TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA GVHD: ThS Dương Thúc Huy SVTH: Nguyễn Khánh Toàn MSSV: K38.106.133 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016 LỜI CẢM ƠN Trên đường đến bến bờ thành công thiếu người lái đò tận tụy Thành công em ngày hôm trình phấn đấu rèn luyện với hỗ trợ người quan trọng Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Dương Thúc Huy – người lái đò đầy tâm huyết nhiệt tình nhất, gương nghiên cứu khoa học Thầy dạy cho em kiến thức chuyên môn với kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa học em suốt thời gian thầy hướng dẫn Tất quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh tận tình truyền đạt kiến thức quý báu suốt thời gian em theo học hoàn thành khóa luận Các anh chị học viên cao học bạn sinh viên môn Hóa Hữu cơ, khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên động viên, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Các bạn sinh viên khóa 38, 39 chuyên ngành hóa hữu cơ, bạn sinh viên khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh tận tình cộng tác, giúp đỡ em trình nghiên cứu Và cuối xin cảm ơn gia đình tạo điều kiện tốt vật chất lẫn tinh thần để hoàn thành tốt khóa luận MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS 1.1.1 Định nghĩa phân loại chi Cordyceps 1.1.2 Hoạt tính hợp chất có chi Cordyceps 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 HOÁ CHẤT, THIẾT BỊ 2.1.1 Hoá chất 2.1.2 Thiết bị 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 2.3.2 Sắc kí cột phân đoạn cao A3.4 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 11 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4 11 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2 14 4.1 KẾT LUẬN 16 4.2 ĐỀ XUẤT 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 17 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance d dd : Mũi đôi (Doublet) Mũi đôi đôi (Doublet of doublet) DMSO : Dimethyl sulfoxide EA : Ethyl acetate H : Hexane HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation J : Hằng số tương tác spin-spin m : Mũi đa (Multiplet) Me : Methanol NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) ppm : Part per million s : Mũi đơn (Singlet) t : Mũi ba (Triplet) UV : Tia cực tím (ultra violet) DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU  DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Polysaccharide xác định Yu cộng sự, 2009 Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) Hình 3.1 Khung sườn sterol 11 Hình 3.2 Tương quan HMBC nhân B hợp chất TT4 (trái) cấu trúc ergosterol (phải) 12 Hình 3.3 Cấu trúc hợp chất T2 15 Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập từ cao ethanol mẫu nấm Cordyceps neovolkiana 16  DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 T2  DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Phân đoạn cao methanol thô Bảng 3.1 Dữ liệu phổ TT4 cerevisterol Bảng 3.2 Dữ liệu phổ T2 ergosterol peroxide DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục Phổ 1H-NMR TT4 (a) Phụ lục Phổ 1H-NMR TT4 (b) Phụ lục Phổ 13C-NMR TT4 Phụ lục Phổ HSQCcủa TT4 Phụ lục Phổ HSQC giãn rộng TT4 Phụ lục Phổ HMBC