Đang tải... (xem toàn văn)
1I. Lý do chọn đề tàiAxit uric là một hợp chất dị vòng chứa cacbon, nitơ, oxi và hiđro có công thức phân tử là C5H4N4O3. Axit uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa purine nucleotit. Trong cơ thể người và động vật, axit uric được đào thải qua đường nước tiểu, n. Nhưng do quá trình cung cấp quá nhiều đạm làm tăng quá trình tổng hợp axit uric hoặc do chức năng suy thận giảm khiến quá trình đào thải axit uric không hoàn toàn làm tăng hàm lượng axit uric trong máu. Khi hàm lượng axit uric trong máu tăng dẫn đến một số bệnh của viêm khớp gọi là bệnh Gut (bệnh Gout). Các hạt lắng đọng xung quanh các khớp dẫn đến hậu quả sưng viêm và đau khớp, bên cạnh đó, một số lắng đọng tại thận là nguyên nhân gây bệnh sỏi thận.Nồng độ axit uric trong nước tiểu và trong huyết thanh quá cao sẽ được tìm thấy trong các bệnh nhân mắc một số bệnh như bệnh Gout, sỏi thận, tim mạch, tiểu đường loại 2. Nếu nồng độ axit uric trong huyết tương quá thấp gây nên bệnh đa xơ cứng ở ngoài. Do đó việc xác định hàm lượng của axit uric trong cơ thể người có nghĩa vô cùng quan trọng trong việc xác định bệnh cũng như dự đoán những bệnh này.Trong những năm gần đây đã có rất nhiều kĩ thuật hiện đại ứng dụng để xác định hàm lượng axit uric như phương pháp huỳnh quang, phương pháp quang phổ, phương pháp hấp thụ mol phân tử, phương pháp enzim,... Phương pháp sắc kíký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong các phương pháp được nhiều nhà khoa học sử dụng trong phân tích dược phẩm nói riêng và phân tích nói chung với các ưu điểm nổi bật của phương pháp là có độ nhạy cao, tương đối chọn lọc với chất ta cần xác định. Việc nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích hàm lượng axit uric và ứng dụng quy trình phân tích đó vào xác định hàm lượng axit uric trong thực tế không những có ý nghĩa sâu sắc về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa sâu sắc về mặt thực tế. Chính vì những lý do trên tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích hàm lượng axit uric bằng phương pháp sắc kíký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và ứng dụng phân tích”.2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích axit uric bằng phương pháp sắc kíký lỏng hiệu năng cao. Áp dụng phương pháp để thử nghiệm xác định hàm lượng axit uric trong mẫu nước tiểu của một số đối tượng. Đánh giá hàm lượng axit uric có trong nước tiểu của các đối tượng khác nhau, thông qua tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Bộ Y Tế Bộ Y Tế để xét xem mức độ nguy hiểm của bệnh Gout đối với từng người, từng lứa tuổi..
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI ĐẶNG THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH HỌ VÀ TÊN ( Tác giả luận văn) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI ĐẶNG THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH HỌ VÀ TÊN ( Tác giả luận văn) Lêi c¶m ¬n Luận văn Thạc sĩ khoa học Hóa học hoàn thành phòng thí nghiệm Pphân tích Hóa – Sinh thuộc môn Hóa Phân tích, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội với hướng dẫn, bảo tận tình cô giáo, TS Vũ Thị Hương thầy, cô môn Hóa Phân tích thầy, cô khoa Hóa học, giúp đỡ anh chị học viên K21 khoa Hóa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô giáo, TS Vũ Thị Hương, người giao đề tài, tận tình bảo, hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn Thạc sĩ Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy, cô Bộ môn Hóa Phân tích, thầy, cô khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, anh chị toàn thể bạn học viên – khoa Hóa học giúp đỡ, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình giúp đỡ động viên em suốt thời gian học tập làm việc phòng thí nghiệm Cuối em xin gửi tới gia đình, người thân bạn bè lời cảm ơn chân thành giúp đỡ em thu nhập thông tin, tư liệu động viên, khích lệ tinh thần em suốt thời gian qua Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Tác giả Đặng Thanh Huyền MỤC LỤC HỌ VÀ TÊN YTHỬ NGHIỆM TRONG ÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM HỌ VÀ TÊN YTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCHTÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN THẠC SĨ .2 HÀ NỘI, NĂM MỤC LỤC .4 MỤC LỤC .2 DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT 10 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ .11 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 13 MỞ ĐẦU .2 Mục đích nghiên cứu .3 Kết đạt Đã tìm phương pháp thích hợp để phân tích axit uric với điều kiện tối ưu, từ ứng dụng để xác định hàm lượng axit uric mẫu nước tiểu .5 Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình phân tích axit uric ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit uric mẫu nước tiểu người (Phần viết lại sau kết thúc thí nghiệm) Những điểm đề tài .5 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC .6 1.1.1 Thông tin chung 1.1.2 Tính chất vật lý 1.1.3 Trạng thái tồn tại, trình tổng hợp đào thải axit uric 1.1.4 Cơ chế lắng đọng axit uric ảnh hưởng thể .8 1.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng axit uric viêm khớp 1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích định lượng axit uric 11 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 12 1.2.1.1 Khái niệm sắc ký 12 1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo máy HPLC .13 1.2.2.1 Hệ thống bơm 13 1.2.2.2 Hệ bơm mẫu 14 1.2.2.3 Cột sắc ký lỏng hiệu cao 14 1.2.2.4 Detector 14 1.2.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu 16 1.2.3 Các thông số đặc trưng trình sắc ký yếu tố ảnh hưởng 17 1.2.3.1 Hệ số phân bố K (Partition coefficient) .17 1.2.3.2 Thời gian lưu tR (Retention time) .17 1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’ 18 1.2.3.4 Hệ số chọn lọc α .19 1.2.3.5 Lý thuyết đĩa 19 1.2.4 Pha tĩnh HPLC 21 1.2.4.1 Phân loại pha tĩnh 21 1.2.4.2 Yêu cầu pha tĩnh HPLC 21 1.2.5 Pha động HPLC .23 1.2.6 Chọn pH cho dung dịch đệm 23 1.2.8 Cách đánh giá picpícpic 24 1.3 ỨNG DỤNG CỦA HPLC [8] .25 1.3.1 Định tính 25 1.3.2 Phân tích định lượng .25 1.3.34 Sắc ký điều chế .26 1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC [5,6] 26 1.4.1 Phương pháp quang phổ phân tử 26 1.4.1.1 Quang phổ hấp phụ UV-VIS 26 1.4.1.2 Quang phổ hồng ngoại 28 1.4.2 Sơ lược Pphương pháp điện hóa 29 1.4.2.1 cực phổ Phương pháp cực phổ 29 Là phương pháp dựa khử ion kim loại xảy điện cực khác (catot Hg catot khác) nhờ việc theo dõi biến đổi cường độ dòng điện trình điện phân chất phân tích chuyển đến điện cực khuếch tán Và tín hiệu thu (cường độ dòng điện phân) cho tín hiệu phân tích định lượng cường độ dòng có quan hệ với nồng độ chất phản ứng điện cực 29 Đây phương pháp dùng rộng rãi xác định định tính định lượng nhiều chất với độ nhạy, độ xác, độ chọn lọc cao cách nhanh chóng, kinh tế Tuy nhiên, tiến hành phương pháp cực phổ định lượng dùng điện cực giọt Hg ta cần ý tới yếu tố: cực phổ (chất điện ly trơ), nhiệt độ dung dịch, số mao quản điện cực (chiều cao tiết diện), dung khí trơ để đuổi oxi, dung chất hoạt động bề mặt (gietalin),… 29 1.4.2.1 Nguyên tắc phương pháp 29 1.4.2.2 Điện cực làm việc 30 Trong phương pháp phân tích von-ampe, điện cực làm việc thường dùng là: điện cực giọt Hg, điện cực rắn làm từ Platin, vàng, bạc cacbon kíính 30 1.4.2.3 Ưu điểm