BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN KHÁNH LINH MÃ SINH VIÊN: 1101299 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SILYMARIN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN KHÁNH LINH MÃ SINH VIÊN: 1101299 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG SILYMARIN TRONG MỘT SỐ LOẠI THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lê Đình Chi ThS Cao Công Khánh Nơi thực hiện: Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia HÀ NỘI – 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Lê Đình Chi ThS Cao Công Khánh người thầy dìu dắt từ ngày đầu làm nghiên cứu khoa học người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, giúp đỡ hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, anh chị Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật - Hà Nội quan tâm, giúp đỡ thời gian vừa qua Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng ban, thầy cô giáo cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – người dạy bảo giúp đỡ suốt năm học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em dành cho giúp đỡ động viên quý báu suốt thời gian qua Hà Nội, ngày 09 tháng 05 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Khánh Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan silymarin 1.1.1 Cấu trúc : 1.1.2 Tính chất lý hóa 1.1.3 Tính chất dược động học, tác dụng dược lý .5 1.2 Tổng quan HPLC 1.2.1 Khái niệm chung 1.2.2 Nguyên tắc trình sắc ký 1.2.3 Các thông số đặc trưng HPLC [1], [2] 10 1.2.4 Thiết bị HPLC: .13 1.2.5 Ứng dụng phương pháp HPLC 16 1.3 Một số phương pháp phân tích silymarin 17 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Nguyên vật liệu - thiết bị 25 2.2.1 Nguyên vật liệu 25 2.2.2 Thiết bị 25 2.2.3 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Khảo sát điều kiện phân tích silymarin HPLC 26 2.3.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 27 2.3.3 Thẩm định quy trình .27 2.4 Phương pháp xử lý số liệu 30 CHƯƠNG : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 31 3.1 Thực nghiệm kết .31 3.1.1 Thiết lập điều kiện sắc ký để phân tích silymarin 31 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu .35 3.1.3 Thẩm định phương pháp: .40 3.1.4 Kết áp dụng phương pháp xác định silymarin số sản phẩm 56 3.2 Bàn luận 60 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 4.1 Kết luận .61 4.2 Kiến nghị 62 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HPCE Điện di mao quản hiệu cao (High Performance Capillary Electrophoresis ) KN Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm ATVSTP LC- MS Sắc ký lỏng khối phổi (Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry ) LOD Giới hạn phát hiên (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification) PDA Photo Diod Arrays PT Phương trình R Hệ số hồi quy tuyến tính RSD (%) Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) TB Trung bình TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) UV Tử ngoại (Ultraviolet) UPLC Sắc ký lỏng siêu hiệu (Ultra performance liquid chromatography) DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo Silymarin [16], [17], [18] .4 Hình 1.2 Quá trình rửa giải tách peak chất A chất B .10 Hình 1.3 Sơ đồ nguyên lý máy HPLC .13 Hình 3.1 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 32 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 33 Hình 3.3 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 34 Hình 3.4 