BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ ÁNH Mã sinh viên: 1101036 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY RAU MỎ (GYMNEMA INODORUM (LOUR ) DENCE) ĐẾN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN CỦA ENZYM G6PASE Ở GAN CHUỘT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ ÁNH Mã sinh viên: 1101036 NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA DỊCH CHIẾT LÁ CÂY RAU MỎ (GYMNEMA INODORUM (LOUR ) DENCE) ĐẾN MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN GEN CỦA ENZYM G6PASE Ở GAN CHUỘT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đào Thị Mai Anh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô giáo Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, ngƣời dạy dỗ truyền đạt tri thức quý báu cho em suốt thời gian em học tập rèn luyện trƣờng Em xin chân thành thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa Sinh, Bộ môn Vi sinh – Công nghiệp Dƣợc, Bộ môn Dƣợc lý, Bộ môn Hóa phân tích – Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em trình nghiên cứu Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng kính trọng lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đào Thị Mai Anh, ngƣời thầy dìu dắt hƣớng dẫn em tháng ngày làm nghiên cứu khoa học Cô ngƣời thầy đáng kính giúp chúng em có định hƣớng định đắn trình nghiên cứu mà cô quan tâm, lo lắng, động viên đƣa lời khuyên bổ ích lúc chúng em gặp khó khăn Đó tảng vững để từ em tự tin bƣớc nghiệp em sau Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới ngƣời thân gia đình bạn bè động viên tiếp thêm sức mạnh cho em lúc khó khăn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh Viên Đỗ Thị Ánh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đái tháo đƣờng tụy (Diabetes melitus) 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Dịch tễ 1.1.4 Các thuốc điều trị đái tháo đƣờng 1.2 Enzym Glucose-6-phosphatase (G6Pase) 1.2.1 Cấu trúc 1.2.2 Cơ chế hoạt động 10 1.2.3 Vai trò G6Pase gan 11 1.2.4 Các yếu tố điều hòa biểu gen enzym G6Pase 12 1.3 Cây rau mỏ (Gymnema inodorum (Lour.) Dence) 13 1.3.1 Vị trí, phân loại 13 1.3.2 Đặc điểm thực vật phân bố 13 1.3.3 Thành phần hóa học 14 1.3.4 Tác dụng dƣợc lý 15 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 17 2.1.1 Nguyên liệu 17 2.1.2 Hóa chất 18 2.1.3 Thiết bị 19 2.1.4 Dụng cụ 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.3.1 Phƣơng pháp tách chiết ARN 22 2.3.2 Phƣơng pháp tiến hành phản ứng phiên mã ngƣợc (phản ứng RT) 22 2.3.3 Phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu gen enzym G6Pase kỹ thuật PCR cổ điển 23 2.3.4 Phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu gen enzym G6Pase kỹ thuật realtime PCR 24 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 27 3.1 Kết 27 3.1.1 Kết tách chiết ARN 27 3.1.2 Kết đánh giá mức độ biểu gen enzym G6Pase phƣơng pháp PCR cổ điển 30 3.1.3 Kết đánh giá mức độ biểu gen enzym G6Pase phƣơng pháp realtime PCR 33 3.2 Bàn luận 35 3.2.1 Về phƣơng pháp nghiên cứu 35 3.2.2 Về khả điều hòa biểu gen G6Pase mẫu dƣợc liệu…………………………………………………………………………….36 3.2.3 Về đa dạng khả ức chế biểu gen G6Pase mẫu dƣợc liệu 37 3.2.4 Về mối liên quan khả ức chế biểu gen G6Pase tác dụng hạ glucose máu mẫu dƣợc