BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUN LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐỐN UNG THƯ PHỔI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Thái Ngun – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUN LÊ ĐÌNH CHẮC NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ TÁI TỔ HỢP ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUN CYFRA21-1 NHẰM PHÁT TRIỂN KIT CHẨN ĐỐN UNG THƯ PHỔI Chun ngành: Di truyền học Mã số: 62 42 01 21 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LÊ QUANG HUẤN GS.TSKH NGUYỄN TÀI LƯƠNG Thái Ngun – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc chân thành tới PGS.TS Lê Quang Huấn – Trưởng phòng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam; GS.TSKH Nguyễn Tài Lương, người thầy tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ chia sẻ khó khăn với tơi suốt thời gian thực hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cơ Bộ mơn Di truyền Sinh học đại, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh-KTNN Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Ngun Tơi xin cảm ơn giúp đỡ Phòng Quản lý Sau đại học Ban lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm Thái Ngun Tơi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian làm nghiên cứu sinh Tơi xin chân thành cảm ơn quan tâm giúp đỡ q báu tất anh, chị em bạn phòng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Cuối cùng, tơi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất người thân gia đình ln sát cánh bên tơi, quan tâm, động viên tạo điều kiện để tơi hồn thành luận án này! Thái Ngun, ngày tháng năm 2013 NCS Lê Đình Chắc Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu tơi số kết đồng tác giả với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chun ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Thái Ngun, ngày tháng năm 2013 Tác giả Lê Đình Chắc Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Mục Tên chương, phần, mục tiểu mục Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục hình ix Danh mục bảng xii Mở đầu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Trang Nguồn gốc đặc điểm ung thư 1.1.1 Nguồn gốc tế bào ung thư 1.1.2 Đặc điểm tế bào ung thư 1.1.3 Ung thư phổi 1.2 12 Kháng ngun CYFRA21-1 1.2.1 Cytokeratin 12 1.2.2 Cấu trúc Cytokeratin 15 1.2.3 Biểu Cytokeratin 15 1.2.4 Kháng ngun CYFRA21-1 17 1.3 1.3.1 Kháng thể 21 Một số kháng thể sử dụng nghiên 21 cứu thực tiễn 1.3.2 1.4 Các nghiên cứu kháng thể đặc hiệu CYFRA21-1 29 30 Cơng nghệ phage display 1.4.1 Giới thiệu cơng nghệ phage display 30 1.4.2 Ứng dụng kháng thể phage-scFv chẩn đốn 31 điều trị Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 33 Vật liệu Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm 33 2.1.2 Sinh phẩm hóa chất 33 2.1.3 Trang thiết bị 35 2.1.4 Phần mềm máy tính 36 2.2 37 Phương pháp 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 37 2.2.2 Các phương pháp thao tác với DNA, RNA 38 2.2.3 Các phương pháp thao tác với protein tái tổ hợp 46 2.2.4 Các kỹ thuật phage display 49 56 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách dòng xác định trình tự đoạn gen mã hóa 56 kháng ngun CYFRA21-1 3.1.1 Tách RNA tổng số từ máu bệnh nhân ung thư phổi 