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp với chương trình 35 Hình 3.5 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp 36 Hình 3.6 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang cứng chiết methanol 36 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang mềm chiết methanol 38 Hình 3.8 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp silymarin 41 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu trắng 41 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp 42 Hình 3.11 Đường chuẩn Silybin A 44 Hình 3.12 Đường chuẩn Silybin B 45 Hình 3.13 Đường chuẩn isosilybin A 46 Hình 3.14 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC01 58 Hình 3.15 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC03 58 Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang NM01 59 Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NM02 .59 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất vật lý số silymarin [8] Bảng 1.2 Phân lọai sắc ký 15 Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích Silymarin 17 Bảng 2.1 Danh mục mẫu phân tích 24 Bảng 3.1 Chương trình gradient dung môi 31 Bảng 3.2 Chương trình gradient dung môi 32 Bảng 3.3 Chương trình gradient dung môi 33 Bảng 3.4 Chương trình gradient dung môi 34 Bảng 3.5 Kết định lượng silybin A viên nang cứng theo dung môi .36 Bảng 3.6 Kết định lượng silybin B viên nang cứng theo dung môi .37 Bảng 3.7 Kết định lượng isosilybin A viên nang cứng theo dung môi 37 Bảng 3.8 Kết định lượng Silymarin tổng viên nang cứng theo dung môi 37 Bảng 3.9 Kết định lượng silybin A viên nang mềm theo dung môi 39 Bảng 3.10 Kết định lượng silybin B viên nang mềm theo dung môi 39 Bảng 3.11 Kết định lượng isosilybin A viên nang mềm theo dung môi 39 Bảng 3.12 Kết định lượng silymarin tổng viên nang mềm theo dung môi 40 Bảng 3.13 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống 42 Bảng 3.14 Kết đánh giá độ tuyến tính Silybin A 43 Bảng 3.15 Kết đánh giá độ tuyến tính Silybin B 44 Bảng 3.16 Kết đánh giá độ tuyến tính isosilybin A 46 Bảng 3.17 Giới hạn phát Silybin A 47 Bảng 3.18 Giới hạn phát Silybin B 48 Bảng 3.19 Giới hạn phát Isosilybin A 48 Bảng 3.20 Độ lặp lại phương pháp với viên nang cứng tính theo Silybin A 50 Bảng 3.21 Độ lặp lại phương pháp với viên nang cứng tính theo Silybin B 50 Bảng 3.22 Độ lặp lại phương pháp với viên nang cứng tính theo Isosilybin A 51 Bảng 3.23 Độ lặp lại phương pháp với viên nang mềm tính theo Silybin A 51 Bảng 3.24 Độ lặp lại phương pháp với viên nang mềm tính theo Silybin B 52 Bảng 3.25 Độ lặp lại phương pháp với viên nang mềm tính theo Isosilybin A 52 Bảng 3.26 Độ thu hồi Silybin A phương pháp với viên nang cứng 53 Bảng 3.27 Độ thu hồi Silybin A phương pháp với viên nang mểm 54 Bảng 3.28 Độ thu hồi Silybin B phương pháp với viên nang cứng 54 Bảng 3.29 Độ thu hồi Silybin B phương pháp với viên nang mềm 55 Bảng 3.30 Độ thu hồi Isosilybin A phương pháp với viên nang cứng 55 Bảng 3.31 Độ thu hồi Isosilybin A phương pháp với viên nang mềm 56 Bảng 3.32 Kết phân tích mẫu thực 57 Bảng 4.1 Gradient pha động 61 ĐẶT VẤN ĐỀ Xã hội đại giúp chất lượng sống nâng cao đáng kể, từ người trọng đến vấn đề sức khỏe Bên cạnh việc ăn uống hợp lý, thể dục điều độ bổ sung dinh dưỡng từ loại thực phẩm chức quan tâm Thế nhưng, chất thực phẩm chức bị hiểu chưa dẫn đến tranh cãi cộng đồng người tiêu dùng Thực phẩm chức thực phẩm có lợi cho hay nhiều hoạt động thể cải thiện tình trạng sức khoẻ làm giảm nguy mắc bệnh so với giá trị dinh dưỡng mà mang lại [39] Bộ Y tế Việt Nam định nghĩa thực phẩm chức năng: thực phẩm dùng để hỗ trợ chức phận thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng giảm bớt nguy gây bệnh Tuỳ theo công thức, hàm lượng vi chất hướng dẫn sử dụng, thực phẩm chức có tên gọi sau: thực phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng, thực phẩm bổ sung, thực phẩm bảo vệ sức khoẻ, sản phẩm dinh dưỡng y học.