BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU THẢO XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN BESYLAT, HYDROCLOROTHIAZID VÀ VALSARTAN TRONG VIÊN NÉN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU THẢO XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI AMLODIPIN BESYLAT, HYDROCLOROTHIAZID VÀ VALSARTAN TRONG VIÊN NÉN BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC - ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60720410 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Đoàn Cao Sơn HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài này, nhận đƣợc hƣớng dẫn giúp đỡ tận tình mặt từ thầy cô, bạn bè đồng nghiêp Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Đoàn Cao Sơn – Viện trƣởng Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng, ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới anh chị em, bạn bè đồng nghiệp Khoa Kiểm nghiệm dạng bào chế - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ƣơng giúp đỡ tạo điều kiện mặt cho suốt trình thực luận văn Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu trƣờng Đại học dƣợc Hà Nội, thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ suốt trình học tập trƣờng Cuối cùng, xin bày tỏ long biết ơn tới gia đình, bạn bè, ngƣời sát cánh động viên, ủng hộ giúp hoàn thành khóa học luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2016 Học viên Nguyễn Hữu Thảo MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng, biểu Danh mục hình vẽ, đồ thị ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………… Chƣơng TỔNG QUAN……………………………………………… 1.1 TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN BESYLAT, HYDROCLOROTHIAZID VÀ VALSARTAN………………… 1.1.1 Tổng quan Amlodipin besylat……………………………… 1.1.2 Tổng quan Hydroclorothiazid………………………………… 1.1.3 Tổng quan Valsartan…………………………………………… 10 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO………… 13 1.2.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng………………………………… 13 1.2.2 Một số thông số đặc trƣng………………………………………… 16 1.2.3 Ứng dụng………………………………………………………… 17 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU… 19 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU…………………………………… 19 2.1.1 Chất đối chiếu……………………………………………………… 19 2.1.2 Chế phẩm thử……………………………………………………… 19 2.1.3 Dung môi, hóa chất………………………………………………… 20 1.2 2.1.4 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu……………………………………… 20 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………… 21 2.2.1 Xây dựng phƣơng pháp xử lý mẫu………………………………… 21 2.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký………………………………………… 21 2.2.3 Thẩm định phƣơng pháp…………………………………………… 21 2.2.4 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích số chế phẩm thị trƣờng 21 2.3 22 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………… 2.3.1 Xây dựng thẩm định phƣơng pháp định tính, định lƣợng đồng thời Amlodipin besylat, Hydrochlorothiazid Valsartan……………… 22 2.3.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp…………………………… 22 2.3.1.2 Thẩm định phƣơng pháp phân tích……………………………… 23 2.3.2 Ứng dụng phƣơng pháp phân tích số chế phẩm thị trƣờng 26 2.3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu………………………………………… 26 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU………………………………… 27 3.1 CHUẨN BỊ MẪU………………………………………………… 27 3.1.1 Mẫu chuẩn………………………………………………………… 27 3.1.1.1 Pha dung dịch chuẩn gốc AML………………………………… 27 3.1.1.2 Pha dung dịch chuẩn gốc HCT………………………………… 27 3.1.1.3 Pha dung dịch chuẩn hỗn hợp gốc……………………………… 27 3.1.2 Mẫu thử…………………………………………………………… 27 3.1.3 Mẫu placebo tự tạo………………………………………………… 28 LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 28 3.2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu……………………………………… 28 3.2.