BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ KIỀU GIANG Mã sinh viên: 1202055 TRIỂN KHAI MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BÀI TIẾT BETA-HEXOSAMINIDASE CỦA TẾ BÀO RBL-2H3 ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CÂY SÀI ĐẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ***************** ĐINH THỊ KIỀU GIANG Mã sinh viên:1202055 TRIỂN KHAI MÔ HÌNH ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BÀI TIẾT BETA-HEXOSAMINIDASE CỦA TẾ BÀO RBL-2H3 ÁP DỤNG ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CỦA CÂY SÀI ĐẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Đào Thị Vui TS Đỗ Thị Nguyệt Quế Nơi thực hiện: Bộ môn Dƣợc lực, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Bằng tất chân thành lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới: PGS.TS Đào Thị Vui – Trưởng môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội TS Đỗ Thị Nguyệt Quế - Giảng viên môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội Là người thầy trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo giúp đỡ em suốt trình thực hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới CN Phí Thị Xuyến – Khoa Dược lý, Viên Dược liệu giúp đỡ em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực, Trường Đại học Dược Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho em trình học tập thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô Ban giám hiệu Nhà trường, phòng ban, môn Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ, giúp đỡ em trình học tập trường Em xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành tới người thân gia đình, người bạn kịp thời động viên, ủng hộ em suốt trình học tập trường thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 05 năm 2016 Sinh viên Đinh Thị Kiều Giang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN…………………………………………… 1.1 Tổng quan bệnh dị ứng…………………………………… 1.1.1 Định nghĩa dị ứng…………………………………………… 1.1.2 Tình hình dịch tễ dị ứng……………………………………… 1.1.3 Phân loại dị ứng………………………………………………… 1.1.4 Cơ chế bệnh sinh dị ứng typ I……………………………… 1.2 Các thuốc đƣợc sử dụng điều trị dị ứng…………… 1.2.1 Các thuốc kháng histamin H1………………………………… 1.2.2 Các loại corticoid sử dụng điều trị dị ứng……………… 1.3 Tổng quan mô hình nghiên cứu chống dị ứng……… 1.3.1 Mô hình nghiên cứu in vivo…………………………………… 1.3.2 Một số mô hình nghiên cứu in vitro………………………… 11 1.4 Tổng quan số nghiên cứu đánh giá khả tiết beta-hexosaminidase tế bào RBL-2H3………………… 12 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước…………………………… 13 1.4.1 Tình hình nghiên cứu nước…………………………… 14 1.5 Tổng quan dƣợc liệu nghiên cứu………………………… 15 1.5.1 Đặc điểm thực vật……………………………………………… 15 1.5.2 Thành phần hóa học…………………………………………… 15 1.5.3 Tác dụng công dụng………………………………………… 16 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 17 2.1 Đối tƣợng……………………………………………………… 17 2.1.1 Nguyên liệu…………………………………………………… 17 2.1.2 Tế bào dùng nghiên cứu………………………………… 17 2.1.3 Hóa chất, trang thiết bị, dụng cụ thí nghiệm………………… 18 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………… 20 2.2.1 Triển khai mô hình đánh giá khả tiết β-hexosaminidase β-hexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3…………… 2.2.1.1 Hoạt hóa nuôi cấy tế bào RBL-2H3 20 20 2.2.1.2 Đánh giá khả tiết β-hexosaminidase βhexosaminidase toàn phần……………………………………… 2.2.2 22 Đánh giá tác dụng dịch chiết nước sài đất lên khả tiết β-hexosaminidase β-hexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3………………………………………………… 24 2.2.2.1 Đánh giá độc tính cắn dịch chiết nước sài đất lên tế bào RBL-2H3 ……………………………………………………… 25 2.2.2.2 Đánh giá tác dụng dịch chiết nước sài đất lên khả tiết β-hexosaminidase tế bào RBL-2H3…………………… 27 Xử lý số liệu…………………………………………………… 29 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN…………………………… 30 3.1 Kết quả………………………………………………………… 30 3.1.1 Triển khai mô hình đánh giá khả tiết β-hexosaminidase 2.2.3 tế bào RBL-2H3…………………………………………… 3.1.2 31 Đánh giá ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất khả tiết β-hexosaminidase