BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THỊ HOA 1101190 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 182.15 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - LÊ THỊ HOA 1101190 GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 182.15 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Cao Văn Thu Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh – Sinh học HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Cao Văn Thu đã trực tiếp hướng dẫn thực hiện và hoàn thành khóa luận này Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại bộ môn Vi sinh – Sinh học, bộ môn Công nghiệp Dược trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên Quốc gia Hà Nội, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội Nhân dịp này, cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, cùng toàn thể các thầy giáo, cô giáo, cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực hiện khóa luận này Do còn hạn chế về thời gian, phương tiện, kinh phí và trình độ của bản thân, chắc chắn khóa luận này không tránh khỏi thiếu sót, rất mong nhận được những ý kiến đóng góp của các thầy cô và bạn bè để khóa luận này được hoàn thiện Tôi xin chân thành cảm ơn Hà Nội, Ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên LÊ THỊ HOA MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh 1.1.2 Phân loại kháng sinh 1.1.3 Cơ chế tác dụng của kháng sinh 1.1.4 Các ứng dụng của kháng sinh 1.1.5 Giới thiệu về tính kháng kháng sinh 1.1.6 Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh 1.2 Đại cương về xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 1.2.2 Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces 1.2.3 Một số khóa phân loại của xạ khuẩn 1.2.4 Khả sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 1.3 Tuyển chọn, cải tạo và bảo quản giống xạ khuẩn 1.3.1 Mục đích 1.3.2 Chọn giống có HTKS cao bằng sàng lọc ngẫu nhiên 1.3.3 Đột biến cải tạo giống 1.3.4 Bảo quản giống xạ khuẩn 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men 1.4.2 Các phương pháp lên men 1.4.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 10 1.5 Chiết tách và tinh chế kháng sinh từ dịch lên men 10 1.5.1 Vai trò của chiết tách và tinh chế kháng sinh 10 1.5.2 Chiết xuất 11 1.5.3 Tinh chế 11 1.6 Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 12 1.6.1 Phổ tử ngoại – khả kiến 12 1.6.2 Phổ hồng ngoại 12 1.6.3 Phổ khối MS 13 1.6.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 13 1.7 Các nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces nước thế giới 14 1.7.1 Nghiên cứu kháng sinh kháng nấm mới từ Streptomyces setonii 14 1.7.2 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces microflavus 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 2.1.2 Máy móc, thiết bị 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 19 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống 19 2.2.2 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh 19 2.2.3 Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của KS thu được 20 2.3 Phương pháp thực nghiệm 20 2.3.1 Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 20 2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán 20 2.3.3 Phương pháp chọn chủng có HTKS cao bằng SLNN 21 2.3.4 Đột biến bằng tia UV 22 2.3.5 Đột biến bằng tác nhân hóa học HNO2 23 2.3.6 Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.7 Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu 24 2.3.8 Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 24 2.3.9 Tinh chế kháng sinh thô bằng sắc ký cột 24 2.3.10 Tách các thành phần kháng sinh bằng SKLM 25 2.3.11 Sơ bộ xác định kháng sinh tinh khiết thu được 26 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Nâng cao khả sinh tổng hợp kháng sinh 27 3.1.1 Kết quả SLNN chủng Streptomyces 182.15 27 3.1.2 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 28 3.1.3 Kết quả đột biến UV cải tạo giống lần 29 3.1.4 Kết quả đột biến hóa học cải tạo giống lần 30 3.2 Kết quả chọn chủng lên men 31 3.3 Kết quả sắc ký cột 31 3.3.1 Kết quả chạy sắc ký cột lần 31 3.3.2 Kết quả chạy sắc ký cột lần 33 3.3.3 Kết quả chạy sắc ký cột lần 34 3.3.4 Kết quả chạy sắc ký cột lần 34 3.4 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 35 3.4.1 Nhiệt độ nóng chảy 35 3.4.2 Phổ UV-VIS 35 3.4.3 Phổ hồng ngoại 35 3.4.4 Phổ khối MS 36 3.4.5 Phổ cộng hưởng từ NMR 36 BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 Kết luận 39 Kiến nghị 40 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT AND Acid 2’- deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic DM Dung môi ĐB Đột biến Gr Gram Gr(+) Gram dương Gr(-) Gram âm ISP Chương trình Streptomyces quốc tế IR Hồng ngoại – Infrared HTKS Hoạt tính kháng sinh KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MS Phố khối – Mass spectrometry MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên UV Tử ngoại – Ultraviolet VSV Vi sinh vật B pumilus Bacillus pumilus S flexneri Shighella flexneri ̅ 𝐷 Đường kính trung bình S Sai số chuẩn có hiệu chỉnh WHO Tổ chức Y tế thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học Bảng 2.1: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.3: Các dung môi hóa học Bảng 3.1: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.2: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sau đột biến UV lần Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần bằng hóa học Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS chọn chủng lên men chìm tốt nhất Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.7: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.8: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.9: Kết quả SKLM của các phân đoạn sau chạy cột lần Bảng 3.10: Kết quả phổ IR DANH MỤC CÁC HÌNH Hình P1: Sơ đồ tổng quát sinh tổng hợp kháng sinh Hình P2: Sơ đồ phân loại xạ khuẩn Hình P3: Đường cong sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn Hình P4: Nuôi cấy giữ giống thạch nghiêng Hình P5: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch Hình P6: Khuẩn lạc sau đột biến UV Hình P7: Bình chứa dịch lên men Hình P8: Chạy sắc ký cột Hình P9: Phổ UV-VIS Hình P10: Phổ IR Hình P11: Phổ MS Hình P12: Phổ NMR ĐẶT VẤN ĐỀ Từ kháng sinh được tìm và ứng dụng rộng rãi thì đã có rất nhiều bệnh vi khuẩn gây từng được coi là nan y đã được chữa trị thành công Nhưng hiện kháng kháng sinh là vấn đề của toàn cầu, đặc biệt nổi trội ở các nước phát triển đó có Việt Nam Mỗi năm, WHO xác định thế giới có hàng trăm nghìn người chết kháng thuốc phải chi hàng tỷ USD [1] Điều thách thức của nhà khoa học cần nghiên cứu cải tiến nâng cao hoạt tính kháng sinh nữa Ngày nay, với sự phát triển của công nghệ, khoa học kỹ thuật, kháng sinh mới thường được tổng hợp theo hướng chính: tổng hợp hóa học, bán tổng hợp và sinh tổng hợp Vi sinh vật có khả tổng hợp kháng sinh rất đa dạng và phong phú có thể là vi khuẩn, xạ khuẩn hay vi nấm Trong đó, chi xạ khuẩn Streptomyces có nhiều loài xạ khuẩn có khả tổng hợp kháng sinh đa dạng về cấu trúc và khả kháng khuẩn cả Ngoài một số loài chi này còn tổng hợp được các chất chữa trị ung thư Do đó, tại Bộ môn Vi Sinh – sinh học trường Đại học Dược Hà Nội lựa chọn đề tài: “Góp phần nghiên cứu nâng cao khả tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 182.15” với những mục tiêu sau: - Chọn lọc, cải tạo giống để nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh - Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh - Sơ bộ xác định một số tính chất và cấu trúc của kháng sinh thu được Hình P8: Chạy sắc ký cột Hình P9: Phổ UV-VIS Hình P10: Phổ IR Hình P11 : Phổ MS Hình P12 : Phổ NMR [...]... hạt nhân để sơ bộ dự đoán cấu trúc kháng sinh 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM, NHẬN XÉT VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nâng cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh 3.1.1 Kết quả SLNN chủng Streptomyces 182.15 Từ chủng gốc Streptomyces 182.15, chúng tôi đã SLNN trên môi trường phân lập MT1, thu được 36 dạng chủng và đem thử hoạt tính kháng sinh bằng phương pháp khối thạch với VSV kiểm... dung nghiên cứu 2.2.1 Chọn lọc, cải tạo giống - Tiến hành SLNN, lựa chọn các dạng chủng có HTKS cao nhất - Đột biến bằng ánh sáng UV, bằng tác nhân hóa học HNO2 để nâng cao hoạt tính của Streptomyces 182.15 2.2.2 Lên men, chiết tách, tinh chế kháng sinh - Từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn chủng (biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh. .. thấp [8], [14] 1.1.2 Phân loại kháng sinh Có nhiều cách phân loại kháng sinh: theo nguồn gốc, theo tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh, theo cơ chế tác dụng, theo cấu trúc hóa học… Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học là khoa học nhất vì nó giúp cho người nghiên cứu nhanh chóng định hướng được các đặc điểm của chất kháng sinh mới phát hiện khi biết được... cộng hưởng là 13C Thang độ chuyển dịch hóa học từ 0-200ppm [2], [7], [18] 1.7 Các nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces trong nước và trên thế giới 1.7.1 Nghiên cứu kháng sinh kháng nấm mới từ Streptomyces setonii Xạ khuẩn được phân loại theo khóa phân loại ISP cho thấy Streptomyces setonii có các đặc điểm hình thái như chuỗi bào tử thẳng hơi cong,... sắc tố melanoid Streptomyces setonii có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15-34°C, tuy nhiên nhiệt độ tối ưu là 25-30°C Streptomyces setonii thủy phân được tinh bột, có thể hóa lỏng gelatin nhưng không đông sữa Lên men sinh tổng hợp kháng sinh được tiến hành trong môi trường (chứa tinh bột 2%, cao nấm men 1%), ở 15 nhiệt độ 30°C trong 1 tuần Kháng sinh tạo thành... với liều 1g/kg thì không xuất hiện độc tính [17] 1.7.2 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces microflavus Streptomyces 15.29 là xạ khuẩn gốc được phân lập từ đất việt nam Phân loại theo ISP và giải trình tự gen 16s rADN chúng tôi đã cơ bản xác định được Streptomyces 15.29 có tên khoa học là Streptomyces microflavus Cải tạo giống qua sàng lọc ngẫu... sau đột biến đã làm tăng trưởng được hiệu suất tổng hợp kháng sinh của chủng Biến chủng Streptomyces 15.29.21.23 là biến chủng tốt nhất hiện tại mà chúng tôi tạo được Từ dịch lọc dịch lên men kháng sinh chiết được tốt nhất bằng etylacetat ở pH 5,0 Kết quả kiểm tra sắc ký TLC cho thấy hỗn hợp kháng sinh có ít nhất 4 thành phần, trong đó thành phần chính chiếm...2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Kháng sinh là những sản phẩm đặc biệt nhận được từ VSV hay các nguồn khác có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc lên một nhóm VSV xác định (vi khuẩn, nấm, động vật nguyên sinh, ) hay tế bào ung thư ở nồng độ... tử và khả năng tiêu thụ các nguồn hydratcarbon [5], [14], [18] Tuy nhiên ngày nay, việc áp dụng kỹ thuật xác định trình tự gen 16s rADN để phân loại xạ khuẩn đã và đang được áp dụng Ưu điểm là cho kết quả khá chính xác, đáng tin cậy [14] 1.2.4 Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có khả năng tạo ra... xạ khuẩn trên MT thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 2oC và định kỳ 3-6 tháng cấy lại 1 lần [9], [11], [12], [13] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Khái niệm lên men Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của VSV nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các hợp