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký………………………………………… 28 3.2 3.2.2.1 Bƣớc sóng phát hiện……………………………………………… 28 3.2.2.2 Pha động ………………………………………………………… 29 3.2.2.3 Cột sắc ký ……………………………………………………… 31 THẨM ĐỊNH PHƢƠNG PHÁP………………………………… 34 3.3.1 Định tính…………………………………………………………… 34 3.3.2 Định lƣợng………………………………………………………… 38 3.3.2.1 Tính chọn lọc ………………………………………………… 38 3.3.2.2 Tính thích hợp hệ thống………………………………………… 38 3.3.2.3 Độ tuyến tính…………………………………………………… 39 3.3.2.4 Độ đúng………………………………………………………… 41 3.3.2.5 Độ xác…………………………………………………… 44 3.3.2.6 Độ thô…………………………………………………………… 46 ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẾ PHẨM… 50 3.4.1 Định lƣợng viên nén Exforge……………………………………… 50 3.4.2 Định lƣợng viên nén Co-Diovan…………………………………… 51 3.4.3 Định lƣợng viên nén Normodipine………………………………… 52 Chƣơng BÀN LUẬN………………………………………………… 55 4.1 Về phƣơng pháp HPLC…………………………………………… 55 4.2 Về thẩm định phƣơng pháp phân tích……………………………… 56 4.3 Về ứng dụng phƣơng pháp…………………………………… 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………… 59 3.3 3.4 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AAB Acid acetic băng ACN Acetonitril AML Amlodipin BP Dƣợc điển Anh CH3COONH4 Amoni acetat DĐVN Dƣợc điển Việt Nam H3PO4 Acid phosphoric HCl Acid hydrocloric HCT Hydroclorothiazid HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao JP Dƣợc điển Nhật KH2PO4 Kali dihydrophosphat KP Dƣợc điển Hàn Quốc LC-MS Sắc ký lỏng – khối phổ MeOH Methanol NaH2PO4 Natri dihydrophosphat NP-HPLC Sắc ký lỏng pha thuận RP-HPLC Sắc ký lỏng pha đảo RSD Độ lệch chuẩn tƣơng đối TEA Triethylamin THF Tetrahydrofuran USP Dƣợc điển Mỹ UV-VIS Quang phổ tử ngoại – khả kiến VAL Valsartan DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU Bảng Nội dung Trang 1.1 Một số nghiên cứu định lƣợng AML HPLC 1.2 Một số nghiên cứu định lƣợng HCT HPLC 1.3 Một số nghiên cứu định lƣợng VAL HPLC 12 2.4 Các hóa chất dung môi sử dụng trình thí nghiệm 20 3.5 Khảo sát tỷ lệ pha động 30 3.6 Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống 38 3.7 Kết thẩm định độ tuyến tính 39 3.8 Kết thẩm định độ AML 42 3.9 Kết thẩm định độ HCT 43 3.10 Kết thẩm định độ VAL 43 3.11 Kết thẩm định độ lặp lại phƣơng pháp 44 3.12 Kết thẩm định độ tái lặp phƣơng pháp 45 3.13 Kết đánh giá độ thô thay đổi chiều dài cột 47 3.14 Kết đánh giá độ thô thay đổi pH dung dịch đệm 48 3.15 Kết đánh giá độ thô thay đổi tỷ lệ % ACN 48 3.16 Kết đánh giá độ thô thay đổi tốc độ dòng 49 3.17 Kết định lƣợng viên nén Exforge 51 3.18 Kết định lƣợng viên nén Co-Diovan 52 3.19 Kết định lƣợng viên nén Normodipine 53 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang 1.1 Công thức cấu tạo Amlodipin besylat 1.2 Công thức cấu tạo Hydroclorothiazid 1.3 Công thức cấu tạo Valsartan 10 1.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao 15 3.5 Phổ hấp thụ UV chất 29 3.6 Sắc ký đồ khảo sát cỡ hạt sắc ký 32 3.7 Khảo sát cột hãng khác 33 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn đơn, chuẩn hỗn hợp, mẫu 36 placebo mẫu thử 3.9 Chồng phổ UV-VIS chất 37 3.10 Phổ tinh khiết píc HCT, AML VAL 38 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính diện tích 40 píc nồng độ HCT, AML, VAL ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tim mạch nguyên nhân gây tử vong tàn phế lớn giới chiếm tỷ lệ cao, ngƣời đứng tuổi ngƣời già Bệnh tim mạch thể dƣới thể khác nhƣ suy tim, tăng huyết áp, rối loạn nhịp, đau thắt ngực, rối loạn tuần hoàn não, tăng lipid – huyết …Trong đó, bệnh tăng huyết áp (THA) yếu tố nguy tim mạch quan trọng nguyên nhân hàng đầu dẫn đến tỷ lệ tử vong tỷ lệ mắc bệnh toàn cầu cao nguyên nhân khác nhƣ sử dụng thuốc hay tăng đƣờng huyết Tại Việt Nam, tần suất bệnh THA ngƣời lớn ngày gia tăng Trong năm 1960, tỷ lệ THA khoảng 1%; năm 1992 11,2%; năm 2001 16,3% năm 2005 18,3% Theo điều tra gần (2008) Viện Tim mạch Việt Nam tiến hành