TT4 Phụ lục Phổ HMBC giãn rộng TT4 Phụ lục Phổ COSY TT4 Phụ lục Phổ 1H-NMR T2 Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR giãn rộng T2 Phụ lục 11 Phổ 13C-NMR T2 LỜI MỞ ĐẦU Từ lâu y học cổ truyền Trung Hoa Tây Tạng người ta biết sử dụng số loài nấm thuộc chi Cordyceps để chữa bệnh Được biết đến nhiều có vai trò loại thần dược quý chi loài Cordyceps sinensis (còn gọi đông trùng hạ thảo) Chi Cordyceps với 400 thuộc loài chi có phân bố rộng khắp giới phần lớn sinh sống châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Thái Lan Việt Nam) Những nghiên cứu gần cho biết polysaccharide diện C sinensis thể đa dạng hoạt tính sinh học kháng oxi hóa, ức chế miễn dịch chống xơ vữa động mạch, nucleoside mang đa tác dụng macrophage cordycepin có hoạt tính ức chế phát triển khối u điều hòa miễn dịch Vì thế, loài nấm thu hút nhiều nhà nghiên cứu năm gần dựa giá trị dinh dưỡng dược học Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên loài nấm giảm dần môi trường sống khắc nghiệt khai thác mức nguồn nguyên liệu Gần đây, vài loài nấm thuộc chi Cordyceps chiết tách nuôi cấy phòng thí nghiệm Một nguyên cứu gần chứng tỏ có khác thành phần hàm lượng hợp chất hóa học nấm tự nhiên nấm nuôi cấy Nấm nuôi cấy chứa hàm lượng polysaccharide, adenine adenosine cao so với loài nấm tự nhiên [27] Xuất phát từ ứng dụng Y học quý giá kế thừa kết nghiên cứu nước chi Cordyceps, tiến hành nghiên cứu loài nấm Cordyceps neovolkiana Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS 1.1.1 Định nghĩa phân loại chi Cordyceps Các loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm có C sinensis, C militaris, C pruinosa C ophioglossoides nguồn nguyên liệu quý dược học Thành phần dược liệu loài nấm khô thuộc chi Cordyceps phát triển ấu trùng Trong đó, phổ biến loài nấm Cordyceps sinensis, gọi với tên Đông Trùng Hạ Thảo (Tiếng Trung Quốc, Dong-Chong-Xia-Cao hay Tochukaso, tiếng Nhật) Tên gọi bắt nguồn từ thay đổi theo mùa Vào mùa đông, ấu trùng nhiễm nấm chuyển thành sâu sống đất gọi Đông Trùng Khi sang hè, stroma phát triển đầu ấu trùng có hình dáng giống cỏ nên gọi Hạ Thảo Ở Trung Quốc, vị thuốc có nguồn gốc hàng ngàn năm [24] 1.1.2 Hoạt tính hợp chất có chi Cordyceps Thành phần hóa học chi Cordyceps tìm thấy gồm có cordycepin (30-deoxyadenosin) dẫn xuất, ergosterol, polysaccharide, glycoprotein peptide có chứa thành phần aminoisobutyric acid Các hợp chất có hoạt tính sinh học kháng ung thư, kháng đột biến (anti-metastatic), ức chế miễn dịch (immunomodulatory), kháng oxy hóa, kháng viêm, diệt sâu bọ (insecticidal), kháng khuẩn, hạ lipit máu, hạ đường huyết, chống lão hóa, bảo vệ hệ thần kinh thận Những nghiên cứu gần cho biết polysaccharide diện C sinensis thể đa dạng hoạt tính sinh học : chống oxy hóa, ức chế miễn dịch, chống xơ vữa động mạch, nucleoside mang đa tác dụng macrophage cordycepin có hoạt tính ức chế phát triển khối u điều hòa miễn dịch Vì thế, loài nấm thu hút nhiều nhà nghiên cứu năm gần dựa giá trị dinh dưỡng dược học Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên loài nấm giảm dần môi trường sống khắc nghiệt khai thác mức nguồn nguyên liệu Gần đây, vài