[3] Theo nghiên cứu Silymarin có hoạt tính tốt như: giúp ổn định màng tế bào gan [41], chất chống oxy hóa, chống peroxyd hóa lipid, tăng khả oxi hóa acid béo gan, làm ổn định tế bào gây viêm, ức chế phản ứng viêm [5], [20], [41], giảm nồng độ enzym gan, làm cải thiện triệu chứng bệnh gan gan nhiễm mỡ, viêm gan…[26] Chính mà thực phẩm chức chứa Silymarin sản xuất ngày nhiều đối tượng sử dụng ngày đông đảo Do để bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng hỗ trợ quan chức việc kiểm soát tốt vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm, thực phẩm chức năng, tiến hành “ Nghiên cứu xác định hàm lượng Silymarin số loại thực phẩm chức HPLC” với mục tiêu: - Xây dựng quy trình xác định hàm lượng Silymarin thực phẩm chức - Ứng dụng quy trình xây dựng để phân tích số sản phẩm thực phẩm chức lưu hành thị trường 53 Nhận xét: Theo AOAC, mức nồng độ 100 μg/mL, độ lặp tối đa chấp nhận có giá trị RSD(%) 5,3, mức nồng độ 10 μg/mL, độ lặp tối đa chấp nhận có giá trị RSD(%) 7,3 [4] Từ bảng kết ta thấy silybin A, silybin B isosilybin A có độ lặp nằm giới hạn cho phép.Như phương pháp có độ lặp đạt yêu cầu AOAC phân tích silymarin viên nang 3.1.3.6 Độ thu hồi phương pháp Độ thu hồi phương pháp đánh giá cách thêm chuẩn hỗn hợp silybinin isosilybin A vào mẫu thực phẩm chức không chứa silymarin qua đánh giá sơ xác định tỷ lệ (%) thu hồi chuẩn chất phân tích xử lý mẫu phân tích theo quy trình xây dựng Độ thu hồi phương pháp thẩm định mẫu nang cứng nang mềm Kết phân tích thực nghiệm ghi lại bảng sau: Bảng 3.26 Độ thu hồi Silybin A phương pháp với viên nang cứng Nồng độ chuẩn Lần phân Silybin A thêm tích (μg/mL) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ Silybin A mẫu trắng thêm chuẩn (μg/mL) Độ thu hồi (%) 26,1 2418235 26,11 100,0 26,1 2401015 25,92 99,3 26,1 2416511 26,09 100,0 26,1 2420052 26,13 100,1 26,1 2397459 25,88 99,2 26,1 2406792 25,98 99,6 26,1 2342843 25,29 96,9 26,1 2328795 25,14 96,3 Trung bình 25,81 RSD (%) 1,49 54 Bảng 3.27 Độ thu hồi Silybin A phương pháp với viên nang mểm Lần Nồng độ chuẩn phân Silybin A thêm vào tích (μg/mL) Diện tích pic (mAU.s) Nồng độ Silybin mẫu Độ thu trắng hồi (%) thêm chuẩn (μg/mL) 01 26,1 2420703 26,13 100,1 02 26,1 2419501 26,12 100,1 03 26,1 2408793 26,01 99,6 04 26,1 2398587 25,89 99,2 05 26,1 2405748 25,97 99,5 06 26,1 2420874 26,14 100,1 07 26,1 2399945 25,91 99,3 08 26.1 2406482 25,98 99,5 Trung bình 26,01 RSD (%) 0,38 Bảng 3.28 Độ thu hồi Silybin B phương pháp với viên nang cứng Lần Nồng độ chuẩn Diện tích pic Nồng độ Silybin Độ thu phân Silybin A thêm (mAU.s) mẫu trắng thêm hồi tích vào (μg/mL) chuẩn (μg/mL) (%) 01 40,2 5308192 40,04 99,6 02 40,2 5357998 40,41 100,5 03 40,2 5336987 40,25 100,1 04 40,2 5299768 39,97 99,4 05 40,2 5318775 40,13 99,8 06 40,2 5338173 40,26 100,2 07 40,2 5326890 40,18 99,9 08 40,2 5329609 40,29 100,0 Trung bình 40,18 RSD (%) 0,34 55 Bảng 3.29 Độ thu hồi Silybin B phương pháp với viên nang mềm Nồng độ chuẩn Lần Diện