ngƣời lớn (≥ 25 tuổi) tỉnh thành phố nƣớc ta thấy tỷ lệ THA tăng lên đến 25,1% [8] Theo “Hƣớng dẫn chẩn đoán điều trị tăng huyết áp” Bộ Y Tế (2010) (phụ lục 6) [5] có quy định số loại thuốc điều trị tăng huyết áp nhƣ sau: Nhóm thuốc dùng đƣờng uống (lợi tiểu, chẹn kênh calci, tác động lên hệ renin angiotensin, chẹn beta giao cảm, chẹn alpha giao cảm, tác động lên hệ giao cảm trung ƣơng, giãn mạch trực tiếp) Nhóm thuốc dùng qua đƣờng tĩnh mạch (Nitroglycerin, Nicardipine, Natri nitroprusside, Esmolol, Labetalol, Hydralazine, Enalaprilat) Ngày nay, với phát triển ngày cao công nghệ nghiên cứu bào chế dƣợc phẩm, thuốc đa thành phần nhằm phối hợp tác dụng dƣợc lý dƣợc chất đƣợc sản xuất, lƣu hành sử dụng phổ biến giới nƣớc Một số phối hợp thuốc tác động lên hệ renin angiotensin (Valsartan) với thuốc lợi tiểu (Hydroclorothiazid), thuốc tác động lên hệ renin angiotensin (Valsartan) với thuốc chẹn kênh calci (Amlodipin) ml, pha loãng pha động đến vừa đủ thể tích Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp dung dịch thử với phƣơng pháp xây dựng so sánh với số liệu thu đƣợc từ phƣơng pháp nhà sản xuất, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.17 Bảng 3.17: Kết định lƣợng viên nén Exforge Tên mẫu Phƣơng pháp xây dựng Số liệu phƣơng pháp NSX % AML % VAL % AML % VAL Thử 95,79 97,69 96,03 97,06 Thử 96,05 98,10 96,21 98,15 Thử 95,92 98,39 96,42 98,31 Trung bình 95,9 98,1 96,2 97,8 RSD (%) 0,1 0,4 0,2 0,7 Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp, sử dụng hàm two-sample t-test phần mềm Microsoft office Excel 2007 Kết thu đƣợc giá trị p-value lớn 0,05 (ttn < ttc) hai hoạt chất cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp ý nghĩa thống kê 3.4.2 Định lƣợng viên nén Co-Diovan Cân xác 10 viên nén bao phim Co-Diovan, tính khối lƣợng trung bình viên Nghiền mịn Cân xác lƣợng bột viên tƣơng ứng khoảng 100 mg VAL cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu âm 15 phút Thêm MeOH đến vạch, lắc Ly tâm 4000 vòng/phút phút Hút xác ml dịch cho vào bình định mức 25 51 ml, pha loãng pha động đến vừa đủ thể tích Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp dung dịch thử với phƣơng pháp xây dựng so sánh với số liệu thu đƣợc từ phƣơng pháp nhà sản xuất, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.18 Bảng 3.18: Kết định lƣợng viên nén Co-Diovan Tên mẫu Phƣơng pháp xây dựng Số liệu phƣơng pháp NSX % HCT % VAL % HCT % VAL Thử 97,68 95,93 98,02 96,14 Thử 97,89 95,13 98,30 95,85 Thử 98,48 94,59 98,76 95,34 Trung bình 98,0 95,2 98,4 95,8 RSD (%) 0,4 0,7 0,4 0,4 Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp, sử dụng hàm two-sample t-test phần mềm Microsoft office Excel 2007 Kết thu đƣợc giá trị p-value lớn 0,05 (ttn < ttc) hai hoạt chất cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp ý nghĩa thống kê 3.4.3 Định lƣợng viên nén Normodipine Cân xác 10 viên nén bao phim Normodipine, tính khối lƣợng trung bình viên Nghiền mịn Cân xác lƣợng bột viên tƣơng ứng khoảng 6,25 mg AML cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 30 ml MeOH, siêu âm 15 phút Thêm MeOH đến vạch, lắc Ly tâm 4000 vòng/phút phút Hút xác ml dịch cho vào bình 52 định mức 25 ml, pha loãng pha động đến vừa đủ thể tích Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp dung dịch thử với phƣơng pháp xây dựng so sánh với số liệu thu đƣợc từ phƣơng pháp nhà sản xuất, thu đƣợc kết nhƣ bảng 3.19 Bảng 3.19: Kết định lƣợng viên nén Normodipine Tên mẫu % AML Phƣơng pháp xây dựng Số liệu phƣơng pháp NSX Thử 95,36 94,97 Thử 95,29 95,35 Thử 95,64 95,28 Trung bình 95,4 95,2 RSD (%) 0,2 0,2 Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp, sử dụng hàm two-sample t-test phần mềm Microsoft office Excel 2007 Kết thu đƣợc giá trị p-value lớn 0,05 (ttn < ttc) cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp ý nghĩa thống kê Sau ứng dụng phƣơng pháp xây dựng để kiểm nghiệm số chế phẩm thị trƣờng so sánh với số liệu đƣa nhà sản xuất nhận thấy phƣơng pháp xây dựng có tính thiết thực thích hợp với số sản phẩm nhà sản xuất khác Nhận xét chung: Phƣơng pháp xây dựng đƣợc thẩm định phù hợp với hệ thống phân tích, có tính chọn lọc cao, khoảng tuyến tính rộng (0,0025 mg/ml – 0,025 53 mg/ml với AML; 0,003125 mg/ml – 0,03125 mg/ml với HCT 0,04 mg/ml – 0,4 mg/ml với VAL), có độ tốt độ xác cao, độ thô phù hợp với yêu cầu Phƣơng pháp đƣợc ứng dụng để phân tích định tính định lƣợng chế phẩm chứa thành phần AML, HCT VAL 54 Chƣơng BÀN LUẬN 4.1 Về phƣơng pháp HLPC Để định lƣợng ba hoạt chất AML, HCT VAL viên thành phần có nhiều phƣơng pháp đƣợc nghiên cứu: quang phổ hấp thụ UVVIS [12], [33]; quang phổ đạo hàm [25]; phƣơng pháp HPLC [26]; hay phƣơng pháp LC-MS [29] Nhiều nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS Trong phƣơng pháp này, thƣờng không định lƣợng đồng thời đƣợc hoạt chất AML, HCT VAL (vì thông thƣờng chế phẩm thuốc, VAL thƣờng có hàm lƣợng cao nhiều so với AML HCT nên thƣờng hệ số pha loãng lớn hoạt chất lại) phải đo nhiều bƣớc sóng khác nên phức tạp nhiều thời gian Do đó, nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp HPLC phƣơng pháp có nhiều ƣu điểm: có tính chọn lọc cao, độ nhạy cao, kết xác (thƣờng đƣợc sử dụng làm phƣơng pháp “trọng tài” cần đánh giá phƣơng pháp khác), phân tích mẫu hỗn hợp mà không cần chiết tách, định lƣợng đƣợc đồng thời ba hoạt chất điều kiện phân tích tự động hóa để phân tích lƣợng mẫu lớn Các chất phân tích AML, HCT VAL chất có tính phân cực, sử dụng chƣơng trình sắc ký lỏng pha đảo với hệ dung môi pha động phân cực, cột C18 để phân tích Trên sở tham khảo số tài liệu, khảo sát lựa chọn đƣợc điều kiện phân tích phù hợp để định lƣợng AMB, HCT VAL viên nén: Phƣơng pháp xử lý mẫu đơn giản: hòa tan ban đầu MeOH pha - loãng pha động Điều kiện sắc ký: + Cột phân tích pha đảo: Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; 5µm) loại cột thông dụng sở phân tích sử dụng HPLC 55 + Bƣớc sóng phát hiện: lựa chọn bƣớc sóng 238 nm bƣớc sóng cho đáp ứng tối ƣu AML (là hoạt chất có hàm lƣợng nhỏ) không bị ảnh hƣởng dung môi mẫu (UV cut-off ACN nƣớc 190 nm, MeOH 205 nm) Tại bƣớc sóng này, ba chất phân giải tốt, píc cân đối cƣờng độ hấp thụ phù hợp cho phép định lƣợng AML, HCT VAL Mặt khác, bƣớc sóng tử ngoại phù hợp với hệ sắc ký sử dụng detector UV, loại detector thông dụng đơn giản sở phân tích + Pha động: Đã khảo sát, đƣa thành phần tỷ lệ pha động hợp lý cho phép tách tốt ba hoạt chất AML, HCT VAL, thành phần pha động đơn giản, thông dụng (ACN : MeOH : Đệm KH2PO4 = 20 : 50 : 30) + Tốc độ dòng: chọn tốc độ dòng 1,0 ml/phút cho thời gian phân tích hợp lý (khoảng phút), áp suất cột vừa phải (126 bar) đảm bảo chất đƣợc tách tốt + Thể tích tiêm: 20 µl đảm bảo đáp ứng phân tích chất rõ ràng cân đối 4.2 Về thẩm định phƣơng pháp phân tích Để đảm bảo phƣơng pháp phân tích đạt yêu cầu quy định, tiến hành thẩm định tiêu tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ xác, độ thô a Tính thích hợp hệ thống Kết thẩm định tính thích hợp hệ thống cho thấy RSD % thời gian lƣu diện tích píc hoạt chất từ 0,2 % đến 0,3 %, đạt so với yêu cầu không lớn 2,0 % Điều cho thấy hệ thống sắc ký phù hợp cho việc định lƣợng đồng thời AML, HCT VAL 56 Trong phần này, không đánh giá độ phân giải píc (RS) píc tách rõ rệt b Tính chọn lọc Trong nghiên cứu này, đối tƣợng phân tích viên nén bao phim Exforge HCT mẫu placebo tự tạo theo thành phần tá dƣợc chế phẩm Trên sắc ký đồ mẫu placebo, vị trí tƣơng ứng với thời gian lƣu AML, HCT VAL không thấy xuất píc lạ Píc hoạt chất gọn, cân xứng, hệ số chồng phổ UV-VIS hoạt chất xấp xỉ 1,0; hệ số tinh khiết píc chất dung dịch mẫu thử xấp xỉ 1,0 Do đó, phƣơng pháp có