liệu 37 KẾT LUẬN 39 KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADA American Diabetes Asociation – Hiệp hội Đái tháo đƣờng Hoa Kỳ ADN Acid deoxyribonucleic AMPK AMP-activated protein kinase ARN Acid ribonucleic cADN Complementary DNA – ADN bổ sung dNTPs Deoxynucleosid triphosphat DPP-4 Dipeptidyl peptidase-4 ĐTĐ Đái tháo đƣờng ER Endoplasmic reticulum G6P Glucose-6-phosphat G6Pase Glucose-6-phosphatase GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase GI Gymnema inodorum GLP-1 Glucagon like peptid IDF International Diabetes Federation – Liên đoàn đái tháo đƣờng giới LDL Low-density lipoprotein PCR Polymer chain reaction – phản ứng khuếch đại gen PPAR Peroxisome poliferation-activated receptor – receptor hoạt hóa tăng sinh peroxisom qRT-PCR Quantitative Reverse transcriptase Polymer chain reaction RT Reverse transcriptase – phiên mã ngƣợc RT-PCR Reverse transcriptase Polymer chain reaction – phản ứng khuếch đại gen có phiên mã ngƣợc STZ Streptozotocine DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 2.1 Ký hiệu mẫu sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.2 Thành phần Mix phản ứng RT 22 Bảng 2.3 Thành phần Mix phản ứng RT 23 Bảng 2.4 Thành phần Mix phản ứng PCR cổ điển 23 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR cổ điển 24 Bảng 2.6 Thành phần Mix phản ứng realtime PCR 25 Bảng 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR 25 Bảng 2.8 Trình tự mồi gen GAPDH G6Pase 26 Bảng 3.1 Nồng độ ARN, tỷ lệ OD260/OD230 OD260/OD280 28 ARN Bảng 3.2 Mức độ biểu gen G6Pase nhóm đánh giá 32 phƣơng pháp PCR cổ điển Bảng 3.3 Mức độ biểu gen G6Pase nhóm đánh giá 33 phƣơng pháp realtime PCR DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình vẽ, đồ thị STT Trang Hình 1.1 Số lƣợng bệnh nhân ĐTĐ (20-79 tuổi) năm 2015 Hình 1.2 Cấu tạo enzym G6Pase 10 Hình 1.3 Cơ chế hoạt động enzym G6Pase 10 Hình 1.4 Mô hình hoạt động enzym G6Pase 11 Hình 1.5 Vai trò enzym G6Pase gan 12 Hình 1.6 Ðặc điểm hình thái Gymnema inodorum (Lour.) Dence 14 Hình 1.7 Cấu trúc hóa học GiA-1, GiA-2, GiA-5 GiA-7 15 Hình 3.1 Phổ hấp thụ ARN tách chiết từ mô gan từ bƣớc sóng 27 200nm đến 300nm Hình 3.2 Hình ảnh điện di gel mẫu ARN đƣợc tách từ mô 29 gan Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen GAPDH nhóm 30 nghiên cứu Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen G6Pase nhóm 31 nghiên cứu Hình 3.5 Mức độ biểu gen G6Pase nhóm nghiên cứu 32 đánh giá phƣơng pháp PCR cổ điển Hình 3.6 Mức độ biểu gen G6Pase nhóm nghiên cứu đánh giá phƣơng pháp realtime PCR 34 31 Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen G6Pase nhóm nghiên cứu (Làn 1: Ladder 100 bps, 2: điều trị insulin, 3: chứng bệnh, 4: chứng thƣờng, 5: GI 1, 6: GI 2, 7: GI 3, 8: GI 4) Nhận xét: Trong độ đậm băng sản phẩm GAPDH tƣơng đối nhóm băng sản phẩm G6Pase khác nhóm Cụ thể, băng sản phẩm nhóm bệnh đậm nhất, băng sản phẩm nhóm chuột đƣợc điều trị insulin nhạt so với nhóm chứng thƣờng chứng bệnh Và đặc biệt băng xuất nhóm đƣợc uống dƣợc liệu Chúng tiến hành phân tích hình ảnh điện di ADN gel agarose phần mềm Image J Kết đƣợc trình bày bảng 3.2 hình 3.5 32 Bảng 3.2: Mức độ biểu gen G6Pase lần lƣợt nhóm phƣơng pháp PCR cổ điển Độ đậm băng S T Nhóm