật (acid) số enzyme (amilaza, proteinaza…) chức xúc tác trình tổng hợp tham gia vào trình phân giải tế bào vi sinh vật Các nguyên nhân dẫn đến chết hàng loạt tế bào [2] Kỹ thuật lên men theo mẻ (batch) sử dụng để sản xuất sinh khối, sản phẩm sơ cấp sản phẩm thứ cấp Hiện nay, phương pháp sử dụng phổ biến có số ưu điểm sau: đơn giản, dễ tiến hành bổ sung thêm thành phần trình vận hành, vậy, giảm khả bị nhiễm chi phí Tuy nhiên, phương pháp cho sản lượng thấp vi sinh vật không cung cấp thêm nguồn dinh dưỡng nên nhanh chóng bước vào pha suy vong nguồn chất cạn kiệt Để nâng cao sản lượng, ta cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng suốt pha sinh trưởng vi sinh vật Kỹ thuật lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch) lên men liên tục khắc phục nhược điểm lên men theo mẻ 1.1.3.2 Lên men liên tục Trong nuôi cấy theo mẻ, vi sinh vật phải trải qua pha tuần tự: pha thích nghi (pha lag), pha tăng trưởng (pha log), pha cân pha suy vong, nuôi cấy liên tục, pha log trì cách bổ sung liên tục nguồn dinh dưỡng vào nồi lên men lượng dịch chứa vi khuẩn tương ứng lấy Khi đó, tốc độ nạp liệu tốc độ chiết dịch cân bằng, nồng độ tế bào nồi lên men phụ thuộc vào tốc độ nạp liệu [28] Dòng chất dinh dưỡng nạp vào nồi lên men có liên quan đến thể tích nồi lên men theo tốc độ pha loãng giới hạn (D) theo công thức sau: D = F/V Trong đó, F tốc độ nạp liệu (L/giờ), V thể tích nồi lên men (L), D tốc độ pha loãng hay hệ số pha loãng Đại lượng D biểu thị thay đổi thể tích sau [2] Tốc độ sinh trưởng vi sinh vật nồi lên men biểu diễn qua phương trình: v+ = dx/dt = µx Nếu vi sinh vật ngừng sinh trưởng, phát triển, chúng bị rút khỏi nồi lên men với tốc độ: v− = - dx/dt = Dx Tốc độ thay đổi cuối (tăng giảm) mật độ vi sinh vật nồi lên men nuôi cấy liên tục chênh lệch tốc độ tăng v+ tốc độ giảm v−: v = v+ - v− = (µ-D)x Nếu µ>D v mang giá trị dương, nghĩa mật độ vi sinh vật tăng Ngược lại, µ Ks nên thực tế, sr thay đổi nhỏ Do vậy, trạng thái cân ổn định, D < µmax Ks [...]... soát của quy trình: l n men có kiểm soát (kiểm soát độ tạp nhiễm, nồng độ cơ chất, pH…) và l n men không kiểm soát (tự nhiên) 4 Theo kỹ thu t l n men: l n men theo mẻ (batch) , l n men liên tục (continous) và l n men dạng bán liên tục (fed- batch hay dạng mẻ có bổ sung) Trong phần này, chúng tôi sẽ đề cập sâu hơn đến ba kỹ thu t l n men, đó l l n men theo mẻ (batch) , l n men liên tục và l n men theo mẻ... kỹ trước khi l a chọn phương pháp này 1.1.3.3 L n men fed- batch L n men fed- batch còn gọi l n men theo mẻ có bổ sung, l hình thức trung gian giữa l n men theo mẻ (batch) và l n men liên tục, trong đó, nguyên liệu được nạp vào nồi l n men liên tục hoặc gián đoạn, sản phẩm chỉ được l y ra khi quá trình kết thúc Tuy nhiên, dịch l n men cũng có thể được chiết ra trong quá trình vận hành Fed- batch ban đầu... hình tích l y trong từng loại l n men để gọi quá trình l n men ấy Ví dụ, quá trình l n men tích l y chủ yếu acid lactic thì gọi l l n men lactic (muối dưa, cà, l m sữa chua) Tuy nhiên, có nhiều vi sinh vật hiếu khí có khả năng oxy