tính chọn lọc cao c Độ tuyến tính Chúng xây dựng khoảng tuyến tính đủ rộng đề ứng dụng đánh giá định lƣợng nhiều chế phẩm có tỉ lệ phối hợp khác Trong khoảng nồng độ tuyến tính 0,003125 – 0,03125 mg/ml HCT; 0,0025 – 0,025 mg/ml AML; 0,04 – 0,4 mg/ml VAL; hệ số tƣơng quan hồi quy xấp xỉ 1,0 Điều cho thấy có tƣơng quan tuyến tính chặt chẽ diện tích píc với nồng độ ba hoạt chất d Độ xác Kết thẩm định độ xác (bao gồm độ lặp lại độ tái lặp) cho kết quả: giá trị RSD % hàm lƣợng PTN < 2,0 %, giá trị RSD % hàm lƣợng PTN < 2,0 %, chênh lệch giá trị hàm lƣợng trung bình PTN < 2,0 % Bên cạnh sử dụng test thống kê t-test để kiểm tra khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc PTN cho giá trị p-value > 0,05 (ttn < ttc) Điều cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai PTN ý nghĩa thống kê Do đó, phƣơng pháp xây dựng có độ xác cao 57 e Độ Kết thẩm định độ cho tỷ lệ thu hồi khoảng từ 98,0 % - 102,0 %, giá trị RSD % < 2,0 % đáp ứng yêu cầu độ phƣơng pháp phân tích chế phẩm f Độ thô Khi tiến hành sắc ký, lần lƣợt thay đổi thông số nhƣ: chiều dài cột khoảng ± 75%; pH dung dịch đệm khoảng ± 0,2; tỉ lệ % ACN pha động khoảng ± 30% nồng độ tƣơng đối; tốc độ dòng khoảng ± 50% sử dụng test thống kê ANOVA-Single factor để đánh giá kết hàm lƣợng thu đƣợc lần phân tích Kết thu đƣợc giá trị p-value < 0,05 (Ftn < Ftc) cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc lần phân tích ý nghĩa thống kê Điều cho thấy phƣơng pháp có tính ổn định tốt phân tích 4.3 Về ứng dụng phƣơng pháp Chúng sử dụng phƣơng pháp xây dựng để kiểm nghiệm số chế phẩm có chứa AML, HCT VAL thị trƣờng so sánh với số liệu đƣa nhà sản xuất Để so sánh kết hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp, sử dụng test thống kê t-test để kiểm tra khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp cho giá trị p-value > 0,05 (ttn < ttc) Điều cho thấy khác biệt hàm lƣợng thu đƣợc hai phƣơng pháp ý nghĩa thống kê Do đó, phƣơng pháp xây dựng có tính thiết thực tính ứng dụng cao, phù hợp với nhiều chế phẩm khác 58 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thực nghiệm thu đƣợc, đạt đƣợc mục tiêu đề xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng đồng thời AML, HCT VAL viên nén đủ tin cậy, nhanh chóng thuận tiện Các kết thu đƣợc nhƣ sau: a Cách chuẩn bị mẫu thử mẫu chuẩn đơn giản, nhanh chóng: dung môi sử dụng MeOH dung môi đơn giản, không tốn kém, chuẩn bị mẫu phƣơng pháp hòa tan trực tiếp nên tiến hành đơn giản, nhanh chóng đồng thời gây sai số ngẫu nhiên b Chƣơng trình sắc ký lỏng hiệu cao xây dựng phù hợp ổn định để xác định AML, HCT VAL Chƣơng trình cụ thể nhƣ sau: - Cột: Cột phân tích pha đảo Phenomenex C18 (250 x 4,6 mm; µm) - Detector: UV 238 nm - Pha động: ACN – MeOH – Đệm KH2PO4 0,05M (pH 3,0) = 20 : 50 : 30 (Đệm KH2PO4 0,05M pH 3,0: Hòa tan 6,8 g KH2PO4 vừa đủ lít nƣớc, điều chỉnh pH 3,0 H3PO4 đặc) - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút - Thể tích tiêm: 20 µl c Bằng việc sử dụng máy HPLC kết nối với detector DAD, xác nhận píc HCT, AML VAL thu đƣợc sắc ký đồ mẫu thử tinh khiết, phổ UV-VIS chất mẫu chuẩn mẫu thử giống (hệ số chồng phổ xấp xỉ 1,0) d Đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp định tính định lƣợng nhanh, đơn giản, xác AML, HCT VAL viên nén Phƣơng pháp có tính chọn lọc cao, tính thích hợp hệ thống, khoảng tuyến tính rộng, độ xác cao, độ tốt độ thô đáp ứng yêu cầu 59 e Bằng phƣơng pháp HPLC xây dựng, ứng dụng đƣợc kiểm nghiệm số chế phẩm chứa HCT, AML VAL lƣu hành thị trƣờng KIẾN NGHỊ Cần áp dụng phƣơng pháp xây dựng kiểm nghiệm nhiều chế phẩm nhiều hãng sản xuất khác để đánh giá đƣợc tính ứng dụng phƣơng pháp Mặt khác, cần tiếp tục nghiên cứu đánh giá độ thô phƣơng pháp thay đổi số thông số nhƣ nồng độ muối, nhiệt độ buồng cột, kích cỡ hạt sắc ký, thể tích tiêm, chƣơng trình