β-hexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3…………………………………… 3.1.2.1 Khả gây độc tế bào RBL-2H3 cắn dịch chiết nước sài 34 đất……………………………………………………………… 34 3.1.2.2 Đánh giá ảnh hưởng khả tiết β-hexosaminidase β-hexosaminidase toàn phần……………………………… 35 3.2 Bàn luận……………………………………………………… 38 3.2.1 Bàn luận triển khai mô hình……………………………… 38 3.2.2 Bàn luận tác dụng dịch chiết nước sài đất lên khả tiết β-hexosaminidase tế bào RBL-2H3………………… KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DAG Diacylglicerol FcεRI ITAMs Immunoreceptor tyrosine-based activation motif IP3 Inositol 1,4,5-triphosphat KN - KT Kháng nguyên – Kháng thể PLCγ Phospholipase C γ Th2 T helper 2-subset DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 3.1 Tên bảng Một số hóa chất sử dụng trình thực nghiệm Giá trị mật độ quang thu định lượng βhexosaminidase dịch nuôi cấy tế bào Trang 18 30 Giá trị mật độ quang thu định lượng β3.2 hexosaminidase toàn phần 32 Giá trị mật độ quang lô tế bào sau ủ với cắn dịch 3.3 chiết sài đất 35 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất β3.4 hexosaminidase 36 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất β3.5 hexosaminidase toàn phần 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cơ chế giảỉ phóng chất hóa học trung gian gây dị ứng 1.5 Ảnh sài đất 15 2.1 Quy trình chuẩn bị cắn dịch chiết nước sài đất 17 2.2 Sơ đồ mô hình nghiên cứu 20 3.2 Qui trình đánh giá khả tiết β-hexosaminidase βhexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3 34 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất khả 3.3 tiết β-hexosaminidase 36 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất khả 3.4 tiết β-hexosaminidase toàn phần 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Dị ứng đáp ứng miễn dịch bình thường thể nhằm chống lại chất có môi trường (chất gây dị ứng) [8] Dị ứng bao gồm rối loạn cấp tính mạn tính Các rối loạn mạn tính thường không đe dọa tính mạng gây ảnh hưởng đến sức khỏe, sinh hoạt bệnh nhân, làm giảm chất lượng sống Dị ứng cấp tính gặp mức độ nặng (như sốc phản vệ, hen) đe dọa tính mạng người bệnh [10] Tỷ lệ người mắc dị ứng lớn (khoảng 25% người lớn) có xu hướng gia tăng thay đổi môi trường sống (ô nhiễm không khí, chất hóa học … ) [8] Trong phản ứng dị ứng, tế bào miễn dịch tế bào mast, bạch cầu ưa eosin, bạch cầu ưa bazơ đại thực bào hoạt hóa phản ứng kháng nguyên – kháng thể giải phóng số chất trung gian hóa học (như histamin, leukotrien, prostaglandin …) gây triệu chứng dị ứng đồng thời giải phóng enzym hexosamininase, β- D-glucoronidase,β- D-galactosidase [26] Để nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc chống dị ứng thực nghiệm, có số mô hình nghiên cứu in vivo in vitro Các protocol đánh giá giải phóng chất hóa học trung gian từ tế bào mast, tế bào bạch cầu phương pháp nghiên cứu in vitro thường sử dụng để sàng lọc tác dụng để chứng minh chế tác dụng chống dị ứng thuốc RBL2H3 tế bào bạch cầu ưa bazơ phân lập từ chuột cống nuôi cấy phòng thí nghiệm từ năm 1978 Trên bề mặt tế bào RBL-2H3 có IgE receptor lực cao Khi hoạt hóa phản ứng kháng nguyên kháng thể, tế bào RBL-2H3 giải phóng chất hóa học trung gian gây dị ứng tương tự tế bào mast [41] Trong hầu hết mô hình thực nghiệm đánh giá khả tiết chất trung gian hóa học đặc biệt histamin tế bào RBL-2H3 đánh giá thông qua khả tiết -hexosamininase - 36 Bảng 3.4 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất khả tiết β-hexosaminidase Lô Mẫu thử/ nồng độ n thử Lô chứng trắng - Lô mô hình - Chứng dương Quercetin 30g/ ml Giá trị mật độ quang (TB±SD % ức chế so với lô chứng 105,13  32,06 250,13  47,94** 165,25  10,15## 208,00  38,37 129,13  28,83## 33,93% Cắn dịch chiết Lô thử nước sài đất 25g/ ml Cắn dịch chiết Lô thử nước sài đất 48.37% 50g/ ml **: p< 0,01 so với giá trị mật độ quang trung bình với lô chứng trắng ## : p< 0,0 so với giá trị mật độ quang trung bình với lô mô hình ** ## Hình 3.3 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất khả tiết β-hexosaminidase ## 37 Nhận xét: Quercetin, với nồng độ cuối dịch ủ 30g/ml, có tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase tế bào RBL-2H3 so với lô mô hình với tỷ lệ phần trăm ức chế 33,93% Cắn dịch chiết nước sài đất 25g/ml tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase (p> 0,05) Cắn dịch chiết nước sài đất 50g/ml có tác dụng ức chế tiết βhexosaminidase so với lô mô hình với tỷ lệ phần trăm ức chế 48,37% (p< 0,01) - Kết đánh giá ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất βhexosaminidasetoàn phần tế bào RBL-2H3 Kết định lượng β-hexosaminidase toàn phần lô trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất β-hexosaminidase toàn phần Lô Mẫu thử/ nồng độ thử n Giá trị mật độ quang (TB±SD Lô chứng trắng - 503,63  41,97 Lô mô hình - 545,25 23,40* Chứng dương Quercetin 30g/ml Lô thử Lô thử Cắn dịch chiết nước sài đất 25g/ml Cắn dịch chiết nước sài đất 50g/ml % ức chế so với lô chứng 214,25  27,15## 57,46% 427,63  12,81## 21,57% 407,75  19,86## 25.22% *: p< 0,05 so với giá trị mật độ quang trung bình với lô chứng trắng ## : p< 0,01 so với giá trị mật độ quang trung bình với lô mô hình 38 * ## ## ## Hình 3.4 Ảnh hưởng cắn dịch chiết nước sài đất β-hexosaminidase toàn phần Nhận xét: Quercetin với nồng độ cuối dịch ủ 30g/ml có tác dụng giảm β-hexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3 so với lô mô hình với tỷ lệ phần trăm ức chế 57,46% Cắn dịch chiết nước sài đất 25g/ml 50g/ml làm giảm βhexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3 so với lô mô hình với tỷ lệ phần trăm ức chế tương ứng 21,57% 25,22% (p< 0,01) 3.2 Bàn luận 3.2.1 Bàn luận triển khai mô hình Phản ứng dị ứng (quá mẫn) phản ứng dị ứng đáp ứng miễn dịch thông qua IgE chủ yếu gây tăng tiết histamin từ tế bào mast từ tế bào bạch cầu ưa bazơ máu [40], [47] Phản ứng cấp tính nặng sốc phản vệ gây số bệnh số quan bệnh viêm mũi, sốt mùa, hen phế quản phấn hoa, mày đay, phù quincke 39 Phản ứng viêm dị ứng biểu qua trung gian T helper 2-subset (Th2) tế bào T cells tế bào lympho B để tạo kháng thể IgE đặc hiệu kháng nguyên [17] IgE, sau gắn vào receptor nằm bề mặt tế bào mast tế bào bạch cầu ưa bazơ dẫn đến vỡ tế bào giải phóng hàng loạt chất hóa học trung gian, cytokin gây phản ứng dị ứng pha sớm pha muộn [17] Do tế bào coi loại tế bào tham gia phản ứng dị ứng Ức chế hoạt hóa tế bào mast, tế bào bạch cầu ưa bazơ làm bền vững tế bào đích tác dụng quan trọng điều trị dị ứng RBL-2H3 tế bào bạch cầu ưa bazơ, dòng tế bào dùng phổ biến nghiên cứu chống viêm, chống dị ứng miễn dịch [41] Cũng giống tế bào mast, tế bào RBL-2H3 bị kích thích dinitrophenylatedIgE, giải phóng chất hóa học trung gian histamin, βhexosaminidase, interleukin-13 and TNF-α Hơn β-hexosaminidase bền histamin Do tế bào RBL-2H3 phù hợp để sử dụng nghiên cứu trình giải phóng chất trung gian hóa học tác dụng yếu tố thông qua trung gian IgE [41] β-hexosaminidase tiết đồng thời histamin Mặc dù histamin chất hóa học trung gian đóng vai trò phản ứng dị ứng histamin bền vững, khó định lượng βhexosaminidase để định lượng khả tiết histamin thường đánh giá thông qua khả tiết β-hexosaminidase Mô hình đánh giá ảnh hưởng mẫu nghiên cứu khả tiết β-hexosaminidase nhiều nhà khoa học ứng dụng tác giả Marcela de Souza Santos cộng [23], Thana Juckmeta cộng [48], Lee SS cộng [21], Jai-aue A cộng [16], Hagenlocher Y cộng [13] nhiều tác giả khác… Các nghiên cứu áp dụng trình nghiên cứu qui trình nghiên cứu mô tả tóm tắt, 40 thông số cụ thể qui trình nghiên cứu khác khác (như khác số lượng tế bào cấy chuyển vào giếng, khác nồng độ IgE ủ với tế bào)… Trên sở số kinh nghiệm nuôi cấy tế bào khảo sát số thông số nghiên cứu quan trọng ảnh hưởng nhiều tới kết nghiên cứu đề tài nhận thấy: Khi dùng đĩa 96 giếng, sau tra tế bào với số lượng tế bào 3x105/ giếng để ổn định tiếng điều kiện nuôi cấy (370C môi trường không khí 5% CO2 95% O2) tế bào phủ gần kín khoảng 80% bề mặt nuôi cấy Khi áp dụng ủ tế bào với IgE nồng độ g/ml thể tích dịch nuôi cấy lấy để định lượng βhexosaminidase 10 l hầu hết nghiên cứu protocol hướng dẫn định lượng lượng β-hexosaminidase công ty cung cấp nguyện liệu phục vụ định