Nồng độ Silybin B Silybin B thêm tích pic mẫu trắng thêm vào (μg/mL) (mAU.s) chuẩn (μg/mL) phân Độ thu hồi (%) tích 01 40,2 5339003 40,27 100,2 02 40,2 5318075 40,11 99,8 03 40,2 5319765 40,12 99,8 04 40,2 5308745 40,04 99,6 05 40,2 5327549 40,18 100,0 06 40,2 5336004 40,25 100,1 07 40,2 5304722 40,01 99,5 08 40,2 5324793 40,16 99,9 Trung bình 40,14 RSD (%) 0,22 Bảng 3.30 Độ thu hồi Isosilybin A phương pháp với viên nang cứng Lần Nồng độ chuẩn Diện Nồng độ isosilybin Độ phân isosilybin A thêm tích pic mẫu trắng thêm hồi tích vào (μg/mL) chuẩn (μg/mL) (mAU.s) thu (%) 01 9,2 1091211 8,87 96,4 02 9,2 1128736 9,22 100,2 03 9,2 1117985 9,12 99,1 04 9,2 1108882 9,03 98,2 05 9,2 1121358 9,15 99,4 06 9,2 1132904 9,26 100,6 07 9,2 1128533 9,2 100,2 08 9,2 1139054 9,31 101,2 Trung bình 9,14 RSD (%) 1,56 56 Bảng 3.31 Độ thu hồi Isosilybin A phương pháp với viên nang mềm Lần Nồng độ chuẩn Diện tích Nồng độ isosilybin A Độ thu phân isosilybin A thêm pic mẫu trắng thêm hồi (%) tích vào (μg/mL) (mAU.s) chuẩn (μg/mL) 01 9,2 1128792 9,22 100,2 02 9,2 1118695 9,12 99,2 03 9,2 1126718 9,20 100,0 04 9,2 1109766 9,04 98,3 05 9,2 1116875 9,11 99,0 06 9,2 1130003 9,23 100,3 07 9,2 1114053 9,08 98,7 08 9,2 1125849 9,19 99,9 Trung bình 9,15 RSD (%) 0,77 Nhận xét: Theo AOAC, mức nồng độ 10 μg/mL, độ thu hồi phương pháp phải đạt 80-110%; mức nồng độ 100 μg/mL, độ thu hồi phương pháp phải đạt 90-110% [4] Từ bảng kết ta thấy silymarin (silybin A, silybin B, isosilybin A) có hiệu suất thu hồi nằm giới hạn cho phép Như phương pháp có độ thu hồi đạt yêu cầu AOAC phân tích silymarin (silybin A, silybin B, isosilybin A) viên nang 3.1.4 Kết áp dụng phương pháp xác định silymarin số sản phẩm Chúng tiến hành nghiên cứu 12 thực phẩm chức chức thị trường theo phương pháp thu kết bảng 3.32 57 Bảng 3.32 Kết phân tích mẫu thực STT Mã sản Dạng bào chế phẩm Hàm lượng nhãn Hàm lượng Tỉ lệ Silymarin Silymarin (mg/viên) (mg/viên) so với (%) 01 NC01 Nang cứng 243,75 168,7 69,1 02 NC02 Nang cứng 140 76,5 54,6 03 NC03 Nang cứng 140 84,7 60,5 04 NC04 Nang cứng 100 56,4 56,4 05 NC05 Nang cứng 200 127 63,5 06 NC06 Nang cứng 120 64.2 53,5 07 NC07 Nang cứng 140 69,7 49,8 08 NM01 Nang mềm 100 39,4 37,8 09 NM02 Nang mềm 150 52,1 34,7 10 NM03 Nang mềm 100 17,2 17,2 11 NM04 Nang mềm 80 12,7 15,8 12 NM05 Nang mềm 100 20,5 20,5 nhãn 58 Hình 3.14 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC01 Hình 3.15 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NC03 59 Hình 3.16 Sắc ký đồ dung dịch mẫu nang NM01 Hình 3.17 Sắc ký đồ dung dịch mẫu NM02 Nhận xét : - Chúng áp dụng quy trình phân tích phía để xác định hàm lượng silymarin 12 mẫu thực phẩm chức thị trường có chứa thành phần kế sữa Kết cho thấy mẫu NC01 có tỉ lệ hàm lượng silymarin xác định so với hàm lượng cao chiết xuất kế sữa cao 69,1%, mẫu NM04 có tỉ lệ hàm lượng silymarin xác định so với hàm lượng cao chiết xuất kế sữa thấp 15,8%, 60 - Có chênh lệch đáng kể hàm lượng xác định hàm lượng ghi nhãn sản phẩm Ngoài sản phẩm có khác hàm lượng tỉ lệ silymarin cao chiết xuất, viên nang mềm có hàm lượng tỉ lệ silymarin thấp viên nang cứng 3.2 Bàn luận - Điểm khác đề tài so với dược điển Mỹ lựa chọn chương trình gradient giúp rửa giải silymarin cách hiệu mẫu thời gian cho lần phân tích 20 phút, tiết kiệm thời gian dung môi Quy trình xử lý mẫu lựa chọn đơn giản, có khả làm mẫu, tạp, dung sẵn có, kinh tế giúp cho việc xác định định lượng chất sắc đồ dễ dàng