rửa giải gradient, sử dụng phần mềm tối ƣu hóa … để lựa chọn chƣơng trình sắc ký tối ƣu phục vụ công tác kiểm tra, giám sát chất lƣợng thuốc Tiếp tục nghiên cứu xây dựng, đánh giá tiêu độ hòa tan, tạp chất liên quan… để đƣa vào chuyên luận Dƣợc điển 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2015), Dược thư quốc gia Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr 187-188, tr 777-779, tr 1453-1455 Bộ Y tế (2010), Đảm bảo chất lượng thuốc số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, NXB Y học, Hà Nội, tr 158-179 Bộ Y tế (2012), Hóa phân tích dụng cụ, Tập 2, NXB Y học, Hà Nội, tr 126-143 Bộ Y tế (2010), Hướng dẫn chẩn đoán điều trị tăng huyết áp, Hà Nội Bộ Y tế (2014), “Hƣớng dẫn Asean thẩm định quy trình phân tích”, Thông tư 44/2014/TT-BYT Quy định việc đăng ký thuốc, tr 261-274 Cục Quản lý dƣợc (2013), “Sổ tay hƣớng dẫn đăng ký thuốc”, Quyết định số 07/QĐ-QLD việc ban hành Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8, tr 30-35 GS.TS Nguyễn Lân Việt (2011), “Tăng huyết áp-Vấn đề cần quan tâm hơn”, Dự án phòng, chống tăng huyết áp, Chƣơng trình mục tiêu quốc gia Tạ Mạnh Hùng, Nguyễn Thị Thanh Thảo, Hà Minh Hiền, Phùng Thị Vinh cộng (2010), “Nghiên cứu định lƣợng Amlodipin huyết tƣơng phƣơng pháp sắc ký lỏng khối phổ (LCMS/MS) áp dụng đánh giá tƣơng đƣơng sinh học”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, số 3.2010, tập (29), tr 1-5 Tiếng Anh 10 A C Moffat (1986), "Clarke's Isolation and Identification of drugs 2nd edition", The pharmaceutical press, pp 664 11 Alnajjar AO (2011), “Validation of a capillary electrophoresis method for the simultaneous determination of amlodipine besylate and valsartan in pharmaceuticals and human plasma”, Journal of AOAC International, 94(2), pp 498-502 12 Anandakumar K and Jayamariappan M (2011), “Absorption correction method for the simultaneous estimation of Amlodipine besylate, Valsartan and Hydrochlorothiazide in bulk and in combined tablet dosage form”, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 3(1), pp 23-27 13 British Pharmacopoeia (2014), “Amlodipine Besilate”, “Hydrochlorothiazide”, “Hydrochlorothiazide Tablets”, “Liquid Chromatography”, “Valsartan”, vol I, II, III, V, pp 21, 83, 604, 783, 1071 14 Del Rosario Brunetto M, Contreras Y, Clavijo S, Torres D, Delgado Y, Ovalles F, Ayala C, Gallignani M, Estela JM, Martin VC (2009), “Determination of losartan, telmisartan, and valsartan by direct injection of human urine into a column-switching liquid chromatographic system with fluorescence detection”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50(2), pp 194-199 15 Eyad S M Abu-Nameh, Khalid Abu-Shandi, Munib Saket, Maher Salim, O M Othman, Y Mohammad (2011), “Simultaneous Determination of Amlodipine Besylate and Valsartan in Tablets by High Performance Liquid Chromatography with UV Detection”, Jordan Journal of Pharmaceutical Sciences, 4(2), pp 105-113 16 G.N.A.Lakshmi, Kumara Swamy S and Agaiah Goud B (2013), “Preparation and Characterization of Mouth Dissolving Films of Valsartan Solid Dispersion”, Journal of Advanced Pharmaceutical Sciences, 3(1), pp 415-427 17 ICH (2005), “Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2 (R1)” 18 Karunanidhi Santhana Lakshmi and Sivasubramanian Lakshmi (2012), “Simultaneous Analysis of Losartan Potassium, Amlodipine Besylate and Hydrochlorothiazide in Bulk and in Tablets by High-Performance Thin Layer Chromatography with UVAbsorption Densitometry”, Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2012 19 K.R.Gupta, A.D.Mahapatra, A.R.Wadodkar and S.G.Wadodkar (2010), “Simultaneous UV Spectrophotometric Determination of Valsartan and Amlodipine in Tablet”, International Journal of ChemTech Research, 2(1), pp 551-556 20 Kul D, Dogan-Topal B, Kutucu T, Uslu B, Ozkan SA (2010), “HighPerformance Liquid Chromatographic and First Derivative of the Ratio Spectrophotometric Determination of Amlodipine and Valsartan in Their Binary Mixtures”, Journal of AOAC International, 93(3), pp 882-890 21 Mariusz Stolarczyk, Anna Maslanka, Jan Krzek and Joanna Milczarek (2008), “Application of Derivative Spectrophotometry for Determination of Enalapril, Hydrochlorothiazide and Valsartan in Complex Pharmaceutical Preparations”, Acta Poloniae Pharmaceutica, 65(3), pp 275-281 22 Merck & Co., Inc (2001), The Merck Index, 13th Edition, pp 86-87, 854, 1767 23 M.Manoranjani1 and T Bhagyakumar (2011), “Rp-HPLC method for the estimation of valsartan in Pharmaceutical dosage forms”, International Journal of Science Innovations and Discoveries, 1(2), pp 101-108 24 Moussa BA, El-Zaher AA, Mahrouse MA, Ahmed MS (2013), “Simultaneous determination of amlodipine besylate and atorvastatin calcium in binary mixture by spectrofluorimetry and HPLC coupled with fluorescence detection”, Analytical Chemistry Insights, 8, pp 107-115 25 Nikam M.B., Dhamane H., Aligave A., Kondawar M.S (2010), “Simultaneous estimation of valsartan, amlodipine besylate and hydrochlorothiazide by first order Spectrophotometric method”, International derivative UV Journal Of Pharmacy&Technology, 2(3), pp 642-650 26 Samya M El-Gizawy, Osama H Abdelmageed, Mahmoud A Omar, Sayed M Deryea, Ahmed M Abdel-Megied (2012), “Development and Validation of HPLC Method for Simultaneous Determination of Amlodipine, Valsartan, Hydrochlorothiazide in Dosage Form and Spiked Human Plasma”, American Journal of Analytical Chemistry, 3, pp 422-430 27 Satana E, Altinay S, Göğer NG, Ozkan SA, Sentürk Z (2001), “Simultaneous Determination of Valsartan and Hydrochlorothiazide in Tablets by First-Derivative Ultra-violet Spectrophotometry and LC”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 25(5-6), pp 1009-1013 28 Shaalan RA, Belal TS (2010), “Simultaneous Spectro-fluorimetric Determination of Amlodipine besylate and Valsartan in Their Combined Tablets”, Drug Testing and Analysis, 2(10), pp 489493 29 Shankar Ganesh Gadepalli, Pragney Deme, Madhusudana Kuncha, Ramakrishna Sistla (2014), “Simultaneous determination of amlodipine, Valsartan and hydrochlorothiazide by LC-ESIMS/MS and its application to pharmacokinetics in rats”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 4(6), pp 399-406 30 Shobha Krushnan G, Ravi M Britto, Perianayagam J, Rajendra Prasad R (2013) “Formulation and Evaluation of oro dispersible tablets of amlodipine besylate”, Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology, 1(4), pp 472-477 31 S S Qutab, S N Razzaq, M Ashfaq, Z A Shuja and I U Khan (2007), “Simple and sensitive LC-UV method for simultaneous analysis of Hydrochlorothiazide and Candesartan cilexetil in Pharmaceutical formulations”, Acta Chromatographica, (19), pp 119-129 32 The United States Pharmacopoeia 37 (2014), “Chromatography”, “Amlodipine Besylate”, “Amlodipine Besylate Tablets”, “Hydrochlorothiazide Capsule”, “Hydrochlorothiazide Tablets”, “Valsartan”, “Valsartan Tablets”, vol I, II, III, pp 301-308, 17601762, 3246-3248, 5115-5117 33 Varsha R Galande, K.G Baheti, S Indraksha, and M H Dehghan (2012) “Estimation of Amlodipine Besylate, Valsartan and Hydrochlorothiazide in Bulk Mixture and Tablet by UV Spectrophotometry”, Indian Journal of Pharmaceutical Sciences, 74(1), pp 18-23 [...]... thuật trong hệ thống để có thể phân tích, kiểm tra các chế phẩm có chứa các hoạt chất trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài Xây dựng phƣơng pháp định tính và định lƣợng đồng thời Amlodipin besylat, Hydroclorothiazid và Valsartan trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với 2 mục tiêu sau: 1 Xây dựng phƣơng pháp định tính, định lƣợng đồng thời Amlodipin besylat, Hydroclorothiazid và Valsartan. .. nghiệm ứng dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 2.3.1 Xây dựng và thẩm định phƣơng pháp định tính, định lƣợng đồng thời Amlodipin besylat, Hydroclorothiazid và Valsartan 2.3.