lượng β-hexosaminidase sử dụng nghiên cứu (công ty Sigma) đề tài thu kết giá trị mật độ quang định lượng β-hexosaminidase thấp có khác biệt rõ rệt (với p< 0.01) lô tế bào có ủ kháng thể IgE kháng nguyên DNP-BSA (lô mô hình) với lô tế bào không ủ IgE DNP-BSA (lô chứng trắng) lượng βhexosaminidase tiết môi trường β-hexosaminidase toàn phần Điều chứng tỏ với nồng độ ủ IgE g/ml có tác dụng việc làm tăng sản xuất tăng tiết β-hexosaminidase tế bào RBL-2H3 cho tế bào tiếp xúc với dị nguyên (DNP-BSA), nhiên với giá trị mật độ quang lô mô hình thấp (57,00  1,63 định lượng β-hexosaminidase tiết môi trường 163,5  20,04 định lượng β-hexosaminidase toàn phần) chưa phù hợp để đánh giá tác dụng mẫu thử dẫn đến sai số lớn Nguyên nhân dẫn đến giá trị mật độ quang thấp có nhiều, như: - Do lượng IgE ủ với tế bào 41 - Do lượng dịch lấy để định lượng β-hexosaminidase - Do lượng chất (40 µl p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamin) sử dụng phản ứng định lượng β-hexosaminidase chưa đủ - Do điều kiện phản ứng chưa phù hợp.… Nhóm nghiên cứu tiến hành loại trừ bớt nguyên nhân xảy lượng chất sử dụng phản ứng định lượng βhexosaminidase (40 µl p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamin) phép định lượng β-hexosaminidase toàn phần giá trị mật độ quang lớn giá trị mật độ quang phép định lượng β-hexosaminidase tiết môi trường nên giải thiết thiếu chất không phù hợp Lý điều kiện phản ứng chưa phù hợp cân nhắc điều kiện để phản ứng enzym β-hexosaminidase chất 40 µl p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamin không phức tạp, khó có sai sót Vì lý nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành thí nghiệm với việc thay đổi nồng độ IgE thể tích dịch nuôi cấy tế bào lấy để định lượng β-hexosaminidase Khi tăng thể tích mẫu dùng để định lượng β-hexosaminidase từ 10 l lên 15 l đồng thời giữ nguyên số nghiên cứu khác, kết nghiên cứu cho thấy giá trị mật độ quang định lượng β-hexosaminidase dịch nuôi cấy β-hexosaminidase toàn phần tăng so với trước Cụ thể giá trị mật độ quang đo lô mô hình lấy 10l dịch nuôi cấy tế bào đem định lượng β-hexosaminidase 57,00  1,63 tăng lên 129,00  16,36 thể tích dịch nuôi cấy lấy 15 l phép định lượng β-hexosaminidase dịch nuôi cấy Giá trị mật độ quang định lượng β-hexosaminidase toàn phần tăng từ 163,50  20,04 lên 250,13  47,94 Như tăng thể tích dịch nuôi cấy lấy để định lượng β-hexosaminidase, giá trị mật độ quang tăng nhiên định lượng β-hexosaminidase dịch nuôi cấy giá trị nhỏ (129,00  16,36) nhóm nghiên cứu tiến 42 hành lại thí nghiệm với qui trình thí nghiệm tương tự tăng nồng độ IgE từ g/ml lên g/ml Khi ủ tế bào với IgE g/ml thể tích dịch nuôi cấy lấy để định lượng β-hexosaminidase tăng lên 15 l, giá trị mật độ quang đo định lượng β-hexosaminidase dịch nuôi cấy β-hexosaminidase toàn phần lô mô hình tương ứng 250,13  47,94 545,25  23,40 Do đó, thí nghiệm đề tài lựa chọn nồng độ IgE để ủ với tế bào g/ml thể tích dịch nuôi cấy cần lấy để định lượng β-hexosaminidase 15 l (với qui trình nghiên cứu mô tả phần kết nghiên cứu) 3.2.2 Bàn luận tác dụng dịch chiết nước sài đất lên khả tiết β-hexosaminidase tế bào RBL-2H3 Để đánh giá tác dụng dịch chiết nước sài đất lên khả tiết β-hexosaminidase tế bào RBL-2H3, đề tài sử dụng chứng dương quercetin Quercetin flavonoid thường chọn làm chất đối chiếu (chứng dương) thí nghiệm đánh giá khả tiết βhexosaminidase tế bào RBL-2H3 tế bào mast Theo Marcela de Souza Santos cộng sự, quercetin nồng độ 100M (30,2 g/ml) ức chế 50% khả tiết β-hexosaminidase [24] Trong nghiên cứu dùng quercetin với nồng độ 30 g/ml để đánh giá khả tết βhexosaminidase tế bào RBL-2H3 Kết nghiên cứu cho thấy, quercetin ức chế 33,93% khả tiết β-hexosaminidase ức chế sản xuất βhexosaminidase (giảm β-hexosaminidase toàn phần) 57,46% Như kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu Marcela de Souza Santos cộng tỷ lệ phần trăm ức chế tiết β-hexosaminidase nhỏ chút Trong lý mà nghĩ đến liên quan đến khác nguồn gốc mức độ tinh kiết quercetin sử dụng nghiên cứu 43 Đối với dịch chiết nước phần mặt đất sài đất