loài nấm thuộc chi Cordyceps chiết tách nuôi cấy phòng thí nghiệm [27] Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI CORDYCEPS Các hợp chất Cordycepin (3’-deoxyadenosine), 3’-amino-3’- deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid D- mannitol cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps từ năm 1950 (Cunningham cộng sự, 1950 [6]; Chatterjee cộng sự, 1957 [3]; Kredich Guarino, 1961 [18]; Kaczka cộng 1964 [10], Liu cộng 1989 [22]) Một nguyên cứu gần chứng tỏ có khác thành phần hàm lượng hợp chất hóa học nấm tự nhiên nấm nuôi cấy Nấm nuôi cấy chứa hàm lượng polysaccharide, adenine adenosine cao so với loài nấm tự nhiên Li cộng [19,20] tìm thấy nấm C sinensis nuôi cấy có hàm lượng nucleoside cao loài tự nhiên Ergosterol diện C sinensis xác định sắc kí lớp mỏng điều chế (Li Li 1991; Li cộng 2004) [21] Boros cộng (1994) [16] công bố ophiocordin (54), hợp chất kháng nấm kháng khuẩn cô lập từ C ophioglossoides (Kneifel cộng 1977 [2]) có cấu trúc balanol từ Verticillium balanoides Bioxanthracenes (55-67) cô lập từ C pseudomilitaris (Isaka cộng 2001 [8]) Ngoài hợp chất cordypyridones A-D (68-71) cô lập từ loài nấm nhóm tác giả (Isaka cộng 2001 [9]) Các hợp chất chứa vòng 10 carbon cepharosporolides C, E F (71-73), với cordycepin, pyridine-2,6-dicarboxylic acid 2-carboxymethyl-4-(30hydroxybutyl)furan (73-74) cô lập từ C militaris Rukachaisirikul cộng (2004) [26] Krasnoff cộng (2005) [17] công bố cicadapeptins I II (các peptide chứa thành phần aminoisobutyric acid) myriocin (kháng nấm) (51-53) từ C heteropoda Một glycoprotein với thành phần N-acetylgalactosamine [Gal-β(1→3)-GalN-Acol galactosyl-β(1→3)-N-acetyl-galactosaminitol] cô lập từ C ophioglossoides (Kawaguchi cộng 1986) [10] Các polysaccharide cô lập nhiều nhóm tác giả Bốn exopolysaccharides có khối lượng phân tử từ 50 kDa đến 2260 kDa cô lập từ C militaris Kim cộng (2003b, c) [132 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 15] Yu cộng (2004a, b) công bố bốn polysaccharides từ C militaris [31-32] Ngoài nhiều công bố khác nghiên cứu polysaccharide từ nấm Cordyceps Chun cộng sự, 2003 [5]; Methacanon cộng sự, 2005 [23]; Wu, Sun, Pan, 2006 [28]; Xiao cộng sự, 2006 [29]; Yu cộng sự, 2007 [33]; Cheung cộng sự, 2009 [4] Các nghiên cứu dừng xác định thành phần monosaccharide khối lượng phân tử hoạt tính sinh học Một nghiên cứu gần thực Yu cộng sự, 2009 [25] sử dụng nhiều phương pháp xác định cấu trúc polysaccharide từ Cordyceps militaris -(1→3)- → → [ 4-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1 ]n → β-D-Gal-(1→ [ 6)-β-D-Gal-(1 ]3 4)-α-D-Glc Hình 1.1 Polysaccharide xác định Yu cộng sự, 2009 Gần đây, Yang cộng [30] cô lập cordysinins A-E (1-5) với 46 hợp chất biết khác từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy: ergosterol (6), (17R)-17methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9), fungisterol (10), hỗn hợp β-sitosterol (11) stigmasterol (12), hỗn hợp βsitosterol 3-O-acetate (13) stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5αergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (15), 3-O-ferulylcycloartenol (16), daidzein (17), phydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), genistein (22), D-mannitol (23), p-methoxybenzoic acid (24), 3-hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25), acetovanillone (26), p-hydroxyphenylacetic acid (27), cyclo(L-Pro-L-Val) (28), syringic acid (29), cyclo(L-Phe-L-Pro) (30), cyclo(L-Pro-L-Tyr) (31), 2- furancarboxylic acid (32), p-methoxyphenol (33), glycitein (34), salicylic acid (35), methyl p-hydroxyphenylacetate (36), thymine (37), nicotinic acid (38), ergosteryl-3O-β-D-glucopyranoside (39), flazin (40), 3′,4′,7-trihydroxyisoflavone (41), succinic acid (42), perlolyrine (43), 1-methylpyrimidine-2,4-dione (44), protocatechuic acid (45), 3,4-dihydroxyacetophenone (46), 4-hydroxyacetophenone (47), 2-deoxy-Dribono-1,4-lactone (48), 1-acetyl-β-carboline (49), adenosine (50) Khóa luận tốt nghiệp [9] Nguyễn Khánh Toàn Isaka M., Tanticharoen M., Kongsaeree P., Thebtaranonth Y., “Structures of cordypyridones A-D, antimalarial N-hydroxy- and N-methoxy-2-pyridones from the insect pathogenic fungus Cordyceps nipponica.”, J Org Chem., 66, 4803–4808, 2001 [10] Kaczka E A., Trenner N R., Arison B., Walker R W., Folkers K., “Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’deoxyadenosine”, Biochem Biophys Res Commun., 14, 456–457, 1964 [11] Kawaguchi N., Ohmori T., Takeshita Y., Kawanishi G., Katayama S., Yamada H., “Occurrence of Gal beta (1—3) GalNAc-Ser/Thr in the linkage region of polygalactosamine containing fungal glycoprotein from Cordyceps ophioglossoides”, Biochem Biophys Res Commun., 140, 350–356, 1986 [12] Kim D S., Baek N.-I., Oh S R., Jung K Y., Lee I S., Kim J H., Lee H.-K (1997), Anticomplementary activity of ergosterol peroxide from Naematoloma fasciculare and reassignment of NMR data, Archives of Phamacal Research, 20(3), 201-205 [13] Kim K M., Kwon Y G., Chung H T., Yun Y G., Pae H O., Han J A., Ha K S., Kim T W., Kim Y M., “Methanol extract of Cordyceps pruinosa inhibits invitro and invivo inflammatory mediators by suppressing NF-kappaB activation”, Toxicol Appl Pharmacol., 190, 1–8, 2003 [14] Kim S W., Hwang H J., Xu C P., Sung J M., Choi J W., Yun J W., “Optimization of submerged culture process for the production of mycelial biomass and exo-polysaccharides by Cordyceps militaris C738”, J Appl Microbiol., 94, 120–126, 2003 [15] Kim S W., Xu C P., Hwang H J., Choi J W., Kim C W., Yun J W., “Production and characterization of exopolysaccharides from an enthomopathogenic fungus Cordyceps militaris”, NG3 Biotechnol Progr., 19, 428–435, 2003 [16] Kneifel H., Konig W A., Loeffler W., Muller R., “Ophiocordin, an antifungal antibiotic of Cordyceps ophioglossoides Arch.”, Microbiol., 113, 121– 130, 1977 18 Khóa luận tốt nghiệp [17] M., Nguyễn Khánh Toàn Krasnoff, S B., Reátegui, R F., Wagenaar, M M., Gloer, J B., Gibson, D “Cicadapeptins I and II: new Aib-containing peptides from the entomopathogenic fungus Cordyceps heteropoda”, J Nat Prod 68: 50-55, 2005 [18] Kredich N M., GuarinoA J., “Homocitrullyl amino adenosine, a nucleoside isolated from Cordyceps militaris”, J Biol Chem., 236, 3300–3302, 1961 [19] Li S P., Li P., Dong T