BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI MAI THỊ THANH THẢO MÃ SINH VIÊN: 1101470 ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE MÁU CỦA CAO GIÀU SAPONIN TỪ LOÀI GYNOSTEMMA SP TẠI VIỆT NAM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: Ths Thân Thị Kiều My Nơi thực hiện: Bộ môn Dược Liệu – Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực khóa luận này, nhận hướng dẫn giúp đỡ tận tình mặt từ thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, phòng ban thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu thời gian trường Tôi xin trân trọng cảm ơn ThS Đỗ Thị Nguyệt Quế môn Dược lý tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành khóa luận Đặc biệt, xin gửi lời biết ơn chân thành tới ThS Thân Thị Kiều My, người hết lòng bảo, hướng dẫn thời gian làm khóa luận Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, anh em, bạn bè suốt thời gian qua bên cạnh, động viên Do thời gian điều kiện có hạn, khóa luận tránh khỏi thiếu sót, mong góp ý thầy cô bạn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Mai Thị Thanh Thảo MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh 1.1.3 Điều trị 1.1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu 1.2 Tổng quan chi Gynostemma 1.2.1 Vị trí phân loại chi Gynostemma 1.2.2 Đặc điểm thực vật phân bố .7 1.2.3 Thành phần hóa học 1.2.4 Tác dụng dược lý 13 1.2.5 Độc tính 14 1.2.6 Một số nghiên cứu thành phần hóa học chi Gynostemma Việt Nam .15 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1 Nguyên vật liệu, trang thiết bị, phương pháp nghiên cứu 19 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu .19 2.1.2 Hóa chất thiết bị 19 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.3 Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Định tính nhóm hợp chất dịch chiết toàn phần .17 2.2.2 Chiết xuất saponin từ mẫu Giảo cổ lam 24 2.2.3 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu 24 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 26 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Định tính nhóm hợp chất .27 3.2 Chiết xuất saponin 29 3.3 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu loài Giảo cổ lam 29 3.4 Bàn luận 32 3.4.1 Về nhóm hợp chất 35 3.4.2 Về dược liệu phương pháp chiết xuất saponin từ mẫu Giảo cổ lam 35 3.4.3 Về đánh giá tác dụng hạ glucose máu saponin chiết xuất từ Giảo cổ lam thu hái Yên Bái Bắc Cạn 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 38 Kết luận 38 Kiến nghị 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT G.: Gynostemma STZ: Streptozotocin M1 : Mẫu Giảo cổ lam Yên bái M2: Mẫu Giảo cổ lam Bắc Cạn ĐTĐ: Đái tháo đường TLC: Thin-layer chromatography HPTLC : High performance thin layer chromatography GOD : Glucose oxidase CMC : Carboxymethylcellulose TT : Thuốc thử D/c : Dịch chiết EtOH : Ethanol n- BuOH : n-butanol STT : Số thứ tự TB : Trung bình Glu : Glucose CHCl3: Chloroform Glu: Glucose Rha: Rhamnose Xyl: Xylose HPLC: High performance liquid chromatography HPLC-MS: High performance liquid chromatography mass spectrometry DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Saponin thường gặp G.pentaphyllum (Thunb.) Makino 11 Bảng Kết định tính nhóm chất thân Giảo cổ lam thu hái Yên Bái Bắc Cạn 27 Bảng 3: Hàm lượng saponin thu sau chiết xuất 32 Bảng Tác dụng hạ glucosse huyết M1, M2 33 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Cấu trúc khung Dammaran 10 Hình 2: Cấu trúc saponin 11 Hình 3: Các dạng cấu trúc R7 G.pentaphyllum 11 Hình 4: Giảo cổ lam Yên Bái 16 Hình 5: Giảo cổ lam Bắc Cạn 16 Hình 6: Sơ đồ chiết xuất saponin 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh tiểu đường hay gọi bệnh đái tháo