Phương pháp thẩm định phù hợp với yêu cầu AOAC tính chọn lọc, độ lặp lại, độ thu hồi - Trên thị trường có nhiều thực phẩm chức chứa Silymarin Tuy nhiên hầu hết nhà sản xuất công bố hàm lượng cao chiết xuất từ kế sữa nhãn sản phẩm Điều gây khó khăn cho người tiêu dùng xác hàm lượng silymarin- chất có tác dụng chiết xuất từ kế sữa Vì vậy, kiến nghị nhà sản xuất cần ghi rõ hàm lượng silymarin tỉ lệ silymarin cao chiết xuất nhãn sản phẩm để người tiêu dùng lựa chọn sản phẩm theo mong muốn nhà quản lý kiểm soát chất lượng 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Với mục đích ứng dụng phương pháp HPLC để xác hàm lượng silymarin thực phẩm chức năng, tiến hành nghiên cứu điều kiện thực nghiệm thu kết xây dựng phương pháp định lượng silymarin viên nang thực phẩm chức trải qua giai đoạn: - Giai đoạn xử lý mẫu + Xác định khối lượng trung bình viên, đồng mẫu + Cân xác lượng mẫu sau đồng (0,1- g, tùy thuộc hàm lượng công bố) vào ống ly tâm 50 mL + Thêm khoảng 20 mL methanol vào ống ly tâm + Lắc xoáy ống ly tâm phút, sau lắc siêu âm 15 - 30 phút nhiệt độ phòng + Gạn lấy phần dịch, định mức 25,0 mL methanol lọc qua màng lọc 0,45 µm + Tiêm vào hệ thống sắc kí HPLC (pha loãng cần) - Giai đoạn phân tích HPLC với điều kiện: + Pha tĩnh: Cột C18 Symmetry Waters (250 mm x 4,6 mm; μm) tiền cột loại + Pha động: chạy theo chương trình gradient nồng độ Kênh A: Natri perchlorat (pH 3,0) Kênh B: Methanol Bảng 4.1 Gradient pha động Thời gian (phút) Thành phần pha động (%) A B + Nhiệt độ cột: 300C + Tốc độ dòng: mL/phút + Thể tích tiêm mẫu: 50 μL 60 40 50 50 16 40 60 17 60 40 20 Stop Stop 62 + Detector PDA với bước sóng phát 288 nm Phương pháp xây dựng xác định khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn cho silybin A (trong khoảng nồng độ từ 0,75 µg/ml đến 75 µg/ml), silybin B (trong khoảng nồng độ từ 0,75 µg/ml đến 75 µg/ml), isosilybin A (trong khoảng nồng độ từ 1,5 µg/ml đến 150 µg/ml), xác định LOD Silybin A 0,09 µg/ml, Silybin B 0,09 µg/ml, Isosilybin A 0,22 µg/ml Và giá trị định lượng LOQ Silybin A 0,30 µg/ml, Silybin B 0,31 µg/ml, Isosilybin A 0,73 µg/ml, có độ lặp lại độ thu hồi đáp ứng yêu cầu AOAC - Từ kết thực nghiệm, nhận thấy phương pháp HPLC phù hợp đáng tin cậy để xác định hàm lượng Silyamrin thực phẩm chức 4.2 Kiến nghị - Phương pháp cho kết xác định silymarin có độ tin cậy tương đối cao Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu đối tượng khác viên nang như: loại trà thảo dược dạng lỏng, dạng túi, dạng bột, số loại thuốc, máu, nước tiểu - Do điều kiện phòng thí nghiệm nên nghiên cứu xác định hàm lượng silybin A, silybin B, isosilybin A Ngoài số flavonolignans khác hỗn hợp silymarin chưa phân lập xác định hàm lượng Vì vậy, cần tiếp tục nghiên cứu sâu hơn, sử dụng thêm chất chuẩn, tìm phương pháp xác định thành phần lại silymarin TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An, cs (2007), Hóa Phân Tích - tập - Phân tích dụng cụ, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.173-210 Trần Tử An, cs (2011), Kiểm nghiệm dược phẩm, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 84-110 Bộ Y Tế (2004), Thông tư hướng dẫn việc quản lý sản phẩm thực phẩm chức Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học & vi sinh vật, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr.5-58 Tiếng Anh Abenavoli L., Capasso R., et al (2010), "Milk thistle in liver diseases: past, present, future", Phytother Res, 24(10), pp 