chưa tìm thấy nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng dược liệu khả tiết β-hexosaminidase khả tổng hợp βhexosaminidase Tuy nhiên, theo kinh nghiệm dân gian, sài đất dùng phổ biến trường hợp mẩn ngứa, mụn nhọt … dạng nước sắc để tắm để uống Sài đất có mặt số thuốc cổ truyền điều trị dị ứng, mụn nhọt, rôm sẩy Đây lý kiến đề tài chọn dịch chiết nước để đánh giá tác dụng khả tiết β-hexosaminidase khả tổng hợp β-hexosaminidase Kết cho thấy cắn dịch chiết nước sài đất 25 g/ml tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase (p> 0,05), tăng nồng độ lên 50 g/ml, mẫu thử có tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase so với lô mô hình với tỷ lệ phần trăm ức chế 48,37% (p< 0,01) Cắn dịch chiết nước Sài đất 25 g/ml 50 g/ml làm giảm β-hexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3 so với lô mô hình với tỷ lệ phần trăm ức chế tương ứng 21,57% 25,22% (p< 0,01) Vậy liệu kết có phải sài đất ức chế tiết β-hexosaminidase sài đất gây độc làm chết tế bào dẫn tới giảm nồng độ β-hexosaminidase Để trả lời câu hỏi đánh giá tác dụng gây độc tế bào cắn dịch chiết nước sài đất Kết cho thấy cắn dịch chiết nước Sài đất với nồng độ 25 g/ml, 50 g/ml nồng độ lớn (100 – 200 – 300 500 g/ml) không gây chết tế bào, nói cách khác nồng độ thử cắn dịch chiết nước sài đất không gây độc tế bào Như sơ kết luận sài đất nồng độ 25 g/ml 50 g/ml có tác dụng làm bền vững tế bào RBL-2H3, giảm β-hexosaminidase dịch nuôi cấy giảm βhexosaminidase toàn phần 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau thực nội dung nghiên cứu trình bày trên, đề tài thu kết sau: Đã triển khai qui trình đánh giá khả tiết betahexosaminidase đánh giá beta-hexosaminidase toàn phần tế bào RBL2H3 với bước tiến hành thông số cụ thể bảng kết nghiên cứu Áp dụng đánh giá thử nghiệm quercetin với cắn dịch chiết nước phần mặt đất sài đất: - Quercetin, với nồng độ 30g/ml, ức chế 33,93% khả tiết βhexosaminidase giảm β-hexosaminidase toàn phần 57,46% - Cắn dịch chiết nước sài đất 25 g/ml tác dụng ức chế tiết β-hexosaminidase (p> 0,05) Nồng độ 50 g/ml ức chế 48,37% tiết βhexosaminidase so với lô mô hình (p< 0,01) - Cắn dịch chiết nước sài đất 25 g/ml 50 g/ml làm giảm βhexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3 so với lô mô hình, tỷ lệ phần trăm ức chế tương ứng 21,57% 25,22% (p< 0,01) Đề xuất Áp dụng qui trình hoạt hóa, nuôi cấy tế bào RBL-2H3 qui trình đánh khả tiết đánh giá tiết beta-hexosaminidase toàn phần tế bào RBL-2H3 nghiên cứu sàng lọc nghiên cứu chế tác dụng thuốc chống dị ứng phòng thí nghiệm trường Đại học Dược Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2011), Dược liệu Học, NXB Y học, Hà Nội, tr 461-463 Bộ y tế 2011), Sinh lý bệnh miễn dịch, phần miễn dịch học, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 104-118 Phan Quang Đoàn (2009), Dị ứng- Miễn dịch lâm sàng, Nhà xuất giáo dục Việt Nam, tr.102-105 Trường đại học Dược Hà Nội (2007), Dược lý học tập II, Nhà xuất Y học, tr 246-249 Trường Đại học Y Hà Nội (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất Y học, tr 230-258 Tiếng Anh Baldo B.A., Pham N.H (2013), Drug Allergy: Clinical Aspects, Diagnosis, Mechanisms, Structure - Activity Relationships, DOI 10.1007/978-1-4614-7261-2_2, Springer Science+Business Media Banu R., Nagarajan N (2012), Antimicrobial activity of Wedelia chinensis, Journal of Pharmaceutical research, 5(1), pp 407-412 Berridge M.J., Dawson R.M., et al (1983), Changes in the levels of inositol phosphates after agonist-dependent hydrolysis ofmembrane phosphoinositides, Biochem J , 212, pp.473-482 Bloomfield S.F., Stanwell-Smith R., et al (2006) “Too clean, or not too clean: the hygiene hypothesis and home hygiene” Clin Exp Allergy 36 (4), pp.402-425 10 Douwes J., Brooks C., et al., (2011), Importance of allergy in asthma: an epidemiologic perspective Curr Allergy Asthma Rep,11, pp.434-444 11 Garima M, Reema S., et al (2009), Hepatoprotective of alcoholic and aquous extract of Wedelia chinensis, Pharmacologyonline, 1, pp 345-6 12 Hagenlocher Y., Feilhauer K., et al (2016), Citrus peel polymethoxyflavones nobiletin and tangeretin suppress LPS- and IgEmediated activation of human intestinal mast cells, Eur J Nutr 13 Hagenlocher Y., Kießling K., et al (2014), Cinnamaldehyde is the main mediator of cinnamon extract in mast cell inhibition, Eur J Nutr 14 Hong S.S., Jeong W., et al (2014), Neolignan inhibitors of antigeninduced degranulation in RBL-2H3 cells from the needles of Pinus thunbergii, Fitoterapia, 99, pp.347-351 15 Irshad Nomani, Avijit Mazumder, et al (2013), An Overview Of A Potent Medicinal Herb Wedelia chinensis (Asteraceae), international Journal of PharmTech Research, Vol.5, No.3, pp 957-964 16 Jai-aue A., Makchuchit S., et al 2014, Anti-allergic, anti-inflammatory and antioxidant activities of the different extracts of Thai traditional remedy called prabchompoothaweep for allergic rhinitis treatment J Med Assoc Thai; 97 Suppl 8, pp.140-148 17 Kim J.W., Lee J.H., et al (2009), Morin inhibits Fyn kinase in mast cells and IgE-mediated type I hypersensitivity response in vivo, Biochem Pharmacol, 77, pp.1506-1512 18 Koul S., Khosa R.L (2013), Immunomodulatory effect of Wedelia chinensis Int J Pharm Research and Development, 5(01), pp.072-077 19 Kupczyk M., Haahtela T., et al (2010), Reduction of asthma burden is possible through National Asthma Plans Allergy 65, pp.415-419 20 Laurence L Keith L et all., (2008), Goodman and Gilman’s manual of pharmacology and therafeutic, pp.403-417 21 Lee S.S., Baek Y.S., et al (2015), Tricin derivatives as antiinflammatory and anti-allergic constituents from the aerial part of Zizania latifolia, Biosci Biotechnol Biochem, pp.1-7 22 Linn S.C., Linn C.C., et all (1994), Hepatoprotective effect against liver injuries, The American Journal Chinise medicine, 22(3), pp.155-168 23 Marcela de Souza Santos, Willian Jonis Andrioli, et al (2013), In vitro anti-allergic activity of the fungal metabolite pyridovericin, International Immunopharmacology, Elsevier, Volume 15, Issue 3, pp 532-538 24 Marcela de Souza Santos , Willian Jonis Andriolic, et al (2013), In vitro anti-allergic activity of the fungal metabolite pyridovericin, International Immunopharmacology,15, 3, pp.532-538 25 Mastuda H., Morikawa T., et al (2002), Structural requirements of flavonoids for inhibition of antigen-Induced degranulation, TNF-α and IL-4 production from RBL-2H3 cells, Bioorg Med Chem., 10, pp 31233128 26 Masuda E.S., Schimitz J (2008), Syk inhibitors as treatment for allergic rhinitis, Pulm Pharmacol Ther; 21, pp.461-467 27 Matsuda H., Morikawa T., et al (2002), Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells and Absolute Stereostructures of Three new Diarylheptanoid Glycosides from the Bark of Myrica rubra, Chem., Pharm., Bull., 50, pp.208-215 28 Matsuda H., Morikawa T., et al (2003), Antiallergic principles from Alpinia galanga: structural requirements of phenylpropanoids for inhibition of degranulation and release of TNF- alpha and IL-4 in RBL2H3 cells, Bioorg., Med., Chem., Lett., 13, pp.3197-3202 29 Matsuda H., Morikawa T., et al (2004), Antiallergic phenanthrenes and stilbenes from the tubers of Gymnadenia conopsea, Planta Med., 70, pp.847-855 30 Matsuda H., Nakamura S., et al (2010), Acylated oleanane-type triterpene saponins, Sasanquasaponins I-V, with antiallergic activity from the flower buds of Camellia sasanqua, Chem., Pharm., Bull., 58, pp.1617-1621 31 Matsuda H., Tewtrakul S., et al (2004), Anti-allergic activity of stilbenes from Korean rhubarb (Rheum undulatum L.): structure requirements for inhibition of antigen-induced degranulation and their effects on the release of TNF-alpha and IL-4 in RBL-2H3 cells, Bioorg., Med., Chem., 12, pp.4871-4876 32 Matsuda H., Tewtrakul S., et al (2004), Anti-allergic principles from Thai zedoary: structural requirements of curcuminoids for inhibition of degranulation and effect on the release of TNF- alpha and IL- in RBL2H3 cells Bioorg Med Chem., 12, pp.5891-5898 33 Matsumoto T., Nakamura S., et al (2015), Structure of diarylheptanoids with antiallergic