đường dạng bệnh nội tiết rối loạn chuyển hóa cacbohydrat hoóc môn insulin tụy bị thiếu hay giảm tác động thể Theo báo cáo toàn cầu năm 2016 WHO [45], số lượng người lớn tuổi sống chung với bệnh tiểu đường gần tăng gấp bốn lần kể từ năm 1980 422,000,000 người Với lối sống đại ngày nay, bệnh tiểu đường trở thành bệnh phổ biến Chính thế, điều trị tiểu đường không vấn đề ngành y tế mà vấn đề toàn xã hội Một hướng nghiên cứu giới sàng lọc, tìm hoạt chất có nguồn gốc tự nhiên, chủ yếu từ thực vật, hoàn thiện phát triển chất/nhóm chất có triển vọng để dùng làm thuốc chữa tiểu đường Giảo cổ lam dược liệu nghiên cứu sử dụng với tác dụng chống oxy hóa [23], hạ lipid máu [41], chống ung thư [34], [38], [49], Nhiều nghiên cứu chứng minh tác dụng hạ glucose máu loài Gynostemma Khi phát mẫu Giảo cổ lam Yên Bái Bắc Cạn với trữ lượng ổn định, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát đặc điểm thực vật, hình thái, thành phần hóa học tập trung chiết xuất saponin từ mẫu Giảo cổ lam mới, đồng thời dùng saponin thu để tiến hành thử nghiệm đánh giá khả hạ glucose máu Với nhiều nghiên cứu giới tác dụng hạ đường huyết Giảo cổ lam đồng thời theo kinh nghiệm người dân địa phương thường sử dụng mẫu để chữa bệnh tiểu đường, nhóm nghiên cứu định thực đề tài “Đánh giá tác dụng hạ glucose máu cao giàu saponin từ loài Gynostemma sp Việt Nam” với 02 mục tiêu: Chiết xuất cao giàu saponin từ loài Giảo cổ lam thu hái Yên Bái Bắc Cạn Đánh giá tác dụng hạ glucose máu cao giàu saponin từ loài Giảo cổ lam thu hái Yên Bái Bắc Cạn Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan bệnh Đái tháo đường 1.1.1 Khái niệm Đái tháo đường bệnh rối loạn chuyển hóa gây tăng đường huyết mạn tính thiếu Insulin tương đối tuyệt đối Những rối loạn dẫn đến hôn mê tử vong thời gian ngắn không điều trị kịp thời [18] 1.1.2 Cơ chế bệnh sinh Đái tháo đường bệnh tự miễn có tác động yếu tố: di truyền, miễn dịch, môi trường chế độ dinh dưỡng Insulin hormon tuyến tụy đóng vai trò quan trọng điều hòa đường huyết Nó làm giảm hàm lượng đường máu thông qua tác động đến tổng hợp glycogen, triglycerid, protein Ở người bình thường, nồng độ Insulin máu phụ thuộc vào lượng glucose huyết Khi đường huyết tăng, lượng Insulin tiết tăng lên để điều hòa lại nồng độ đường huyết Vì nguyên nhân đó, lượng Insulin tiết không đủ để đảm bảo chức kiểm soát đường huyết Kết nồng độ đường huyết cao dẫn đến dẫn đến đái tháo đường typ I Ngược lại, nồng độ đường huyết tăng cao lượng Insulin mức bình thường chí mức cao có suy giảm chất lượng số lượng receptor nhận biết Insulin tế bào đích nên đáp ứng Insulin với đường huyết dẫn đến bệnh đái tháo đường typ II [18], [21] 1.1.3 Điều trị Nguyên tắc điều trị - Làm triệu chứng tăng đường huyết (nhưng tránh hạ mức) 28 STT Nhóm chất Phản ứng định tính Quan sát tượng Kết – – Phản ứng với FeCl3 5% +++ +++ Phản ứng chì acetat 10% +++ +++ Không Không Phản ứng với gelatin 1% – – Vết mờ giấy lọc – – Không Không – – Không Không + + Có Có + +++ Có Có – – + ++ Có Có + ++ Có Có huỳnh quang Tanin Chất béo Caroten 10 11 12 13 Sterol Đường khử Acid hữu Acid amin Kết luận Phản ứng với acid H2SO4 đặc Phản ứng với anhydrid acetic acid H2SO4 đặc Phản ứng với TT Fehling A, Fehling B Phản ứng với tinh thể Na2CO3 Phản ứng với TT Ninhydrin 3% Polysaccarid Phản ứng với TT lugol Chú thích: (–) Phản ứng âm tính (+) Phản ứng dương tính Không Không (++) Phản ứng dương tính rõ (+++) Phản ứng dương tính rõ Nhận xét: - Trong thân Giảo cổ lam thu hái Yên Bái có flavonoid, saponin, sterol, đường khử, acid amin polysaccharid Trong flavonoid saponin nhóm - Trong thân loài Giảo cổ lam Bắc Cạn có saponin, flavonoid, sterol, đường khử, acid amin polysaccharid