T., Tsim K W., “Anti-oxidationactivity of different types of natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia”, Phytomedicine, 8, 207–212, 2001 [20] Li S P., Li P., Dong T T., Tsim K W., “Determination of nucleosides in natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia by capillary electrophoresis”, Electrophoresis, 22, 144–150, 2001 [21] Li S P., Li P., Lai C M., Gong Y X., Kan K K., Dong T T., Tsim K W., Wang Y T., “Simultaneous determination of ergosterol, nucleosides and their bases from natural and cultured Cordyceps by pressurised liquid extraction and highperformance liquid chromatography”, J Chromatogr A, 1036, 239–243, 2004 [22] Liu J M., Zhong, Y R., Yang Z., Cui S L., Wang F H., “Chemical constituents of Cordyceps militaris (L.) Link.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 14, 608–609, 1989 [23] Methacanon P., Madla S., Kirtikara K., Prasitsil M., “Structural elucidation of bioactive fungi-derived polymers”, Carbohydrate Polymers, 60, 199–203, 2005 [24] Ng T B., Wang H X., “Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine”, Journal of Pharmacy and pharmacology, 57, 1509–1519, 2005 [25] Rongmin Yu, Yin Yin, Wei Yang, Weili Ma, Lin Yang, Xiujuan Chen, Zhang Zhang, Bin Ye, Liyan Song, “Structural elucidation and biological activity of a novel polysaccharide by alkaline extraction from cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers 75, 166–171, 2009 [26] Rukachaisirikul V., Pramjit S., Pakawatchai C., Isaka M., Supothina S “10- membered macrolides from the insect pathogenic fungus Cordyceps militaris BCC 2816”, J Nat Prod., 67, 1953–1955, 2004 [27] Wang J., Kan L., Nie S., Chen H., Cui S W., Phillips A O., Phillips G O., Li Y., Xie M., “Comparison of chemical composition, bioactive components and 19 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn antioxidant activity of natural and cultured Cordyceps sinensis”, LWT - Food Science and Technology, 63, 2-7, 2015 [28] Wu Y L., Sun C R., Pan Y J., “Studies on isolation and structural features of a polysaccharide from the mycelium of a Chinese edible fungus (Cordycepsm sinensis)”, Carbohydrate Polymers, 63, 251–256, 2006 [29] Xiao J H., Chen D X., Wan W H., Hu X J., Qi Y., Liang Z Q., “Enhanced simultaneous production of mycelia and intracellular polysaccharide in submerged cultivation of Cordyceps jiangxiensis using desirability functions”, Process Biochemistry, 41, 1887–1893, 2006 [30] Yang M L., Kuo P C., Hwang T L., Wu T S., “Anti-inflammatory Principles from Cordyceps sinensis”, J Nat Prod., 74, 1996–2000, 2011 [31] Yu R M., Song L Y., Zhao Y., Bin W., Wang L., Zhang H., et al., “Isolation and biological properties of polysaccharide CPS-1 from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 465–472, 2004 [32] Yu R M., Wang L., Zhang H., Zhou C X., Zhao Y., “Isolation, purification and identification of polysaccharides from cultured Cordyceps militaris”, Fitoterapia., 75, 662–666, 2004 [33] Yu R M., Yang W., Song L Y., Yan C Y., Zhang Z., Zhao Y., “Structural characterization and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies of cultured