activity from the rhizomes of Curcuma comosa, J Nat Med., 69, pp.142-147 34 Morikawa T., Matsuda H., et al (2002), New Farnesane-Type Sesquiterpenes, Hedychiols A and B 8,9-Diacetate, and Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells from the Rhizome of Hedychium coronarium, Chem Pharm Bull., pp.1045-1049 35 Morikawa T., Matsuda H., et al (2002), Structures of New Aromatic Constituents and Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells from a Japanese Folk Medicine, the Stem Bark of Acer nikoense, J Nat Prod., 65, pp.1468-1474 36 Morikawa T., Nakamura S., et al (2007), Quantitative Analysis of Saponins in a Tea-Leaf Extract and Their Antihypercholesterolemic Activity, Chem Pharm Bull., 55, pp.293-298 37 Morikawa T., Tao J., et al (2003), Structures of New Aromatic Constituents and Inhibitors of Degranulation in RBL-2H3 Cells from a Japanese Folk Medicine, the Stem Bark of Acer nikoense, Chem Pharm Bull., 51, pp.62-67 38 Morikawa T., Xu F., et al (2010), Structures of novel norstilbene dimer, longusone A, and three new stilbene dimers, longusols A, B, and C, with antiallergic and radical scavenging activities from Egyptian natural medicine Cyperus longus, Chem Pharm Bull., 58, pp.1379-1385 39 Murugaian P., Ramamurthy V et al (2008), Hepatoprotective activity of Wedelia calendulacea against acute hepatotoxicity in rats,Res J Agric Biol Sci 4(6), pp.685-687 40 Paolo B., Anita C., et al (2006), Cells of the immune system and inammation, Evidence Based Complement Alternative Medicine 3, pp.13-24 41 Passante, Egle and Frankish, Neil (2009) The RBL-2H3 cell line: “its provenance and suitability as a model for the mast cell” Inflammation Research, 58 (11) pp.737-745 ISSN 1023-3830 42 Platts-Mills T.A., Erwin E., et al (2005), “Is the hygiene hypothesis still a viable explanation for the increased prevalence of asthma?”, Allergy 60 Suppl 79, pp 25–31 43 Rosenberg H.F., Phipps S., et al (2007), Eosinophil trafcking in allergy andasthma, Journal of Allergy Clinical Immunology 119, pp.1303-1310 44 Small P., Kim H., (2011), Allergic rhinitis Allergy Asthma Clin Immunol, pp.1-3 45 Sun B., Morikawa T., et al (2004), Structures of new beta-carbolinetype alkaloids with antiallergic effects from Stellaria dichotoma(1,2), J Nat Prod., 67, pp.1464-1469 46 Suresh V, Kumar RM, et all (2010), CNS activity of ethanol extract of Wedelia chinensis in experimental animals, Int J Pharm Sci Nanotech, 3(1), pp.881-886 47 Tewtrakul S., Itharat A., (2006), Anti-allergic substances from the rhizomes of Dioscorea membranacea, Bioorganic and Medicinal Chemistry 14, pp.8707-8711 48 Thana Juckmeta, Pakakrong Thongdeeying , et al (2014), Inhibitory Effect on β-hexosaminidase Release from RBL-2H3 Cells of Extracts and Some Pure Constituents of Benchalokawichian, a Thai Herbal Remedy, Used for Allergic Disorders, Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Volume 2014 49 Vasuvedan L., Jeromin A., et al (2009), The isoforms of type I PIP5K regulate distinct stages of Ca2+ signaling in mast cells, J Cell Sci, 122, pp.2567-2574 50 Vogel H.G (2007), "Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays", third edition, Springer 51 Wagner H., Geyer B., et al (1986), Coumestans as the main active principles of the liver drugs Eclipta alba and Wedelia calendulaceae, Planta Medica, 34, pp.370-374 52 Wang Q., Matsuda H., et al (2007), Inhibitory effects of thunberginols A, B, and F on degranulations and releases of TNF-alpha and IL-4 in RBL-2H3 cells, Biol Pharm Bull., 30, pp.388-392 53 Xu F., Matsuda H., et al (2009), Structures of new flavonoids and benzofuran-type stilbene and degranulation inhibitors of rat basophilic leukemia cells from the Brazilian herbal medicine Cissus sicyoides, Chem Pharm Bull., 57, pp.1089-1095 [...]