56 3.1.2 Nhân đoạn gen mã hố kháng ngun CYFRA21-1 58 3.1.3 Tách dòng đoạn gen mã hóa kháng ngun CYFRA21-1 59 3.1.4 Xác định trình tự đoạn gen cDNA mã hóa CYFRA21-1 63 3.2 3.2.1 Biểu thu kháng ngun CYFRA21-1 Nhân vùng mã hóa epitope kháng ngun 65 65 CYFRA21-1 3.2.2 Tách dòng đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng 67 ngun CYFRA21-1 3.2.3 Thiết kế vector biểu pET-21a(+)/Cyfra21-1 68 3.2.4 Biểu protein CYFRA21-1 tái tổ hợp 73 3.2.5 Tinh kháng ngun CYFRA21-1 75 3.2.6 Kết phân tích khối phổ protein tái tổ hợp 76 3.3 Gây miễn dịch gà kháng ngun CYFRA21-1 78 3.4 Thu nhận kháng thể đặc hiệu kháng ngun 81 CYFRA21-1 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v 3.4.1 Tách chiết RNA tổng số từ tủy xương lách gà 82 gây miễn dịch 3.4.2 Nhân đoạn gen mã hóa vùng biến đổi kháng thể 82 gà đặc hiệu epitope kháng ngun CYFRA21-1 3.4.3 Quy trình tạo dòng phage biểu kháng thể scFv 86 (kháng thể phage) 3.4.4 Kết chọn dòng kháng thể phage-scFv đặc hiệu 87 kháng ngun CYFRA21-1 3.4.5 Xác định trình tự gen mã hóa kháng thể đặc hiệu 90 epitope kháng ngun CYFRA21-1 3.5 Sử dụng kháng thể phage-scFv kháng CYFRA21-1 thu 92 để định lượng kháng ngun CYFRA21-1 3.6 Kết định lượng CYFRA21-1 mẫu 98 bệnh phẩm bệnh viện Bạch Mai cung cấp KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 102 NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG 103 BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa trung tâm học liệu 104 http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AML Acute Myelogenous Leukemia Amp Ampicillin APS Amoniumpersulphate cDNA complement DNA CDR Complement Determining Region CEA Carcinoembryonic Antigen CLL Chronic lymphocytic leukemia ddNTP Dideoxyribonucleotide triphosphate DEPC Diethyl Procarbonate EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay EtBr Ethidium Bromide FcR Frament cristallisable Receptor FDA Food and Drug Administration HCDM Human Cell Differentiation Molecules HCL Hairy cell leukemia HL Hodgkin Lymphoma HLDA Human Leukocyte Differentiation Antigen HRP Horseradish peroxidase HT Huyết IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vii KN Kháng ngun Jak Janus tyrosine kinase LAK Lymphokine activated killer LB Luria Betani mAb Monoclonal Antibody MPBS skimmed milk in PBS NHL Non-Hodgkin lymphoma NK Natural Killer NES Neuron specific enolase NRE Negative Regulatory Element NSCLC Non small cell lung carcinoma OD Optical Density PASI Psoriasis Area and Severity Index PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase Chain Reaction PD-IPCR Phage display-IPCR PEG Polyethylene Glycol PRR Positive Regulation Region RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction scFv Single chain variable fragment SDS Sodium Dodecyl Sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ viii SCLC Small cell lung carcinoma TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA TEMED N, N, N’, N’ tetramethylethane-1,2-diamine TMB 3, 3’, 5, 5’ tetramethyl benzidine TPA Tissue polypeptide antigen TPBS Tween 20 in PBS TPS Tissue polypeptide specific antigen VH immunoglobulin heavy chain variable region VL immunoglobulin light chain variable region X-gal 5-bromo - 4-chloro - 3-indolyl-  - D-galactopyranoside