BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÚY AN CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA LÁ SA KÊ (Artocarpus communis J R Forster & G Forster) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÚY AN CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT VÀ THĂM DÒ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC CỦA LÁ SA KÊ (Artocarpus communis J R Forster & G Forster) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ 60720406 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thái An HÀ NỘI 2016 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực hồn thành luận văn này, tơi nhận nhiều quan tâm, động viên giúp đỡ tận tình từ thầy cơ, gia đình bạn bè Nhân dịp này, tơi xin bày tỏ kính trọng lòng biết ơn sâu sắc đến: PGS TS Nguyễn Thái An người thầy trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Đồng thời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu cho tơi đóng góp q báu đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Sinh thái & Tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam, Trung tâm Dược lýDược lâm sàng – Trường Đại học Y Hà Nội, Bộ môn Dược lực – Trường Đại học Dược Hà Nội hỗ trợ trình nghiên cứu Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phịng Đào tạo, tồn thể thầy cô giáo, cán Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện để tơi lĩnh hội kiến thức quý giá ngành Dược suốt năm qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè ln sát cánh, động viên tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày 31 tháng 03 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Thuý An MỤC LỤC Trang Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục hình Danh mục bảng ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Sa kê 1.1.1 Đặc điểm thực vật Sa kê 1.1.1.1 Tên gọi - Vị trí phân loại Sa kê 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật 1.1.1.3 Phân bố sinh thái 1.1.1.4 Bộ phận dùng 1.1.1.5 Đặc điểm vi học Sa kê 1.1.2 Thành phần hóa học Sa kê 1.1.3 Tác dụng dược lý 10 1.1.3.1 Tác dụng ức chế xanthin oxidase 10 1.1.3.2 Tác dụng chống oxy hóa 10 1.1.3.3 Tác dụng chống ung thư 10 1.1.3.4 Tác dụng chống xơ vữa động mạch 11 1.1.3.5 Tác dụng ức chế α-glucosidase 11 1.1.3.6 Tác dụng ức chế men chuyển angiotensin (ACE) 12 1.1.3.7 Tác dụng hạ huyết áp 12 1.1.3.8 Tác dụng cải thiện chức thận 13 1.1.3.9 Tác dụng kháng khuẩn 13 1.1.3.10 Tác dụng chống sốt rét 13 1.1.4 Độc tính Sa kê 13 1.1.5 Cơng dụng Sa kê 14 1.2 Tổng quan bệnh gút 15 1.2.1 Định nghĩa, phân loại 15 1.2.2 Nguyên nhân chế bệnh sinh 15 1.2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp acid uric 15 1.2.2.2 Cơ chế bệnh sinh gút theo y học đại 16 1.2.2.3 Nguyên nhân bệnh sinh theo y học cổ truyền 17 1.2.3 Thuốc điều trị 17 1.2.3.1 Theo y học đại 17 1.2.3.2 Theo y học cổ truyền 17 CHƯƠNG - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN 19 CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Phương tiện nghiên cứu 19 2.2.1 Hóa chất 19 2.2.2 Thiết bị 20 2.2.3 Động vật thí nghiệm 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 21 2.3.1 Chiết xuất, phân lập chất Sa kê 21 2.3.2 Thăm dò tác dụng hạ acid uric 22 2.3.2.1 Phương pháp đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết 22 mơ hình gây tăng acid uric cấp thực nghiệm 2.3.2.2 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in 24 vitro 2.3.4.3 Phương pháp xử lý