... dị ứng của các thuốc mới, chúng tôi đã tiến hành đề tài Triển khai mô hình đánh giá khả năng bài tiết beta- hexosaminidase của tế bào RBL- 2H3 và áp dụng để đánh giá tác dụng của cây sài đất tại phòng thí nghiệm bộ môn Dược lực với 2 mục tiêu: 1- Triển khai mô hình đánh giá khả năng bài tiết beta- hexosaminidase và beta- hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 2- Áp dụng đánh giá tác dụng của cắn... nước sài đất trên khả năng bài tiết beta- hexosaminidase và trên beta- hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 Nội dung nghiên cứu: 1- Triển khai nuôi cấy và đánh giá khả năng bài tiết betahexosaminidase và beta- hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 2- Đánh giá tác dụng của cắn dịch chiết nước sài đất trên khả năng bài tiết beta- hexosaminidase và trên beta- hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3. .. cứu): RBL- 2H3 Triển khai mô hình đánh giá khả năng bài tiết β -hexosaminidase và β -hexosaminidase toàn phần Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào RBL- 2H3 Đánh giá khả năng bài tiết β -hexosaminidase và β -hexosaminidase toàn phần Đánh giá tác dụng của dịch chiết nước cây sài đất lên khả năng bài tiết β -hexosaminidase và hexosaminidase toàn phần Đánh giá độc tính của cắn dịch chiết nước sài đất lên tế bào RBL- 2H3 Đánh. .. Đánh giá tác dụng của dịch chiết nước cây sài đất lên khả năng bài tiết β -hexosaminidase và hexosaminidase toàn phần Hình 2.2 Sơ đồ mô hình nghiên cứu 2.2.1 Triển khai mô hình đánh giá khả năng tiết β -hexosaminidase và hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 2.2.1.1 Hoạt hóa và nuôi cấy tế bào RBL- 2H3 Tế bào RBL- 2H3 được lưu giữ trong điều kiện nhiệt độ lạnh - 1960 C (trong nitơ lỏng) Tế bào được... của tế bào RBL- 2H3 2.2.2.1 Đánh giá độc tính của cắn dịch chiết nước sài đất lên tế bào RBL2 H3 Trước khi đánh giá tác dụng của cắn dịch chiết nước cây sài đất lên khả năng tiết β -hexosaminidase của tế bào RBL- 2H3, tiến hành đánh giá khả năng gây độc tế bào RBL- 2H3 của cắn dịch chiết này Phương pháp được sử dụng để đánh giá độc tính trên tế bào của cắn dịch chiết nước sài đất là kỹ thuật định lượng... giá tác dụng của dịch chiết nước cây sài đất lên khả năng tiết β -hexosaminidase và β -hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 25 Sau khi triển khai được mô hình, tiến hành đánh giá thử nghiệm ảnh hưởng của cắn dịch chiết nước phần trên mặt đất của cây sài đất (với chứng dương được sử dụng là quercetin) trên khả năng bài tiết β -hexosaminidase và trên β -hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 2.2.2.1... của tế bào RBL- 2H3 để nghiên cứu tác dụng chống dị ứng của một bài thuốc tại Thái lan (Prabchompoothaweep remedy) [16] Hagenlocher Y và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng của cinnamaldehyd , thành phần chính trong dịch chiết cinnamon trên khả năng bài tiết hexosaminidase của tế bào RBL- 2H3 và tác dụng của cinnamaldehyd trên 14 một số đích tác dụng trong quá trình bài tiết β -hexosaminidase của tế bào RBL- 2H3. .. β -hexosaminidase * Qui trình đánh giá khả năng tiết β -hexosaminidase và hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 Qui trình đánh giá khả năng tiết β -hexosaminidase và hexosaminidase toàn phần của tế bào RBL- 2H3 được mô tả gồm các bước cơ bản như sau: - Chia tế bào đã được nuôi cấy phát triển ổn định ở đĩa 96 giếng với mật độ thích hợp thành các lô (mỗi lô 4 giếng) - Gắn kháng thể IgE vào tế bào RBL- 2H3. .. nuôi cấy và trở về hình dạng bình thường) Đề tài đã khảo sát sơ bộ một số thông số đơn giản (bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi soi nổi) như số lượng tế bào cần tra vào mỗi giếng tế bào để đánh giá khả năng bài tiết β -hexosaminidase và thời gian cần thiết để tế bào bám được vào bề mặt nuôi cấy và trở về hình dạng bình thường 2.2.1.2 Đánh giá khả năng bài tiết β -hexosaminidase và β -hexosaminidase. .. cứu đánh giá tác dụng giảm tiết các chất hóa học trung gian của tế bào RBL- 2H3 thông qua đánh giá khả năng bài tiết hexosaminidase được đăng tải trên các tạp chí khoa học quốc tế Đề tài xin được tổng hợp một số nghiên cứu đánh giá khả năng bài tiết hexosaminidase như sau: Marcela de Souza Santos và cộng sự, năm 2013, đã chứng minh pyridovericin có tác dụng làm giảm tiết β -hexosaminidase từ tế bào RBL- 2H3