GAPDH Mức độ biểu gen G6Pase so G6Pase với gen GAPDH T Điều trị insulin 1241,90±427,12 529,30±306,57 p Chứng bệnh 0,36±0,11 1070,60±315,86 1036,50±270,99 1,02±0,11 Chứng thƣờng 1410,90±4338,2 769,91±249,91 0,47±0,134 P 2-1,3 < 0,01 P 1-3 > 0,05 GI 922,21±480,70 0 GI 517,40±246,32 0 GI 1722,50±626,83 0 GI 1224,50±569,7 0 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 điều trị insulin chứng bệnh chứng thường GI GI GI GI Hình 3.5 Mức độ biểu gen G6Pase nhóm đánh giá phƣơng pháp PCR cổ điển 33 Nhận xét: Kết bảng 3.2 hình 3.5 cho ta thấy nhóm chứng bệnh có biểu gen G6Pase cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng thƣờng (p0,05) Các nhóm dƣợc liệu GI 1, GI 2, GI 3, GI có tác dụng ức chế biểu G6Pase mạnh, lƣợng sản phẩm tạo không đủ để phát điều kiện tiến hành thí nghiệm Không thể so sánh xem có khác nhóm GI 1, GI 2, GI 3, GI dựa vào kết thu đƣợc biểu gen G6Pase phƣơng pháp PCR cổ điển Vì tiến hành phƣơng pháp realtime PCR với độ nhạy cao để kiểm tra 3.1.3 Kết đánh giá mức độ biểu gen enzym G6Pase phƣơng pháp realtime PCR Chúng tiến hành realtime PCR lƣợng cADN thu đƣợc với gen, gen đích G6Pase gen tham chiếu GAPDH Dùng SYRB Green để phát sản phẩm Kết đƣợc trình bày bảng 3.3 hình 3.6: 34 Bảng 3.3: Mức độ biểu gen G6Pase nhóm phƣơng pháp realtime PCR Mức độ biểu gen STT Nhóm G6Pase so với gen GAPDH Điều trị insulin 0,890 ± 0,130 Chứng bệnh 1,503 ± 0,190 Chứng thƣờng 0,661 ± 0,210 GI 0,595 ± 0,190 GI 0,163 ± 0,090 GI 0,268 ± 0,090 GI 0,169 ± 0,07 P P (2 - 1, 3, 4, 5, 6, 7) 0,05 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 điều trị insulin chứng bệnh chứng thƣờng GI GI GI GI Hình 3.6 Mức độ biểu gen G6Pase nhóm đánh giá phƣơng pháp realtime PCR 35 Nhận xét: Kết realtime PCR thu đƣợc bảng 3.3 hình 3.6 lại lần khẳng định dƣợc liệu có tác dụng ức chế biểu gen G6Pase: Cả mẫu GI thu hái địa phƣơng khác có tác dụng làm giảm mức độ biểu gen enzym G6Pase có ý nghĩa thống kê so với lô chứng bệnh (p < 0,01) So sánh nhóm GI thu hái địa phƣơng khác nhau: nhóm GI (thu hái Kim Bôi-Hòa Bình) có khả ức chế biểu gen G6Pase cao nhóm GI 2, GI ý nghĩa thống kê (p0,05) Không có khác biệt có ý nghĩa thống kê tác dụng ức chế biểu gen G6Pase nhóm GI 1, GI 2, GI 3.2 Bàn luận 3.2.1 Về phƣơng pháp nghiên cứu Chúng lựa chọn phƣơng pháp RT-PCR để nghiên cứu biểu gen G6Pase đề tài Đây phƣơng pháp đƣợc tin cậy nghiên cứu biểu gen với độ nhạy độ xác cao RT-PCR gồm có RT-PCR cổ điển qRT-PCR Hai phƣơng pháp có ƣu nhƣợc điểm từ dẫn đến lợi riêng Cụ thể là: + Về độ xác: mục tiêu định lƣợng tƣơng đối phƣơng pháp cho kết xác độ tin cậy cao Nếu muốn định lƣợng tuyệt đối qRTPCR lựa chọn tốt + Về độ nhạy độ đặc hiệu qRT-PCR hẳn so với RT-PCR cổ điển Điều đƣợc nhìn thấy rõ kết nghiên cứu Ở hình 3.5 ta thấy sử dụng phƣơng pháp RT-PCR cổ điển nhóm GI kết biểu với phƣơng pháp qRT-PCR ngƣợc lại, thấy đƣợc kết biểu nhóm + Về giá cả: nhƣợc điểm qRT-PCR giá cả, thiết bị chu kỳ nhiệt giống máy PCR cổ điển realtime PCR phải trang bị thêm phận detector Ngoài ra, hóa 36 chất sử dụng realtime PCR đắt nhiều so với RT-PCR cổ điển + Yếu tố cuối quan trọng so sánh phƣơng pháp PCR cổ điển realtime PCR là: khuếch đại phân tử nhiệt độ bắt cặp mồi yếu tố định tới lƣợng sản phẩm thu