1423-1432 AbouZid S (2012), "Silymarin, Natural Flavonolignans from Milk Thistle", Phytochemicals - A Global Perspective of Their Role in Nutrition and Health, (12), pp 255-272 Amani N Shafik, Mostafa M Khodeir, et al (2011), "Improved antifibrotic effect of a combination of verapamil and silymarin in rat-induced liver fibrosis", Arab Journal of Gastroenterology, 12(3), pp 143-149 Biedermann D., Vavříková E., et al (2014), "Chemistry of silybin", Natural Product Reports, 31(9), pp 1077-1232 Boulos L (2000), Flora of Egypt, Hadara Publishing Inc., Cairo, Egypt, pp 10 Ding Tian-ming, Tian Shong-jiu, et al (2001), "Determination of active component in silymarin by RP-LC and LC/MS", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 26(1), pp 155-161 11 Enrica Bosisio, Cinzia Benelli, et al (1992), "Effect of the flavanolignans of Silybum marianum L On lipid peroxidation in rat liver microsomes and freshly isolated hepatocytes", Pharmacological Research, 25(2), pp 147165 12 Ferenci P., Dragosics B., et al (1989), "Randomized controlled trial of silymarin treatment in patients with cirrhosis of the liver", Journal of Hepatology, 9(1), pp 105-113 13 Fraschini F., Demartini G., et al (2002), "Pharmacology of silymarin", Clinical Drug Investigation 22(1), pp 51-65 14 Ghosh A., Ghosh T., et al (2010), "Silymarin – a review on the pharmacodynamics and bioavailability enhancement approaches", Journal of Pharmaceutical Science and Technology, Vol 2, pp 348–355 15 Kim S., Choi J.H., et al (2009), "Silibinin prevents TPA-induced MMP-9 expression and VEGF secrestion by inactivation of the Raf/MEK/ERK pathway in MCF-7 human breast cancer cells", Phytomedicine 16, pp 573580 16 Kroll D.J., Shaw H.S., et al (2007), "Milk thistle nomenclature: why it matters in cancer research and pharmacokinetic studies", Integr Cancer 6, pp 110-119 17 Kvasnička F., Bı́ba B., et al (2003), "Analysis of the active components of silymarin", Journal of Chromatography A, 990(1–2), pp 239-245 18 Lee D.Y., Liu Y (2003), "Molecular structure and stereochemistry of silybin A, silybin B, isosilybin A, and isosilybin B, Isolated from Silybum marianum (milk thistle)", J Nat Prod, 66(9), pp 1171-4 19 Liu Hong, Du Zhenxia, et al (2009), "A novel rapid method for simultaneous determination of eight active compounds in silymarin using a reversed-phase UPLC-UV detector", Journal of Chromatography B, 877(32), pp 4159-4163 20 Madaus Dr., Co (1976), Symposium on the pharmacodynamics of silymarin, Urban & Schwarzenberg, Cologne, German, pp 98-102 21 Mateen S., Tyagi A., et al (2010), "Silibinin inhibits human nonsmall cell lung cancer cell growth through cell-cycle arrest by modulating expression and function of key cell-cycle regulators", Molecular Carcinogenesis, 49(3), pp 247-258 22 Mayer K E., Myers R P., et al (2005), "Silymarin treatment of viral hepatitis: a systematic review", J Viral Hepat, 12(6), pp 559-67 23 Minakhmetov R A., Onuchak L A., et al (2001), "Analysis of Flavonoids in Silybum marianum Fruit by HPLC", Chemistry of Natural Compounds, 37(4), pp 318-321 24 Mira Lurdes, Silva Manuela, et al (1994), "Scavenging of reactive oxygen species by silibinin dihemisuccinate", Biochemical Pharmacology, 48(4), pp 753-759 25 Morazzoni P., Bombardelli E (1995), "Silybum marianum (Cardus marianum)", Fitoterapia, 66, pp 3-42 26 Morazzoni P., Montalbetti A., et al (1993), "Comparative pharmacokinetics