điện cực giọt Hg 31 1.4.2.4 Điện cực so sánh 32 Thường hay sử dụng điện cực Ag/AgCl hay điện cực calomen bão hòa Điện cực so sánh phải ổn định .32 1.4.2.5 Sóng cực phổ khuếch tán 32 1.5 YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM [1] .35 1.5.1 Tính đặc hiệu phương pháp .35 1.5.2 Đường chuẩn khoảng tuyến tính .36 1.5.3 Độ .37 1.5.4 Độ xác .37 1.5.5 Giới hạn phát giới hạn định lượng 37 1.5.5.1 Giới hạn phát ( LOD) 37 1.5.5.2 Giới hạn định lượng ( LOQ) 39 CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 41 2.1 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 41 2.1.1 Hóa chất 41 2.1.2 Dụng cụ thiết bị 41 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 41 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 43 2.3.1.1 Lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại 43 2.3.1.4 Khảo sát hệ đệm 44 2.3.1.5 Khảo sát pH hệ đệm 44 picpicpic2.3.1.6 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm 44 2.3.1.3 Lựa chọn bước sóng 44 2.3.1.74 Khảo sátLựa chọn thời gian lưu chất 45 2.3.1.5 Khảo sát lựa chọn hệ đệm 45 2.3.1.6 Khảo sát pH hệ đệm 46 2.4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 46 2.4.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric 46 2.4.2 Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích picpícpic sắc ký 46 2.5 ĐÁNH GIÁ TÍNH THÍCH HỢP CỦA PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM TRA ĐƯỜNG CHUẨN 47 2.5.1 Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 47 2.5.2 Khảo sát độ lặp lại phương pháp .47 2.5.4 Khảo sát độ tuyến tính phương pháp 48 2.6 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU .49 2.6.1 Xử lý nước tiểu 49 2.6.2 Phương pháp xử lý kết .49 2.6.2.1 Nguyên tắc xử lý kết 49 đo mẫu 49 2.7 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ 50 2.7.1 Nguyên tắc xử lý kết qu ả 50 Các số liệu thực nghiệm kiểm tra sai số thô xử lý tính toán theo công thức đại lượng thống kê Xử lý đường chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính sử dụng chương trình pascal phần mềm Origin 8.0 50 2.6.2.2 Cách xử lý 50 2.6.2.3 Kiểm tra đường chuẩn 52 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .54 3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric 54 3.1.1 Lựa chọn phương pháp sắc ký 54 3.1.1.1 Chọn bước sóng hấp thụ cực đại 54 3.1.1.2 Khảo sát thành phần pha động 55 3.1.1.3 Khảo sát tốc độ dòng 56 3.1.1.4 Khảo sát hệ đệm 57 3.1.1.5 Khảo sát pH hệ đệm 58 3.1.1.6 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm 60 3.1.1.7 Khảo sát thời gian lưu 61 3.1.2 Đánh giá tính thích hợp phương pháp kiểm tra đường chuẩn 62 3.1.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric 62 3.1.2.3 Khảo sát tính thích hợp hệ thống sắc ký 66 3.1.2.4 Khảo sát độ lặp lại phương pháp sắc ký 67 3.1.2.5 Khảo sát độ phương pháp 68 3.2.1 Xử lý nước tiểu 70 3.2.2 Các kết đo 70 KKẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 2.7.2.1 Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp bình phương tối thiểu 84 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 106 /1398309 mV Detector A:284nm 40 35 30 25 20 /130144 15 /14429 /25401 10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.0 8.0 9.0 /1479777 mV Detector A:284nm 6.0 45 40 35 30 25 /3242 /28292 10 /30949 15 /133918 20 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 157 6.0 7.0 8.0 9.0 mV Detector A:284nm /368040 10 /3754 /13350 /30346 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 7.0 8.0 9.0 /1244829 mV Detector A:284nm 5.0 35 30 25 20 15 0.0 1.0 2.0 /19629 /16882 10 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 B Lứa tuổi từ 30-50 tuổi Nữ giới /1793948 mV Detector A:284nm 50 45 40 35 30 25 20 15 0.0 1.0 2.0 3.0 /1812 /22213 /23605 10 4.0 5.0 158 6.0 7.0 8.0 9.0 mV Detector A:284nm /368040 10 /3754 /13350 /30346 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 7.0 8.0 9.