đƣợc Nhiệt độ bắt cặp mồi đƣợc tối ƣu hóa thu đƣợc tối đa lƣợng sản phẩm Trong nghiên cứu tiến hành khuếch đại cADN gen khác với nhiệt độ bắt mồi tối ƣu nhƣ nhau, hoàn toàn tiến hành đƣợc phƣơng pháp Tuy nhiên, trƣờng hợp gen cần khuếch đại có nhiệt độ bắt mồi khác ta tiến hành lần chạy chu trình nhiệt Khi đó, phƣơng pháp PCR cổ điển lựa chọn Từ so sánh ta kết hợp phƣơng pháp nhƣ thí nghiệm làm: sử dụng RT-PCR cổ điển để xác định sơ kiểm tra xem dƣợc liệu có tác dụng điều hòa biểu gen G6Pase hay không Sau dùng realtime PCR để kiểm tra nhóm dƣợc liệu có khác khả điều hòa biểu gen Hay y học, dùng RT-PCR cổ điển đề sàng lọc, chẩn đoán xem bệnh nhân dƣơng tính hay âm tính với mầm bệnh, sau dùng qRT-PCR để định lƣợng mầm bệnh 3.2.2 Về khả điều hòa biểu gen G6Pase mẫu dƣợc liệu Kết nghiên cứu thu đƣợc từ đề tài cho thấy, mẫu dƣợc liệu thu hái vùng khác nhau: Kim Bôi (Hòa Bình), Vĩnh Phúc, Hà Nội, Ba Bể có khả ức chế biểu gen G6Pase Câu hỏi đặt là: chế ức chế biểu gen G6Pase GI gì? Có thể có giả thuyết chế ức chế biểu gen G6Pase dƣợc liệu: dƣợc liệu ức chế biểu gen G6Pase thông qua chế làm tăng tiết insulin hai dƣợc liệu ức chế biểu gen G6Pase không thông qua chế làm tăng tiết insulin Kết nghiên cứu cho thấy điều thú vị tác dụng ức chế G6Pase dƣợc liệu mạnh insulin nhƣng tác dụng hạ glucose máu nhóm lại nhiều so với hormon [7] Kết 37 gợi ý cho dƣợc liệu có tác dụng ức chế G6Pase theo đƣờng không thông qua tăng tiết insulin Tuy nhiên, dựa vào kết nghiên cứu việc tìm chế dƣợc liệu ức chế biểu gen G6Pase nhƣ chƣa đủ sở Vì cần tiếp tục nghiên cứu thêm ảnh hƣởng dƣợc liệu đích khác đƣờng ức chế biểu G6Pase không liên quan đến insulin 3.2.3 Về đa dạng khả ức chế biểu gen G6Pase mẫu dƣợc liệu Từ kết hình 3.6 cho thấy đa dạng khả ức chế biểu gen G6Pase GI Cùng loài nhƣng trồng vùng khác khả ức chế lại khác GI trồng Kim Bôi – Hòa Bình có khả ức chế biểu gen G6Pase mạnh GI trồng Hà Nội có khả ức chế thấp Các dƣợc liệu muốn thể đƣợc tác dụng phải chứa thành phần hoạt chất có tác dụng Trong thành phần hoạt chất dƣợc liệu dễ thay đổi chịu chi phối nhiều yếu tố nhƣ: đặc điểm di truyền, pH, điều kiện khí hậu, thổ nhƣỡng…do loài khác nhau, trồng điều kiện địa lý khác có không tƣơng đồng hàm lƣợng thành phần hoạt chất Nghiên cứu thực nghiệm loài thuộc chi Gymnema R.Br Việt Nam Nguyễn Ngọc Tú cho thấy có khác biệt sắc ký đồ mẫu loài Gymnema inodorum (Lour ) Dence đƣợc trồng vùng khác Hà Nội Dƣơng Nội Vƣờn Thực Vật [11] Kết giúp lý giải tính đa dạng khả ức chế biểu gen G6Pase GI trồng vùng khác 3.2.4 Về mối liên quan khả ức chế biểu gen G6Pase tác dụng hạ glucose máu mẫu dƣợc liệu Khi so sánh mức độ ức chế biểu gen G6Pase với khả làm giảm glucose máu nhóm dƣợc liệu thấy hai tác dụng không tỷ lệ với Ví dụ nhƣ mẫu GI thu hái Hà nội có khả hạ glucose máu tốt [7] khả ức chế biểu gen G6Pase dƣợc liệu lại thấp 38 Mặc dù khác biệt chƣa có ý nghĩa thống kê nhƣng kết với kết đƣợc công bố trƣớc nhóm tác giả Đào Thị Mai Anh khả ức chế alphaglucosidase [1] gợi ý tác dụng hạ glucose máu Gymnema inodorum Việt Nam có đƣợc phối hợp hiệp đồng nhiều chế khác 39 KẾT LUẬN Sau khảo sát ảnh hƣởng mẫu dịch chiết rau mỏ (Gymnema inodorum (Lour.) Dence) thu hái địa phƣơng khác Việt Nam đến