hóa không hoàn toàn cơ chất tạo ra những sản phẩm giống như l n men kỵ khí, quá trình này cũng được gọi l l n men mà thực chất l oxy hóa hiếu khí Rất nhiều quá trình oxy... thống l n men này sẽ được đưa ngay vào một hệ thống l n men khác Như vậy, có thể thay đổi được nguồn nguyên liệu trong các giai đoạn khác nhau trong quá trình nuôi cấy Hồi l u tế bào vi khuẩn trong quá trình l n men: dịch chiết ra trong quá trình l n men, ngoài sản phẩm còn có một l ợng l n tế bào vi khuẩn Nếu l ợng tế bào này được thu hồi và tái bổ sung vào hệ thống l n men thì sẽ l m tăng sản l ợng l n. .. liệu Có thể nói, hình thức l n men theo mẻ có bổ sung (fed- batch) đã khắc phục được một số nhược điểm của l n men dạng mẻ và l n men liên tục Bên cạnh đó, qua tổng quan tài liệu, chúng tôi nhận thấy hình thức này phù hợp với mục đích thu nhận amino acid L- lysine từ vi khuẩn Corynebacterium glutamicum Vì vậy, chúng tôi chọn hình thức l n men theo mẻ có bổ sung (fed- batch) để nâng cao năng suất thu nhận. .. Kỹ thu t l n men thu nhận L- lysine 1.1.1 Khái niệm L n men l thu t ngữ được sử dụng từ khá l u, có nguồn gốc từ tiếng La tinh “fervere” có nghĩa l l m chín” để chỉ hoạt động của nấm men trong dịch chiết trái cây hoặc ngũ cốc Trong l nh vực hóa sinh, l n men được hiểu l sự tạo thành năng l ợng từ các quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ Tuy nhiên, trong l nh vực vi sinh vật học, cụm từ này l i... trong công nghiệp l n men, vì đã tạo ra những sản phẩm có giá trị [2] 1.1.3 Các hình thức l n men Tùy theo cách phân loại mà có nhiều hình thức l n men khác nhau: Theo tính chất môi trường: l n men dạng l ng, l n men dạng rắn và bán rắn Theo đặc tính sử dụng oxy của chủng vi sinh vật: l n men hiếu khí và l n men kỵ khí Theo trạng thái: l n men tĩnh (không khuấy trộn hay sục khí) và l n men động (có khuấy... l n men Điều này không những giảm chi phí sản xuất mà còn giảm chi phí đầu tư Hirao và cộng sự (1989) đã nuôi cấy liên tục chủng Corynebacterium glutamicum B-6 thu nhận L- lysine Chủng có thể sản xuất L- lysine ổn định trong 300 giờ với sản l ợng 105g /L và năng suất 5,6g /L/ giờ Trong đó, với hình thức l n men theo mẻ có bổ sung, sản l ợng L- 8 lysine chỉ đạt 100g /L trong 48 giờ, năng suất không vượt quá. .. men fed- batch thường cho năng suất cao hơn l n men batch trong cùng thời gian và điều kiện l n men Có thể chia hình thức l n men này thành 2 kiểu: l n men theo mẻ bổ sung thay đổi thể tích và l n men theo mẻ bổ sung không thay đổi thể tích 9 a L n men theo mẻ có bổ sung thay đổi thể tích Hình thức l n men này, nguồn dinh dưỡng bổ sung có thể l môi trường l n men ban đầu hoặc cơ chất có nồng độ tương... l ợng l n men Có thể dùng phương pháp l c hoặc ly tâm tách tế bào rồi bổ sung ngược l i vào nồi l n men Tuy nhiên, vấn đề chống tạp nhiễm l một trở ngại l n khi thực hiện kiểu nuôi cấy này Kỹ thu t l n men liên tục bắt đầu bằng một mẻ (batch) , khi tế bào vi sinh vật bước vào pha log, quá trình l n men được chuyển từ nuôi cấy theo mẻ sang liên tục [12] Nuôi cấy liên tục l m tăng đáng kể sản l ợng mà