UTP Ung thư phổi Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 116 levels as a prognostic factor in c-stage I non-small cell lung cancer”, Eur J Cardiothorac Surg, 32(4), pp 648-652 90 Stensballe A., Jensen O N (2001), “Simplified sample preparation method for protein identification by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: in gel digesion on the prope surface”, European Journal of Mass spectrometry 7, pp 111-121 91 Stone M R., O'Neill A., Catino D and Bloch R J (2005), “Specific interaction of the actin-binding domain of dystrophin with intermediate filaments containing keratin 19”, Molecular Biology of the Cell, 16(9), pp 4280-4293 92 Takahashi H., Kurishima K., Ishikawa H., Kagohashi K., Kawaguchi M and Satoh H (2011), “Optimal cutoff points of CYFRA21-1 for survival prediction in non-small cell lung cancer patients based on running statistical analysis”, Anticancer Research, 30(9), pp 3833-3837 93 Takahashi N., Tsunematsu K., Suzuki A and Kaneda T (2005), “Lung carcinomas with interstitial pneumonia; detection of lung cancers by CYFRA and selection of surgical procedure”, Kyobu Geka, 58(1), pp.15-19 94 Tomita M., Shimizu T., Ayabe T., Yonei A and Onitsuka T (2010), “Prognostic significance of tumour marker index based on preoperative CEA and CYFRA21-1 in non-small cell lung cancer”, Anticancer Research, 30(7), pp 3099-3102 95 Tufman A., Huber R M (2010), “Biological markers in lung cancer: A clinician’s perspective”, Cancer Biomark, 6(3-4), pp 123-135 96 Uchikov A., Dimitrov I., Terzieva D., Mateva N., Kuznanova D and Batashki A (2008), “Diagnostic value of the serum tumor markers Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 117 CEA and CYFRA21-1 in patients with non-small cell lung cancer”, Khirurgiia (Sofiia), (3):18-20 97 Vaporciyan., Amino Acid., Nesbitt J C., Lee J S et al (2000), Cancer Medicine, B C Decker, pp 1227–1292 98 Vivian B., Helena G., Katja W P and Roland E (2004), “Clinical utility of Cytokeratins as tumor markers”, Clinical Biochemistry, 37, pp 529-540 99 Wang J., Shi G., Zhang S., Wang Q., Yang X., Li X., Wang H., Zhang H and Song C (2010), “Clinical value of serum TPS, CEA, Pro-GRP and CYFRA21-1 in patients with lung cancer”, Zhongguo Fei Ai Za Zhi, 13(5), pp 500-505 100 Wang J., Yi Y., Li B., Wang Z., Sun H., Zhang P and Huang W (2010), “CYFRA21-1 can predict the sensitivity to chemoradiotherapy of non-small-cell lung carcinoma”, Biomarkers,15(7), pp 594-601 101 Wang J., Zhang N., Li B., Wang Z., Sun H., Yi Y and Huang W (2011), “Decline of serum CYFRA21-1 during chemoradiotherapy of NSCLC: a probable predictive factor for tumor response”, Tumour Biol, 32(4), pp 689-695 102 Wang Q., Lu J B., Wu B and Hao L Y (2010), “Expression and clinicopathologic significance of proteolysis-inducing factor in nonsmall-cell lung cancer: an immunohistochemical analysis”, Clin Lung Cancer, 11(5), pp 346-351 103 Willats W G T (2002), “Phage display: practicalities and prospects”, Plant Molecular Biology 50, pp 837-854 104 Winter G., Griffiths A D., Hawkins R E and Hoogenboom H R (1994), “Making antibodies by phage display technology”, Annual Review of Immunology 12, pp 433-455 