mức độ biểu gen enzym G6Pase gan chuột, rút kết luận sau: - Cả mẫu Gymnema inodorum (Lour ) Dence thử nghiệm có khả ức chế biểu gen enzym G6Pase - Mức độ ức chế biểu gen G6Pase mẫu đƣợc trồng vùng địa lý khác không đồng nhƣ KIẾN NGHỊ Cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng Gymnema inodorum (Lour ) Dence đích khác đƣờng ức chế biểu G6Pase không liên quan đến insulin TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đào Thị Mai Anh, Phùng Thanh Hƣơng, et al (2015), "Đánh giá tác dụng ức chế enzym alpha glucosidase in vitro loài Gymnema R Br Việt Nam", Tạp chí dược học, pp Tạ Văn Bình (2003), "Dịch tễ học bệnh đái tháo đƣờng - Các yếu tố nguy vấn đề liên quan đến quản lý bệnh đái tháo đƣờng khu vực nội thành thành phố lớn.", Nhà xuất Y học, Hà Nội, pp Nguyễn Thị Đông (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết động vật thực nghiệm phân đoạn dịch chiết chloroform từ thân ý dĩ", Luận văn thạc sĩ trường đại học Dược Hà Nội, pp Phạm Hoàng Hộ (2000), "Cây cỏ Việt Nam 2", NXB trẻ, pp 738-740 Đặng Lan Hƣơng (2015), Nghiên cứu triển khai kỹ thuật tách chiết ARN từ mô động vật RT-PCR Phùng Thanh Hƣơng (2010), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết ảnh hƣởng chuyển hóa glucose dịch chiết lăng nƣớc (Lagerstroemia speciosa L Pers.) Việt Nam Phùng Thanh Hƣơng, Phạm Hà Thanh Tùng (2014), "Đánh giá tác dụng hạ glucose máu thực nghiệm loài Gymnema R Br Việt Nam", Tạp chí dược học, (Số ), pp 6,7,8 Vũ Ngọc Lộ (2005), "Những dƣợc liệu có tác dụng hạ glucose máu điều trị bệnh tiểu đƣờng", Tạp chí dược học, (số 9), pp tr 6, 7, Phạm Văn Thanh (2001), "Nghiên cứu thuốc điều trị bệnh đái tháo đƣờng từ mƣớp đắng (Momordica charantia)", luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, pp 10 Đinh Thị Thu Thủy (2014), "Đánh giá tác dụng hạ glucose máu dịch chiết loài chi Gymnema R.Br Việt Nam", Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ trường đại học Dược Hà Nội, pp 11 Nguyễn Ngọc Tú (2013), "Nghiên cứu phân loại chi Gymnema R.BR thu Việt Nam sử dụng vân tay hóa học HPTLC", Luận văn thạc sĩ trường đại học Dược Hà Nội, pp 12 Phạm Hà Thanh Tùng (2012), "Nghiên cứu tính đa dạng thực vật thành phần hóa học loài chi Gymnema R.BR Việt Nam", Luận văn thạc sĩ trường đại học Dược Hà Nội, pp 1-85 13 Bệnh viện nội tiết Trung ƣơng (2013), "Báo cáo hội nghị tổng kết hoạt động Dự án phòng chống Đái tháo đƣờng quốc gia năm 2012 triển khai kế hoạch năm 2013", pp Tiếng Anh 14 American Diabetes Association (2016), "Standards of medical care in diabetes", diabetes care, 39, pp 15 American Diabetes Association (2014), "Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus", Diabetes care, (37), pp S80-S92 16 Argaud D., Kirby T L., et al (1997), "Stimulation of glucose-6-phosphatase gene expression by glucose and fructose-2,6-bisphosphate", J Biol Chem, 272(19), pp 12854-61 17 Argaud D., Zhang Q., et al (1996), "Regulation of rat liver glucose-6phosphatase gene expression in different nutritional and hormonal states: gene structure and 5'-flanking sequence", Diabetes, 45(11), pp 1563-71 18 Brunton Laurence L., Chabner Bruce A., et al (2010), "Goodman and Gilman's the pharmacological basic of therapeutics 12th edition, Chapter 