Trong saponin flavonoid nhóm 29 Theo loài cho phản ứng rõ với thuốc thử Saponin 3.2 Chiết xuất saponin Các bước chiết xuất saponin Qua tham khảo tài liệu, saponin Giảo cổ lam thuộc nhóm dammaran, xuất nhiều thuộc chi Panax L., họ Araliaceae Saponin hợp chất phân cực mạnh, tan tốt nước, MeOH, EtOH, nBuOH, không tan aceton Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy dung dịch n-BuOH bão hòa nước có khả chiết xuất phần lớn saponin dược liệu Vì đề tài này, phương pháp chiết n- BuOH bão hòa nước kết tủa aceton để thu saponin thô lựa chọn loài Quá trình chiết xuất cụ thể sau: - Cân xác khoảng 100 gam dược liệu khô làm nhỏ kích cỡ vừa phải, chiết hồi lưu cách thủy 1,2l EtOH 70% (400ml/lần, lần) lần Lọc lấy dịch chiết EtOH, cất thu hồi dung môi áp suất giảm, dịch nước - Lần lượt lắc dịch nước với n-Hexan, CHCl3, n-BuOH bão hòa nước cất thu hồi dung môi Phần dịch chiết n-BuOH bão hòa nước sau cất thu hồi n-BuOH thu dịch lỏng - Dùng aceton kết tủa saponin phần dịch với thể tích lần thể tích dịch lỏng Saponin thô sấy khô bảo quản lọ thủy tinh kín tránh hút ẩm, cân xác định khối lượng sản phẩm thu sau mẻ Các bước tiến hành chiết xuất tóm tắt hình Xác định hàm lượng saponin thu được: Cân xác khoảng 100g bột dược liệu xác định độ ẩm Chiết xuất theo sơ đồ hình Saponin thu đem sấy 60°C tới khối lượng không đồi Cân tính hàm lượng theo công thức: 30 F= x 100 Trong đó: F: Hàm lượng (%) a: Khối lượng saponin (g) M: Lượng dược liệu đem cân (g) x: Độ ẩm dược liệu (%) Số liệu xác định hàm lượng saponin thu sau chiết xuất trình bày bảng 31 Dược liệu EtOH 70% hồi lưu D/c EtOH EtOH Thu hồi Dịch nước n- Hexan n-Hexan thu hồi CHCl3 thu hồi Cắn B n-BuOH CHCl3 BuOH thu hồi Cắn C Dịch nước Dịch lỏng Aceton, lọc hút, rửa tủa nhiều lần Tủa M (Saponin) Dịch Thu hồi dung môi Cắn D Hình 6: Sơ đồ chiết xuất saponin 32 Bảng : Hàm lượng saponin thu sau chiết xuất Khối lượng dược liệu (g) STT Bắc Cạn Yên Bái Hàm ẩm (%) Bắc Cạn Yên Bái Cao giàu Saponin (g) (%) 100,26 100,27 8,70 8,70 Bắc Cạn 4.72 99,23 99,23 8,70 8,70 4.61 9,22 5.09 10,18 101,00 101,00 8,70 8,70 4.70 9,41 5.10 10,20 TB Yên Bái 9,45 Bắc Cạn Yên Bái 5.01 10,03 5.07±0,05 10,14±0,09 (%) 3.3 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu loài Giảo cổ lam M1: Giảo cổ lam thu hái Yên Bái M2: Giảo cổ lam thu hái Bắc Cạn Tác dụng hạ glucose huyết M1, M2 Trên chuột gây tăng glucose huyết STZ, kết định lượng nồng độ glucose huyết trước cho uống mẫu thử (0h) sau cho chuột uống M1, M2 dung môi dùng để pha mẫu thử 2h trình bày bảng 33 Bảng Tác dụng hạ glucosse huyết M1, M2 Lô Mẫu thử/ liều dùng Chứng bệnh (n=7) Gliclazid Gliclazid (n=8) 20mg/kg M1-liều Mẫu M1 với (n=8) liều 2g/kg M1-liều Mẫu M1 với (n=8) liều 1g/kg M2-liều Mẫu M2 với (n=8) liều 1g/kg M2-liều Mẫu M2 với (n=8) liều 0,5g/kg Nồng độ glucose huyết trước uống mẫu thử (0h) (mmol/L) Nồng độ glucose huyết sau uống mẫu thử 2h (mmol/L) % giảm glucose huyết so với trước uống mẫu thử 13.30±2.68 11.10±2.27 16.54±5.72 15.03±1.55 6.50± 0.71 15.22 ± 2.59 10.70 ± 2.19 10.71±1.19 7.71 ± 1.26 15.43± 2.80 9.97±1.78 53.37±6.56 p[...]... tủa saponin trong phần dịch này với thể tích aceton bằng 5 lần thể tích của dịch 2. 2.3 Đánh giá tác dụng hạ glucose máu Saponin chiết xuất từ mẫu Giảo cổ lam thu hái tại Yên Bái (kí hiệu là M1) và Saponin chiết xuất từ mẫu Giảo cổ lam thu hái tại Bắc Cạn ( kí hiệu M2) được hòa tan vào nước với các nồng độ thích hợp để tiến hành thử nghiệm đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên chuột được gây tăng glucose. .. Nhụy 1 hoặc 2 Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở Hạt sần sùi [1], [25 ] 1 .2. 