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp: Nhận thấy AML, HCT và VAL đều là các chất có độ phân cực tốt, do đó chúng tôi tiến hành khảo sát hệ sắc ký lỏng pha đảo với pha tĩnh ít phân cực (cột C18) và hệ pha động phân cực... theo kích cỡ Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao, mẫu phân tích đƣợc tiêm qua buồng tiêm và đƣợc đi vào cột nhờ pha động, các thành phần trong mẫu phân tích đƣợc tách ra trên pha tĩnh chứa trong cột rồi đi qua detector để phát hiện và cho các tín hiệu đƣợc ghi trên sắc đồ [1], [3], [4], [13], [32] a Pha tĩnh trong sắc ký lỏng Pha tĩnh hay dùng nhất trong sắc ký lỏng hiệu năng cao là pha tĩnh mà trong đó các... mao quản [11]; Sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS) [29]; Sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang [14] 1.4 TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Nguyên lý chung của sắc ký lỏng Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn) Mẫu phân tích đƣợc chuyển lên cột tách dƣới dạng dung dịch Cơ chế của quá trình sắc ký lỏng là hấp phụ,... dụng a Định tính Sự giống nhau về thời gian lƣu của chất phân tích trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử là cơ sở của phép thử định tính Với detector DAD hệ số Match khi chồng 2 phổ của chuẩn và thử cũng đánh giá định tính chất phân tích [3], [4] b Định lượng Việc so sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử (diện tích hoặc chiều cao píc) trong. .. thời Amlodipin besylat, Hydroclorothiazid và Valsartan trong viên nén bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao 2 Áp dụng phƣơng pháp đã xây dựng để kiểm nghiệm một số chế phẩm 2 Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.3 TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN BESYLAT, HYDROCLOROTHIAZID VÀ VALSARTAN 1.3.1 Tổng quan về Amlodipin besylat 1.3.1.1 Cấu tạo hóa học Hình 1.1: Công thức cấu tạo của Amlodipin besylat [32] - Công thức phân tử: C20H25ClN2O5.C6H6O3S... tách, tiết kiệm dung môi và thời gian, gần đây ngƣời ta đã đƣa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào ứng dụng rộng rãi Trong UPLC, kích thƣớc hạt chất mang nhỏ (thƣờng từ 1,7 – 2,2 m) và có thể sử dụng cột ngắn hơn (5 – 10 cm) [1], [3], [4] b Pha động trong sắc ký lỏng Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa... năng cao Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm 3 phần chính: - Phần đầu vào gồm pha động, bơm, hệ thống tiêm mẫu - Phần tách: gồm cột tách, lò cột, có thể có cột phụ trợ - Phần phát hiện và xử lý số liệu: gồm detector, bộ phận ghi tín hiệu (máy tính) [1], [3], [4] Hình 1.4: Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 15 1.2.2 Một số thông số đặc trƣng - Hiệu lực của cột sắc ký đƣợc biểu thị thông... số chế phẩm chứa 1, 2 hoặc 3 thành phần nhƣ: - Viên nén bao phim Exforge HCT Amlodipin - 10 mg Hydroclorothiazid 12,5 mg Valsartan 160 mg Viên nén Co-Diovan Hydroclorothiazid 12,5 mg Valsartan - - 80 mg Viên nén Exforge Amlodipin 5 mg Valsartan 80 mg Viên nén Normodipine Amlodipin 5 mg 19 2.1.3 Dung môi, hóa chất Bảng 2.4: Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm STT Tên dung môi, hóa... NGHIÊN CỨU Nguyên lý phân tích: Mẫu đƣợc nghiền mịn, xử lý mẫu bằng phƣơng pháp thích hợp, lọc qua màng lọc 0,45 μm, tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC, ghi lại sắc ký đồ Ý nghĩa của phƣơng pháp nghiên cứu: Đƣa ra một quy trình phân tích bằng sắc ký lỏng pha đảo (Rp-HPLC) đơn giản, thiết bị phù hợp với đa số các phòng thử nghiệm trong hệ thống kiểm nghiệm: dung môi phân tích thông dụng, dễ