43: Endocrine Pancreas and pharmacotherapy of diabetes mellitus and hypoglycemia", The McGraw-Hill companies, pp 19 Chanwitheesuk Anchana, Teerawutgulrag Aphiwat, et al (2005), "Screening of antioxidant activity and antioxidant compounds of some edible plants of Thailand", Food Chemistry, 92(3), pp 491-497 20 Chiabchalard Anchalee, Tencomnao Tewin, et al (2010), "Effect of Gymnema inodorum on postprandial peak plasma glucose levels in healthy human", African Journal of Biotechnology, 9(7), pp 1079-1085 21 Cho N., Momose Y (2008), "Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists as insulin sensitizers: from the discovery to recent progress", Curr Top Med Chem, 8(17), pp 1483-507 22 Duc Son L N., Kusama K., et al (2004), "Prevalence and risk factors for diabetes in Ho Chi Minh City, Vietnam", Diabet Med, 21(4), pp 371-6 23 E Farrell R (2005), "RNA methodologies: a laboratory guide for isolation and characterization ", Elsevier/Focal Press, Amsterdam, pp 24 Flora of China Editorial Committee (1988), "Flora of China (Checklist & Addendum)", Science Press & Missouri Botanical Garden Press, Beijing & St Louis, pp Unpaginated 25 Foster J D., Pederson B A., et al (1997), "Glucose-6-phosphatase structure, regulation, and function: an update", Proc Soc Exp Biol Med, 215(4), pp 314-32 26 Gelman L., Feige J N., et al (2007), "Molecular basis of selective PPARgamma modulation for the treatment of Type diabetes", Biochim Biophys Acta, 1771(8), pp 1094-107 27 Ghosh A., Shieh J J., et al (2002), "The catalytic center of glucose-6phosphatase HIS176 is the nucleophile forming the phosphohistidineenzyme intermediate during catalysis", J Biol Chem, 277(36), pp 32837-42 28 Goto Hideyuki, Matsushima Masaaki, et al (2014), "Glucose-6-phosphatase Activity in Rat Bone", Agricultural and Biological Chemistry, pp 2455- 2456 29 Guo S (2014), "Insulin signaling, resistance, and the metabolic syndrome: insights from mouse models into disease mechanisms", J Endocrinol, 220(2), pp T1-t23 30 Hutton J C., O'Brien R M (2009), "Glucose-6-phosphatase catalytic subunit gene family", J Biol Chem, 284(43), pp 29241-5 31 I Pablo, M Jose, et al (2012), "The Metabolic Syndrome in Hispanics – The Role of Insulin Resistance and Inflammation", pp 32 International Diabetes Federation (2015), "IDF diabetes atlat ", pp 11-19 33 Livak K J., Schmittgen T D (2001), "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method", Methods, 25(4), pp 402-8 34 Marcolongo P., Fulceri R., et al (2013), "Multiple roles of glucose-6phosphatases in pathophysiology: state of the art and future trends", Biochim Biophys Acta, 1830(3), pp 2608-18 35 Massillon D., Barzilai N., et al (1997), "Induction of hepatic glucose-6phosphatase gene expression by lipid infusion", Diabetes, 46(1), pp 153-7 36 Mentreddy S.R., Mohamed A.I., et al "Medical plants with hypoglycemic/anti-heperglycemic properties: a review", pp 1-13 37 Mikhail N (2011), "Quick-release bromocriptine for treatment of type diabetes", Curr Drug Deliv, 8(5), pp 511-6 38 Mithieux G., Rajas F., et al (2004), "A novel role for glucose 6-phosphatase in the small intestine in the control of glucose homeostasis", J Biol Chem, 279(43), pp 