2 .2 Phân bố chi Gynostemma Các loài của chi Gynostemma Blume phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea Hiện trên thế giới đã ghi nhận 21 loài thuộc chi Gynostemma [28 ] Ở Trung Quốc đã ghi nhận được 14 loài [25 ] Tại Việt Nam đã công bố 4 loài thuộc chi Gynostemma. .. giới và Việt Nam để khẳng định tác dụng và tìm ra cơ chế hạ đường huyết của nhiều loại thảo dược [18] 1.1.4 Các phương pháp đánh giá tác dụng hạ glucose máu Được chia thành 2 loại: nghiên cứu in vivo và nghiên cứu in vitro 1.1.4.1 Nghiên cứu in vivo: Thường được dùng để sàng lọc hoặc nghiên cứu hướng cơ chế tác dụng của thuốc Các mô hình hay được áp dụng bao gồm: - Đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên glucose. .. độ nhạy cảm insulin của tất cả các mô trong cơ thể được xác định thông qua khả năng tiêu thụ glucose của cơ thể ở điều kiện nồng độ glucose đạt trạng thái ổn định 7 1.1.4 .2 Nghiên cứu in vitro: Có 2 loại mô hình đánh giá: - Đánh giá tác dụng của thuốc trên các cơ quan, tế bào cô lập: chủ yếu tập trung vào đánh giá ảnh hưởng của thuốc đến khả năng bài tiết insulin của đảo tụy và đánh giá ảnh hưởng của. .. hưởng của thuốc đến mức độ nhạy cảm insulin tại tế bào đích và quá trình sử dụng glucose của tế bào - Đánh giá tác dụng của thuốc trên một số enzyme tham gia điều hòa glucose máu: Dựa vào khả năng thủy phân của các enzyme đối với cơ chất thích hợp ở các điều kiện thích hợp 1 .2 Tổng quan về chi Gynostemma 1 .2. 1 Vị trí phân loại chi Gynostemma Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam [6], Thực vật dược và phân... do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp 2. 2 Nội dung nghiên cứu - Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ chính trong 2 mẫu Giảo cổ lam nghiên cứu - Chiết xuất saponin từ mẫu Giảo cổ lam - Đánh giá tác dụng hạ glucose máu của 2 loài Gynostemma 2. 3 Phương pháp nghiên cứu 2. 3.1 Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ chính trong dược liệu Bằng các phản ứng đặc trưng của các nhóm hợp chất hữu cơ: 1 Định tính... thuốc So sánh giá trị glucose máu sau khi dùng thuốc với trước khi dùng thuốc để đánh giá tác dụng của mẫu thử Song song tiến hành lô chứng để so sánh - Đánh giá khả năng dung nạp glucid: Định lượng glucose máu trước khi cho uống glucose (hoặc polysaccharide) và các thời điểm sau uống glucose (hoặc polysaccharide), so sánh mức độ tăng glucose tại các thời điểm, so sánh với lô chứng để đánh giá khả năng... acid glucuronic (1 ,2% ), [46] - Chlorophyll và dẫn chất: bằng phương pháp HPLC-MS, đã tách và xác định được trong G.pentaphyllum có 15 chlorophyll và dẫn chất [30] 13 - Alcaloid: được báo cáo là không có mặt trong G.pentaphyllum [22 ] 1 .2. 4 Tác dụng dược lý Các tác dụng của Gynostemma được cho là có được bởi saponin và flavonoid, đặc biệt là saponin [41] 1 .2. 4.1 Tác dụng hạ lipid máu Các kết quả nghiên... trước đó 6h) [ 42] 25 Phương pháp định lượng glucose máu: Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng oxy hoá glucose thành acid gluconic được xúc tác bởi glucose oxidase (GOD) như sau: GOD Glucose + H2O +O2 Acid gluconic + H2O2 H2O2 tạo thành sẽ bị peroxidase phân huỷ và giải phóng O2, oxy hoá O-Dianisidin tạo thành phức chất có màu vàng nâu theo phản ứng: O-Dianisidin + H2O2 Phức chất màu vàng nâu + H2O Cường độ màu... ăn giàu chất béo (chiếm 40-60% thành phần calo) trong thời gian dài (1 -2 tháng) để gây kháng insulin và gây tổn thương tế bào β đảo tụy, gây tình trạng ĐTĐ Việc gây ĐTĐ với chế độ dinh dưỡng trên chuột có nhiều đặc điểm giống với ĐTĐ typ 2 thể béo phì trên người [31]  Đánh giá tác dụng hạ glucose máu in vivo - Đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên glucose máu: nguyên tắc chung là định lượng glucose máu