Cordyceps militaris”, Carbohydrate Polymers, 70, 430–436, 2007 [34] http://www.sigmaaldrich.com/spectra/fnmr/FNMR010385, 13/5/2016 20 PHỤ LỤC 0.914 0.901 0.887 0.827 0.814 0.801 0.553 1.242 1.480 3.608 4.246 4.235 5.268 5.254 5.238 5.223 5.203 5.186 5.172 5.156 5.094 5.092 5.089 5.084 4.517 4.505 CS-TT4-DMSO-1H 28 21 27 22 18 20 24 25 23 H 12 5.094 5.092 5.089 5.084 5.268 5.254 5.238 5.223 5.203 5.186 5.172 5.156 13 11 19 14 10 H 26 27 HO 18 15 H 19 16 26 17 OH 28 OH 5.25 5.15 5.20 f1 (ppm) 21 - OH - OH 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 f1 (ppm) 2.6 2.4 2.2 2.0 Phụ lục Phổ 1H-NMR TT4 (a) 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 2.90 3.22 6.27 6.63 1.34 1.08 1.00 - Hax 0.90 23 22 0.6 0.4 0.2 0.914 0.901 0.887 0.827 0.814 0.801 0.553 1.242 1.480 3.608 4.246 4.235 5.268 5.254 5.238 5.223 5.203 5.186 5.172 5.156 5.094 5.092 5.089 5.084 4.517 4.505 CS-TT4-DMSO-1H 28 21 27 22 18 20 24 25 23 H 12 5.094 5.092 5.089 5.084 0.553 0.914 0.901 0.887 0.827 0.814 0.801 1.009 19 16 14 10 H 19 HO 15 H 26 17 13 11 18 OH OH 26 27 28 21 - OH - OH 22 5.6 5.4 5.2 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0 3.8 3.6 3.4 3.2 3.0 2.8 f1 (ppm) 2.6 2.4 2.2 2.0 Phụ lục Phổ 1H-NMR TT4 (b) 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 2.90 1.34 1.08 1.00 2.32 0.90 - Hax 3.22 6.27 6.63 23 0.6 0.4 0.2 55.295 54.187 42.977 42.319 42.024 36.700 32.442 31.212 29.075 27.771 22.589 21.375 21.028 19.800 19.511 17.763 17.270 12.193 66.039 74.540 72.175 139.707 135.457 131.506 119.394 CS-TT4-DMSO-13C 28 21 27 22 18 24 20 25 23 H 12 13 11 19 16 14 10 H HO 15 H 26 17 27 25 OH 28 19 OH 18 26 21 20 22 23 13 24 15 17 4,10 11 16 140 130 120 110 100 90 80 70 60 f1 (ppm) 50 40 Phụ lục Phổ 13C-NMR TT4 30 20 10 -10 -20 18 19 CS-TT4-DMSO-HSQC 28 27 26 21 23 22 - Hax 10 18 28 26 27 19 21 25 20 15,11 16 30 4,10 40 24 13 50 17 60 28 70 21 27 22 18 20 80 24 25 23 90 H 12 10 HO 23 H 100 16 14 17 13 11 19 26 110 15 H 120 130 OH 22 140 OH 150 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 f2 (ppm) 2.5 Phụ lục Phổ HSQC TT4 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 f1 (ppm) 20 CS-TT4-DMSO-HSQC 19 18 26 28 27 21 28 21 27 22 18 20 24 25 23 H 18 27 13 19 10 21 15 11 16 20 H 25 HO 15 H 15 16 14 26 26 17 OH 30 OH 25 35 4, 10 40 20 24 13 45 50 55 17 60 65 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 f2 (ppm) 1.2 1.0 Phụ lục Phổ HSQC giãn rộng TT4 0.8 0.6 0.4 0.2 f1 (ppm) 19 28 10 12 11 28 21 27 22 18 20 24 25 23 CS-TT4-DMSO-HMBC H 12 13 11 19 HO H 23 26 21 - OH 10 H 28 15 22 - OH - Hax OH OH 10 18 28 26 27 19 20 21 15,11 16 30 25 4,10 20 40 24 13 50 17 60 70 80 90 100 110 120 130 22 23 140 150 160 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 f2 (ppm) 2.5 Phụ lục Phổ HMBC TT4 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 f1 (ppm) 27 16 14 17 18 19 26 28 21 27 22 18 CS-TT4-DMSO-HMBC 24 20 25 23 19 18 H 12 13 11 19 10 27 21 15 H OH OH 10 18 28 27 26 19 20 21 15 11 16 30 25 4, 10 40 20 24 13 50 17 60 70 80 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 f2 (ppm) 0.9 0.8 0.7 0.6 Phụ lục Phổ HMBC giãn rộng TT4 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 f1 (ppm) HO 26 H 17 28 16 14 26 28 21 27 22 18 20 24 26 25 23 19 18 H 12 13 11 19 14 10 15 21 - OH H - OH 23 HO 28 H 26 17 16 27 22 - Hax OH OH 0.0 0.5 18 19 26 28 1.0 21 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 - OH - Hax 4.0 4.5 - OH 5.0 22 23 5.