44231-4 39 Nelson David L., Cox Michael M (2007), "Lehningger principles of biochemistry 5th, chapter 23: hormonal regulation and fuel metabolism.", pp 40 O'Brien R M., Streeper R S., et al (2001), "Insulin-regulated gene expression", Biochem Soc Trans, 29(Pt 4), pp 552-8 41 Ochayashi, Ryoko, et al (1993), "Diet food or beverage containing extract of Gymnema inodorum for preventing obesity", pp 42 Pan C J., Lei K J., et al (1998), "Transmembrane topology of glucose-6phosphatase", J Biol Chem, 273(11), pp 6144-8 43 Schaftingen Emile Van, Gerin Isabelle (2002), "Review article: The glucose6-phosphatase system", pp 44 Schmitz O., Brock B., et al (2004), "Amylin agonists: a novel approach in the treatment of diabetes", Diabetes, 53 Suppl 3, pp S233-8 45 Schmoll D., Allan B B., et al (1996), "Cloning and sequencing of the 5' region of the human glucose-6-phosphatase gene: transcriptional regulation by cAMP, insulin and glucocorticoids in H4IIE hepatoma cells", FEBS Lett, 383(1-2), pp 63-6 46 Schmoll D., Wasner C., et al (1999), "Identification of a cAMP response element within the glucose- 6-phosphatase hydrolytic subunit gene promoter which is involved in the transcriptional regulation by cAMP and glucocorticoids in H4IIE hepatoma cells", Biochem J, 338 ( Pt 2), pp 45763 47 Scientific Thermo (2015), "Product information: Thermo Scientific Dream Taq PCR Master Mix (2X)", pp 48 Scientific Thermo (2015), "Product information: Thermo Scientific Luminaris Color HiGreen qPCR Mastermix", pp 49 scientific Thermo (2015), "Protocol for first strand cADN synthesis", pp 50 Shimizu Kazumasa, Ozeki Mie, et al (2001), "Structure-Activity Relationships of Triterpenoid Derivatives Extracted From Gymnema inodorum Leaves on Glucose Absorption", pp 223-229 51 SHIMIZU Kazumasa, OZEKI Mie, et al (1997), "Suppression of Glucose Absorption by Extracts from the Leaves of Gymnema inodorum", pp 753757 52 Srisamatthakarn P., Chanrittisen T., et al (2013), "Effects of Processing on Antioxidant Properties of the Gymnema inodorum", International Symposium on Agri-Foods for Health and Wealth, pp 303-309 53 Zhang B B., Zhou G., et al (2009), "AMPK: an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome", Cell Metab, 9(5), pp 407-16 [...]... tinh: cốc có mỏ, pipet pasteur, ống đong, bình định mức, chai đựng hóa chất  Dụng cụ nhựa khác: hộp đựng mẫu, giá để ống eppendorf Các dụng cụ đều đạt chuẩn phân tích 2.2 Nội dung nghiên cứu Để thực hiện mục tiêu đánh giá ảnh hƣởng của các mẫu dịch chiết lá cây rau mỏ (Gymnema inodorum (Lour ) Dence) thu hái tại các địa phƣơng khác nhau đến mức độ biểu hiện gen của enzym G6Pase ở gan chuột, chúng... Image J Mức độ biểu hiện gen G6Pase đƣợc xác định bằng tỷ lệ đậm độ băng gen G6Pase và GAPDH 2.3.4 Phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu hiện gen của enzym G6Pase bằng kỹ thuật realtime PCR Tiến hành khuếch đại cADN vừa thu đƣợc bằng phản ứng realtime PCR với mồi đặc hiệu trên 2 gen: gen đích G6Pase và gen tham chiếu GAPDH Sản phẩm đƣợc phát hiện bằng chất phát huỳnh quang SYRB green Mức độ biểu hiện gen G6Pase. .. thể Thực nghiệm cho thấy, đột biến gen làm mất tác dụng của G6Pase sẽ gây ra triệu chứng hạ glucose máu nghiêm