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 118 105 Wu F., Nishioka M., Fujita J., Murota M I., Ohtsuki Y., Ishida T and Kuriyama S (2002), “Expression of Cytokeratin 19 in human hepatocellular carcinoma cell lines”, International Journal of Oncology, 20, pp 31-37 106 Wu G P., Ba J., Zhao Y J and Wang E H (2007), “Diagnostic value of CEA, CYFRA21-1, NSE and CA 125 assay in serum and pleural effusion of patients with lung cancer”, Acta Cytol, 51(4), pp 679-680 107 Yang L., Chen X., Li Y., Yang J and Tang L (2012), “Declines in serum CYFRA21-1 and carcinoembryonic antigen as predictors of chemotherapy response and survival in patients with advanced nonsmall cell lung cancer”, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 4(2), pp 243-248 108 Yeh J J., Liu F Y., Hsu W H., Wang J J., Ho S T and Kao A (2002), “Monitoring Cytokeratin fragment 19 (CYFRA21-1) serum levels for early prediction of recurrence of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma in the lung after surgical resection”, Lung, 180(5), pp 273-279 109 Zissimopoulos A., Stellos K., Permenopoulou V., Petrakis G., Theodorakopoulos P., Baziotis N and Thalassinos N (2007), “The importance of the tumor marker CYFRA21-1 in patients with lung cancer after surgery or chemotherapy”, Hellenic journal of nuclear medicine , 10(1), pp 62-66 110 Zwick M.B., Shen J and Scott J.K (1998), “Phage-displayed peptide libraries”, Current Opinion in Biotechnology 9, pp 427-436 111 http://www.antibodies-online.com/antibody/573309/anti-Cyfra-21-1/ 112 http://www.raybiotech.com/files/manual/antibody/RB-16-0001 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 119 PHỤ LỤC Phụ lục Các mẫu máu bệnh nhân UTP Phụ lục Kết điện di RNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm Phụ lục Bảng phổ đo hàm lượng độ tinh mẫu RNA tổng số máy đo NanoDrop-1000 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 120 Phụ lục Sơ đồ vector tách dòng pCR-TOPO Phụ lục Sơ đồ mơ tả q trình gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 121 Phụ lục Kết So sánh trình tự nucleotide cDNA đoạn gen mã hóa CYFRA21-1 thu với trình tự nucleotide cDNA gen mã hóa CYFRA21-1 Ngân hàng liệu Quốc tế mang ký hiệu K1C19_HUMAN Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 122 Kết tách đoạn dòng gen mã hóa kháng ngun CYFRA21-1 Phụ lục Sơ đồ vector tái tổ hợp pCR2.1-TOPO mang đoạn gen mã hóa vùng epitope kháng ngun CYFRA21-1 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 123 Phụ lục Kết tách đoạn dòng gen mã hóa vùng epitope kháng ngun CYFRA21-1 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 124 Phụ lục 9: Kết đáp ứng miễn dịch gà ELISA sau gây miễn dịch lần thứ Giá trị hấp thụ OD Nồng Gà Gà Gà Gà PBS A 2,015 1,350 1,461 0,484 0,044 B 0,913 0,705 0,789 0,531 0,046 C 0,525 0,247 0,544 0,228 0,046 D 0,168 0,081 0,226 0,097 0,045 450nm độ huyết Gà 1, gà gà gà gây miễn dịch Gà khơng gây miễn dịch giếng phủ PBS A HT gà khơng pha lỗng; B HT gà pha lỗng 10 lần C HT gà pha lỗng 100 lần; D HT gà pha lỗng 1000 lần Phụ lục 10: Kết xác định đáp ứng miễn dịch gà ELISA trước lấy tuỷ xương lách Giá trị hấp thụ OD Nồng 450nm Gà Gà Gà Gà PBS C 2,714 2,029 2,133 0,500 0,059 D 0,433 0,438 0,544 0,162 0,057 độ huyết Gà 1, gà