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 /462855 mV Detector A:284nm 5.0 12.5 10.0 7.5 0.0 0.0 1.0 2.0 /5308 /5146 2.5 3.0 /27912 5.0 4.0 /1244829 mV Detector A:284nm 35 30 25 20 15 /16882 0.0 1.0 2.0 3.0 /19629 10 4.0 5.0 159 6.0 7.0 8.0 9.0 /1120125 mV Detector A:284nm 30 25 20 15 0.0 1.0 2.0 3.0 /15243 /16868 /21471 10 4.0 5.0 Nam giới 160 6.0 7.0 8.0 9.0 161 /4973555 mV Detector A:284nm 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 7.0 8.0 9.0 /5296242 mV Detector A:284nm 6.0 125 100 75 50 25 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 Lứa tuổi từ 30-50 tuổi Nữ giới 162 6.0 7.0 8.0 9.0 /1793948 mV Detector A:284nm 50 45 40 35 30 25 20 15 0.0 1.0 2.0 3.0 /1812 /22213 /23605 10 4.0 5.0 163 6.0 7.0 8.0 9.0 /1244829 mV Detector A:284nm 35 30 25 20 15 /16882 0.0 2.0 3.0 4.0 mV Detector A:284nm 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 /368040 10 1.0 /19629 10 /3754 /13350 /30346 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 164 6.0 7.0 8.0 9.0 /462855 mV Detector A:284nm 12.5 10.0 7.5 /5146 /5308 2.5 0.0 0.0 1.0 2.0 3.0 /27912 5.0 4.0 6.0 7.0 8.0 9.0 /1120125 mV Detector A:284nm 5.0 30 25 20 15 0.0 1.0 2.0 3.0 /15243 /16868 /21471 10 4.0 5.0 Nam giới 165 6.0 7.0 8.0 9.0 /2368418 mV Detector A:284nm 50 40 30 20 0.0 1.0 /8865 /9938 /35727 10 2.0 3.0 4.0 5.0 2.0 3.0 4.0 5.0 2.0 3.0 4.0 7.0 8.0 9.0 6.0 7.0 8.0 9.0 7.0 8.0 9.0 /5296242 mV Detector A:284nm 6.0 125 100 75 50 25 0.0 mV Detector A:284nm /2127927 50 1.0 45 40 35 30 25 20 /172376 15 /72979 10 0.0 1.0 5.0 166 6.0 /4973555 mV Detector A:284nm 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Lứa tuổi 50 tuổi Nữ giới /308318 mV Detector A:284nm 0.0 1.0 2.0 /3967 /12397 3.0 /11285 /7347 4.0 6.0 7.0 8.0 9.0 /698590 mV Detector A:284nm 5.0 25 20 15 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 /90660 /7425 /16444 10 5.0 167 6.0 7.0 8.0 9.0 min /1773958 mV 35 Detector A:284nm 30 25 20 15 10 /50424 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 2.0 3.0 4.0 6.0 7.0 8.0 9.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 /3177960 mV 90 Detector A:284nm 5.0 80 70 60 50 40 30 20 10 0.0 1.0 Nam giới mV 50 Detector A:284nm 40 30 20 10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 168 6.0 7.0 8.0 9.0 /1650338 mV Detector A:284nm 30 25 20 15 10 /29126 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 8.0 9.0 /1773958 mV 35 Detector A:284nm 7.0 30 25 20 15 /50424 10 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 7.0 8.0 9.0 /308318 mV Detector A:284nm 5.0 0.0 1.0 2.0 3.0 /3967 /12397 /11285 /7347 4.0 5.0 169 6.0 7.0 8.0 9.0 XỬ LÝ THỐNG KÊ PHƯƠNG TRÌNH ĐƯỜNG CHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HỒI QUY TUYẾN TÍNH Phuong trinh hoi quy tuyen tinhsu phu thuoc S = x*C + y _ | k | C | S | ALt | Alt - S | _ | 1| 0.2000|98868.0000|107969.1027|9101.102656| | 2| 0.4000|93568.0000|128633.9563|35065.956343| | 3| 2.0000|326321.0000|293952.7858|-32368.214159| | 4| 5.0000|586937.0000|603925.5911|16988.591150| | 5| 10.0000|1152718.0000|1120546.9333|-32171.066668| | 6| 25.0000|2675070.0000|2670410.9599|-4659.040123| | 7| 50.0000|5245475.0000|5253517.6708|8042.670784| _ thalt = 3770133619.6000000000 D = 1.4204640000E+04 DA = so = 27459.54705 1.2401254271E+09DB = 1.4676840364E+09 sx = 609.57518 sy = 13143.17752 A= (103324.268440+32200.784920)*C + (87304.248968+1493.459183) 170 171