of silipide and silymarin in rats", European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, 18, pp 289-297 27 Mudge E., Paley L., et al (2015), "Optimization and single-laboratory validation of a method for the determination of flavonolignans in milk thistle seeds by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection", Analytical and Bioanalytical Chemistry, 407(25), pp 7657-7666 28 Parveen R., Ahmad S., et al (2010), "Stability-indicating HPTLC method for quantitative estimation of silybin in bulk drug and pharmaceutical dosage form", Biomed Chromatogr, 24(6), pp 639-47 29 Pepping J (1999), "Milk thistle: Silybum marianum", American Journal of Health-System Pharmacy, 56, pp 1195-1197 30 PhD Shamama Javed, Kohli Kanchan, et al (2011), "Reassessing Bioavailability of Silymarin", Alternative Medicine Review, Vol 16(3), pp 239-249 31 Pilat L., Mihali C., et al (2011), "Pharmacology of silybum marianum and its active constituents Therapeutic activity - Part 1", Jurnal Medical Aradean, Vol.XIV(2), pp 25-33 32 Quaglia M.G., Bossu E., et al (1999), "Determination of silymarine in the extract from the dried silybum marianum fruits by high performance liquid chromatography and capillary electrophoresis", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 19(3/4), pp 435-442 33 Radjabian T (2008), "Analysis of silymarin components in the seed extracts of some milk thistle ecotypes from Iran by HPLC", Iranian Journal of Science and Technology (Sciences), 32(2), pp 141-146 34 Tamayo C., Diamond S (2007), "Review of clinical trials evaluating safety and efficacy of milk thistle (Silybum marianum [L.] Gaertn.)", Integrative Cancer Therapies, 6, pp 146-157 35 The Agricultural Research Service (2010), Functional Foods Research in ARS, pp 36 The United States Pharmacopeia (2012), "Powdered Milk Thistle Extract Monograph", United States Pharmacopeia, 35, pp 1387 37 Thomas W Flaig, Glode Michael, et al (2010), "A study of high-dose oral silybin-phytosome followed by prostatectomy in patients with localized prostate cancer", The Prostate, 70(8), pp 848-855 38 Tsai J.H., Liu J.Y., et al (2008), "Effects of silymarin on the resolution of liver fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats", J Viral Hepat, 15(7), pp 508-514 39 Wagner H., Horhammer L., et al (1968), "On the chemistry of silymarin (silybin), the active principle ofthe fruits from Silybum marianum (L.) Gaertn (Carduus marianus L.", Arzneimittel Forschung - Drug Research, 18, pp 688–696 40 Wen Z., Dumas T.E., et al (2008), "Pharmacokinetics and metabolic profile of free, conjugated, and total silymarin flavonolignans in human plasma after oral administration of milk thistle extract", Drug metabolism and disposition, 36, pp 65-72 41 World Health Organization (2002), "Fructus Silybi Marie", WHO Monographs on Selected Medicinal Plants, Vol 2, pp 300-322 [...]... đặt vấn đề nghiên cứu xác định hàm lượng Silymarin bằng phương pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn với hi vọng có thể đưa vào sử dụng trong công tác kiểm nghiệm - góp phần quản lý chất lượng các sản phẩm chứa Silymarin 24 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG & PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu phương pháp xác định hàm lượng của Silymarin. .. 