trọng, ngƣợc lại tăng cƣờng hoạt động G6Pase quá mức lại gây ra triệu chứng tăng glucose máu nhƣ chúng ta thƣờng thấy trong bệnh ĐTĐ [30] 1.2.4 Các yếu tố điều hòa biểu hiện gen của enzym G6Pase 1.2.4.1 Yếu tố kích thích biểu hiện gen của enzym G6Pase 13 Các nghiên cứu invivo ở gan, nghiên cứu. .. cần kiểm soát của các thuốc điều trị ĐTĐ làm đối tƣợng nghiên cứu cho đề tài của mình Mục tiêu của đề tài là: “Khảo sát ảnh hƣởng của các mẫu dịch chiết lá cây rau mỏ (Gymnema inodorum (Lour ) Decne) thu hái tại các địa phƣơng khác nhau đến mức độ biểu hiện gen của enzym G6Pase ở gan chuột 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đái tháo đƣờng do tụy (Diabetes melitus) 1.1.1 Định nghĩa Theo Hiệp hội Đái tháo đƣờng... hình hoạt động của enzym G6Pase [30] 1.2.3 Vai trò của G6Pase ở gan G6Pase đƣợc biểu hiện chủ yếu ở gan, chỉ một lƣợng rất thấp đƣợc tìm thấy ở thận, niêm mạc ruột non [38], đảo tụy [30] và xƣơng [28] Vai trò sinh lý quan trọng của G6Pase ở gan là điều hòa cân bằng glucose máu trong cơ thể, cụ thể là duy trì liên tục mức độ ổn định của glucose máu [30] Khi lƣợng glucose trong máu giảm xuống, G6Pase sẽ... bào có nguồn gốc ở gan hoặc nghiên cứu tế bào gan nguyên sơ (primary hepatocyte) đều chỉ ra rằng các yếu tố: glucagon, glucose, glucocorticoid và acid béo, tất cả đều kích thích biểu hiện gen của G6Pase [16], [17], [35], [45], [46] 1.2.4.2 Các yếu tố ức chế biểu hiện gen của enzym G6Pase Insulin có tác dụng ức chế biểu hiện gen G6Pase [25], [30], [34] Cụ thể, insulin gắn vào receptor ở màng tế bào làm... phosphoryl hóa diễn và cuối cùng dẫn tới ức chế biểu hiện gen G6Pase [29], [31], [40] Ngoài insulin còn có các yếu tố nhƣ: yếu tố hoại tử mô và interleukin-6 cũng có khả năng ức chế biểu hiện gen của G6Pase [31] 1.3 Cây rau mỏ (Gymnema inodorum (Lour ) Dence) 1.3.1 Vị trí, phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan (2009), vị trí phân loại của Gymnema inodorum (Lour ) Dence nhƣ sau: ngành Ngọc lan (magnoliophyta),... máu quá cao, enzym này sẽ giảm hoạt động, kết quả là 12 G6P sẽ đƣợc giữ lại trong tế bào gan Điều này có thể đƣợc thực hiện là do G6Pase xúc tác cho phản ứng cuối cùng của cả hai con đƣờng sản xuất glucose ở gan là tân tạo đƣờng và phân giải glycogen [34] (Hình 1.5) Hình 1.5 Vai trò của enzym G6Pase ở gan [34] Với vai trò quan trọng nhƣ vậy, G6Pase dù trong trƣờng hợp đƣợc kích thích quá mức hay bị ức... (Hình 1.2) nên hoạt động xúc tác của G6Pase cũng diễn ra trong khoang này [27], [42] 10 Hình 1.2 Cấu trúc của enzym G6Pase [27] 1.2.2 Cơ chế hoạt động G6Pase là một enzym xúc tác cho quá trình thủy phân Glucose-6-phosphat (G6P) thành phosphat vô cơ và glucose tự do Trong cơ chế hoạt động của G6Pase, His176 đóng vai trò quan trọng Khi cơ chất G6P đến gắn vào vị trí hoạt động của enzym nó sẽ tạo liên... máu của loài Gymnema inodorum (Lour ) Dence ở Việt Nam, góp phần vào việc nâng cao hiệu quả điều trị cũng nhƣ độ an toàn của một loài dƣợc liệu tiềm năng chúng tôi lựa chọn enzym glucose-6-phosphatase (G6Pase) , enzym chìa khóa trong hệ thống điều hòa glucose máu, một trong những đích tác dụng quan trọng, cần kiểm soát của các thuốc điều trị ĐTĐ làm đối tƣợng nghiên cứu cho đề tài của mình Mục tiêu của