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 f2 (ppm) 2.5 2.0 Phụ lục Phổ COSY TT4 1.5 1.0 0.5 0.0 f1 (ppm) 27 7.5 7.0 6.5 19 HO 6.0 5.5 5.0 10 22 4.5 11 13 14 O 4.0 f1 (ppm) 1.22 0.91 1.89 1.97 2.29 1.98 11.78 2.89 3.70 3.13 3.05 2.80 9.25 23 1.19 1.18 1.19 0.94 1.00 18 20 H 3.5 21 22 23 12 17 H 3.0 Phụ lục Phổ 1H-NMR T2 2.5 2.0 1.5 0.883 0.825 0.823 0.815 0.809 2.102 2.024 1.967 1.844 1.714 1.706 1.700 1.686 1.679 1.673 1.556 1.359 5.245 5.230 5.214 5.199 5.167 5.151 5.136 5.120 4.045 4.034 4.022 4.012 4.003 3.993 3.980 3.970 3.960 3.947 3.937 3.921 6.512 6.495 6.249 6.232 T2-CDCL3-1H 28 19 27 H 25 26 16 28 1.0 27 15 O 6 3-Hax 0.5 1400 1300 1200 18 1100 1000 24 900 26 800 700 21 600 500 400 300 200 100 -100 7.5 7.0 6.5 6.5 6.4 f1 (ppm) 6.0 6.3 5.5 23 5.0 6.2 5.25 22 4.5 4.0 f1 (ppm) 5.20 5.167 5.151 5.136 5.120 5.245 5.230 5.214 5.199 400 1.22 0.91 1.89 1.97 2.29 1.98 11.78 2.89 3.70 3.13 3.05 2.80 9.25 1.19 6.6 6.249 6.232 6.512 6.495 5.15 f1 (ppm) 3.5 3.0 300 200 100 5.10 5.05 2.5 Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR giãn rộng T2 2.0 1.5 0.883 0.825 0.823 0.815 0.809 2.102 2.024 1.967 1.844 1.714 1.706 1.700 1.686 1.679 1.673 1.556 1.359 5.245 5.230 5.214 5.199 5.167 5.151 5.136 5.120 4.045 4.034 4.022 4.012 4.003 3.993 3.980 3.970 3.960 3.947 3.937 3.921 6.512 6.495 6.249 6.232 T2-CDCL3-1H 19 1000 500 28 1.0 27 3-Hax 0.5 1400 1300 1200 1100 18 1000 900 26 800 700 21 600 500 400 300 200 100 -100 23.620 21.031 20.643 20.090 19.787 18.323 17.707 44.640 42.883 39.862 39.371 37.100 34.858 33.224 30.288 28.858 56.177 51.801 51.272 66.497 82.302 79.575 135.567 135.356 132.479 130.905 T2-CDCL3-13C 50000 45000 28 40000 21 27 24 22 18 20 25 23 35000 H 12 14 10 22 25000 H HO 27 7 O O 15 30000 16 H 26 17 13 11 19 4,10 17 24 25 20 14 21 16 26 28 19 20000 18 11 15 12 23 15000 10000 13 5000 -5000 135 130 125 120 115 110 105 100 95 90 85 80 75 70 f1 (ppm) 65 60 55 Phụ lục 11 Phổ 13C-NMR T2 50 45 40 35 30 25 20 15 10 [...]... 15.3, 7.0) 135.2 42.8 33.1 0.82 (d, 6.3) 19.7 0.83 (d, 6.5) 20.0 0.91 (d, 6.8) 17.6 ghi trong CDCl 3 15 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Trong khóa luận này, chúng tôi đã bước đầu tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp bởi TS Đinh Minh Hiệp Thực hiện các phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với sắc... ethanol của mẫu nấm Cordyceps neovolkiana 4.2 ĐỀ XUẤT Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn A1 và A3 Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát trên các phân đoạn còn lại Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các loại cao và hợp chất đã cô lập được 16 Khóa... Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh 2.2 NGUYÊN LIỆU Mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS Đinh Minh Hiệp (Ban quản lý khu nông nghiệp công nghệ cao) vào tháng 7 năm 2015 với khối lượng 3.5 kg 7 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM Sinh khối nấm tươi (3.5 kg) được làm sạch,... H-3 khung sterol 11 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn Phổ 13C-NMR kết hợp phổ HSQC giúp xác định 28 carbon của khung sườn ergosterol So sánh tất cả các tín hiệu carbon của hợp chất TT4 với ergosterol [6, 34] cho thấy có sự tương đồng của tất cả các tín hiệu, ngoại trừ tín hiệu carbon của nhân B, chứng tỏ sự thay đổi nhóm thế của TT4 so với ergosterol chỉ xảy ra trên vòng B của hợp chất này Phổ... định thay đổi cấu trúc của nhân B của hợp chất T2 Từ những dữ kiện phổ phân tích trên và so sánh với dữ liệu phổ của ergosterol peroxide [12], hợp chất T2 được xác định là ergosterol peroxide 14 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 28 22 21 12 19 1 2 11 H 9 10 O O HO 3 4 5 18 13 20 H 17 14 8 H 7 16 26 23 24 25 27 15 6 Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất T2 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ của T2 và ergosterol peroxide... ở vùng từ trường thấp của 2 proton olefin tại δ H 5.24 (dd, J 1 = 15.5 Hz, J 2 = 7.0 Hz) và δ H = 5.20 (J 1 =15.5 Hz, J 2 = 8.0 Hz), phân tích sự chẻ mũi của 2 proton này cho thấy sự tồn tại của 2 proton olefin ghép trans với nhau ở lân cận với 2 nhóm methine khác, qua đó xác định sự tồn tại của nối đôi tại C-22, C-23 của khung sườn sterol Phổ 1H-NMR còn cho thấy sự hiện diện của nhóm oxymethine H-3... 0.99 (d, H 3 -21) Ngoài ra phổ 1H-NMR cũng cho thấy sự hiện diện của nối đôi tại C-22 và C-23 của khung sườn ergosterol tại δ H 5.20 (J 1 = 15.5, J 2 = 7.5) và δ H 5.15 (J 1 = 15.5, J 2 = 8.0), và tín hiệu H-3 đặc trưng của khung sterol tại δ H 3.97 Phổ 13 C-NMR cho thấy sự tồn tại của 28 carbon của khung ergosterol So sánh dữ liệu phổ của hợp chất T2 với ergosterol và hợp chất TT4 cho thấy có sự tương... 17.2 13 Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Khánh Toàn 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2  Hợp chất T2 thu được từ phân đoạn A1  Dạng bột màu trắng, không UV  Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ) được trình bày trong bảng 3.1 (Phụ lục 9, 10, 11)  Biện luận cấu trúc hợp chất T2 (2) Phổ 1H-NMR hợp chất T2 cũng cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm tín hiệu – CH 3 đặc trưng của khung... 3,4Dihydroxyacet ophenone (46) HO OH N H O CH3 O O N O N HO OH OH Flazin (39) OH O NH O HO Ophiocordi (54) 1-Acetyl-ß -carboline (49) HOOC OH 53: Myriocin O Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) 5 Khóa luận tốt nghiệp H3CO 8 8a 7 6 H3CO OH 9 9a 10a 10 4a 5 Nguyễn Khánh Toàn H3CO H3CO OH 3 R1 4 3 H3CO CH3 11 5 5' 10' 4' 3' 1' O 5 CH3 10 OH 5' H3CO CH3 H3CO CH3 OH R2 R2 H3CO 1 O... nhóm thế chỉ xảy ra trên nhân B của hợp chất này Tiếp tục phân tích phổ 1H-NMR, 2 tín hiệu proton alkene H-6 (δ H 6.50) và H-7 (δ H 6.20) cho thấy 2 proton này ghép cis với nhau bởi hằng số ghép J = 8.5 Hz và ở vị trí β so với oxygen So sánh phổ 13C-NMR của (2) với ergosterol thấy có sự biến mất của 2 cặp carbon tứ cấp alkene ở vị trí C-5 và C-8 cùng với sự xuất hiện của 2 cặp carbon tứ cấp liên kết