2.2.3 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát xây dựng điều kiện chạy máy HPLC để phân tích silymarin - Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách chiết silymarin trong thực phẩm chức năng 26 - Đánh giá quy trình phân tích và xử lý mẫu - Áp dụng quy trình phân tích và xử lý mẫu với một số sản phẩm trên thị trường 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Khảo sát các điều kiện phân tích silymarin bằng HPLC Silymarin. .. khảo sát khả năng chiết silymarin từ nền mẫu bằng các loại các dung môi sau đây: methanol, ethanol Quy trình chiết silymarin cho đối tượng phân tích là thực phẩm chức năng dạng nang cứng và nang mềm dự kiến gồm các bước sau: - Xác định khối lượng trung bình viên, đồng nhất mẫu - Cân chính xác một lượng mẫu sau khi đồng nhất (cân khoảng 0,1-1g, tùy thuộc lượng silymarin công bố) vào ống ly tâm 50 mL -... tử Trong đó sắc ký phân bố được sử dụng nhiều nhất trong kiểm nghiệm do đó tôi xin trình bày kỹ về sắc ký phân bố 1.2.3 Các thông số đặc trưng trong HPLC [1], [2] 1.2.3.1 Hệ số phân bố K Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K: K= CS CM Trong đó: CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/lit) CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/lit) Hệ số. .. ở nhiệt độ phòng - Lọc, gạn lấy phần dịch, định mức 25 mL bằng cùng dung môi và lọc qua màng lọc 0,45 µm - Tiêm vào hệ sắc ký HPLC (pha loãng nếu cần) 2.3.3 Thẩm định quy trình Phương pháp xử lý mẫu và điều kiện phân tích silymarin bằng HPLC được thẩm định về các tiêu chí: Độ chọn lọc: - Chuẩn bị các mẫu sau: Mẫu trắng : mẫu thực phẩm chức năng không chứa Silymarin Mẫu chuẩn hỗn hợp Silybinin và Isosilybin... thông số, và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD 1.2.5 Ứng dụng phương pháp HPLC - Phân tích định tính: thường dựa vào thời gian lưu - Phân tích định lượng: có thể chia thành 4 bước : + Lấy mẫu thử + Tiến hành sắc ký + Đo tín hiệu detector + Phương pháp định lượng. .. các detector PDA có dải bước sóng trong khoảng 190 – 800 nm) sau khi đi qua tế bào đo được đưa đến một cách tử để phân thành các tia đơn sắc đi đến một mảng diod quang Mỗi diod quang đón nhận một phần dải bức xạ tương ứng với một khoảng bước sóng hẹp Như vậy, mỗi một diod có thể phát hiện một sự hấp thu ở một bước sóng nhất định Toàn bộ dãy diod được quét nhiều lần trong 1 giây bởi bộ phận vi xử lý... nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phần tử pha động) Thời gian lưu hiệu chỉnh: tR’ = tR – tM 1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’ Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lương giữa hai pha: k’ = K VS Q t t t'  S  R  R O V M QM t O tO Trong đó: VS : thể tích pha tĩnh (lít) VM: thể tích pha động (lít) QS: lượng. .. mass spectrometry) Do vậy, về mặt 16 ứng dụng thực tế, nếu nhắc tới HPLC thường người ta ám chỉ các kỹ thuật sử dụng detector không phải là khối phổ Trong nghiên cứu này, để quy trình xây dựng được có khả năng ứng dụng rộng, chúng tôi lựa chọn detector PDA, loại detector phổ biến trong cấu hình tiêu chuẩn của thiết bị HPLC hiện tại Về bản chất, đây là một detector UV-Vis cho phép đồng thời ghi nhận... phần đều được rửa giải và được phát hiện 1.3 Một số phương pháp phân tích silymarin Bảng 1.3 Một số phương pháp phân tích Silymarin STT 1 Phương pháp HPLC Mẫu phân tích Huyết tương Điều kiện phân tích - Cột C18 (250mm x 4,6 mm, 5 µm Điều kiện xử lý mẫu - Chiết pha rắn - Cân 0,1 g sản - Pha động: gồm A phẩm chiết và hòa (methanol) và B ( nước tan có chứa 0,1% trong axit methanol 10mL TLTK [19] 18 formic)