gà gà gây miễn dịch lần thứ Gà khơng gây miễn dịch lại giếng phủ PBS C HT gà pha lỗng 100 lần D HT gà pha lỗng 1000 lần Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 125 Phụ lục 11 Kết OD600 dịch ni tế bào E coli chứa vector tái tổ hợp Khơng bổ sung IPTG Bổ sung IPTG (1 mM) Thời gian sau bổ sung (h) 0.80 0.80 1.74 1.28 1.97 1.42 2.48 1.57 4.14 5.09 22 Phụ lục 12 Đường cong sinh trưởng E coli chứa vector tái tổ hợp Đường Đườngcong congsinh sinhtrường trưởng Bổ sung IPTG Khơng bổ sung IPTG OD600 0 10 15 20 25 Thời gian [h] Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 126 Phụ lục 13 Danh sách bệnh nhân cung cấp mẫu huyết Ký hiệu Tên bệnh nhân Tuổi, khoa Ngày lấy HT M1 Nguyễn Thị N NH4-1962 24/09/2009 M2 Võ Thị H NH4-1960 23/09/09 M3 Nguyễn Thanh B K4B-1957 22/09/09 M4 Vũ Tăng H KH4-1953 19/09/09 M5 Kim Xn N NH4-1978 22/09/09 M6 Phạm Văn T KYHHN-1959 24/09/09 M7 Trần Văn A KYHHN-1944 25/09/09 M8 Hồ Thị T KHn-1925 23/09/09 M9 Lý Thị T KYH-1926 26/09/09 M10 Đào Thị P NH4-1952 01/10/09 P1 Đỗ Thị H Ho-1945 12/09/09 P2 Phạm Thị L Ho-1960 12/09/09 P3 Phạm V KYHHN-1942 15/09/09 P4 Nguyễn Thị T Ho-1938 12/09/09 P5 Mai Xn K NH0-1958 19/09/09 P6 Nguyễn Văn K NHo-1960 02/10/09 P7 Vũ Thị H Ho-1955 12/09/09 P8 Nguyễn Văn V NYH-1954 25/09/09 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 127 P9 Vũ Thanh T KYHHN-1958 15/09/09 P10 Nguyễn Hữu Đ Ho-1981 12/09/09 P11 Nguyễn Văn C KYH-1946 16/09/09 P12 Nguyễn Văn H YHHN-1953 15/09/10 P13 Hồng Văn M KYHHN-1956 15/09/10 P14 Tơ Ngân T KYHHN-1965 15/09/10 T1 Vũ Thị Minh H KNT-1989 15/09/10 T2 Đặng Thị P NCC-1971 18/09/10 T3 Đào Thị H NNT-1978 16/09/10 T4 Trần Văn H KYHHN-1951 18/09/10 T5 Đồn Thị Tuyết A NNT-1981 24/09/10 Phụ lục 14 Kháng sinh mơi trường tăng sinh Dung dịch kháng sinh Thành phần Hàm lượng Ampicilin Ampicillin Na-salt 1g (100mg/ml) H2O 10 ml Kanamycin Kanamycin 1g (100mg/ml) H2O 10 ml Mơi trường Thành phần Hàm lượng LB lỏng Bacto-tryptone 10 g/l NaCl 10 g/l Yeast extract g/l Bacto-tryptone 10 g/l LB đặc Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 128 2xTY TYE NaCl 10 g/l Yeast extract g/l Agar 15g/l Bacto tryptone 16 g/l Bacto yeast extract 10 g/l NaCl g/l Bacto-agar 15 g/l NaCl g/l tryptone 10 g/l Yeast extract g/l Phụ lục 15 Đệm dung dịch Đệm Tên Thành phần Hàm lượng PBS (10X) NaCl 80.0 g/l KCl 2.0 g/l Na2HPO4.7H 2O 27.2 g/l KH2PO4 2.4 g/l Dung dịch Tên Thành phần Hàm lượng Dung dịch I Tris-HCl pH 8,0 25 mM EDTA pH 8,0 10 mM Glucose 50 mM NaOH 0,2 N SDS 1% CH3COOK 60 ml M CH3COOH đậm đặc 115 ml Nước cất 28,5 ml Dung dịch II Dung dịch III Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 129 CaCl2 CaCl2 100 mM PEG/NaCl Polyethylene glycol 8000 20% NaCl 2,5 mol/l Skimmed milk 2% PBS 1X Tween 20 0,05% PBS 1X MPBS TPBS Triethylamine Triethylamine TMB stock TMB 10 mg DMSO ml Dung dịch nhuộm Citrate buffer TMB Số hóa trung tâm học liệu ml TMB stock 100 l H2O 30% l H2O ml http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 130 In mầu: 14-15,17-18,24,27,31,58,60-61,63,65,68-70,73-76,78,80,8284,88,90,93-94,96-98,118-123 In thường: 1-13,16,19-23,25-26,28-30,32-57,59,62,64,66-67,71-72,77,79,81,8587,89,91-92,95,99-117,124-127 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/