số liê ̣u 25 CHƯƠNG - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 26 3.1 Chiết xuất, phân lập hợp chất 26 3.1.1 Chiết xuất 26 3.1.1.1 Lấy mẫu xác định độ ẩm dược liệu 26 3.1.1.2 Chiết xuất 26 3.1.2 Khảo sát sơ thành phần cắn phân đoạn ethylacetat 27 3.1.2.1 Định tính cắn ethylacetat phản ứng hóa học 27 3.1.2.2 Định tính cắn ethylacetat sắc kí lớp mỏng 31 3.1.3 Phân lập 32 3.1.3.1 Phân lập 32 3.1.3.2 Kiểm tra độ tinh khiết chất phân lập 34 3.1.4 Nhận dạng chất phân lập 36 3.1.4.1 Hợp chất AR1 36 3.1.4.2 Hợp chất AR2 39 3.1.4.3 Hợp chất AR3 42 3.2 Thăm dò tác dụng điều trị gút Sa kê 44 3.2.1 Chuẩn bị mẫu thử 44 3.2.2 Đánh giá khả hạ acid uric huyết mô hình gây 44 tăng cấp acid uric kalioxonat tiêm màng bụng 3.2.2.1 Thăm dò với mẫu thử liều thấp 44 3.2.2.2 Thăm dò với mẫu thử liều cao 45 3.2.3 Đánh giá khả ức chế enzym xanthin oxidase mẫu 46 thử CHƯƠNG - BÀN LUẬN 48 KẾT LUẬN 52 KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACE Angiotensin converting enzym AR Cắn toàn phần AR-C Cắn chloroform AR-E Cắn ethyl acetat AR-H Cắn n-hexan AR-W Cắn nước 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance C-NMR DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EC50 Half maximal Effective Concentration ESI-MS Eletrospray Ionization Mass Spectroscopy EtOAc Ethylacetat GF254 Gypsum fluorescent 254nm HGPRTase Hypoxanthin Guanin Phosphoribosyl Transferase HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR HSQC Hetoronuclear Single Quantum Coherence IC50 Half maximal Inhibitory Concentration KHV Kính hiển vi LDL Low Density Lipoprotein MIC Minimum Inhibitory Concentration MS Mass Spectroscopy OECD Organization for Economic Co-operation and Development PC50 Half maximal penetration concentration PRPP Phosphoribosyl pyrophosphate Rf Retardation Factor SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng TT Thuốc thử UV254nm Ultra Violet 254nm UV365nm Ultra Violet 365nm XO Xanthin oxidase DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các hợp chất flavonoid phân lập từ Sa kê Trang Bảng 2.1 Bố trí hỗn hợp phản ứng giếng 24 Bảng 3.1 Khối lượng cắn phân đoạn từ dịch chiết Methanol 28 Sa kê Bảng 3.2 Kết định tính cắn ethyl acetat phản ứng hóa 30 học Bảng 3.3 Kết SKLM AR1 với hệ dung môi 34 Bảng 3.4 Kết SKLM AR2 với hệ dung môi 35 Bảng 3.5 Kết SKLM AR3 với hệ dung môi 36 Bảng 3.6 Dữ liệu phổ NMR AR1 (1) 38 Bảng 3.7 Dữ liệu phổ NMR AR2 (2) 40 Bảng 3.8 Dữ liệu phổ NMR AR3 (3) 42 Bảng 3.9 Ảnh hưởng dịch chiết nước Sa kê lên nồng độ acid 44 uric máu chuột Bảng 3.10 Kết thử nghiệm với dịch chiết nước Sa kê liều cao 45 Bảng 3.11 Kết đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro cao 46 nước Bảng 3.12 Kết đánh giá tác dụng ức chế XO in vitro dịch chiết methanol Sa kê 47 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Ảnh vi phẫu Sa kê Hình 1.2 Ảnh số đặc điểm bột Sa kê Hình 1.3 Quá trình hình thành acid uric thể 14 Hình 2.1 Cây Sa kê quận Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh 19 Hình 2.2 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric máu 23 mơ hình gây tăng cấp kali oxonat Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin 25 oxidase Hình 3.1 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn từ Sa kê 27 Hình 3.2 Sắc ký đồ cắn ethylacetat khai triển với hệ I 32 điều kiện quan sát Hình 3.3 Sơ đồ phân lập hợp chất từ phân đoạn ethylacetat 33 Hình 3.4 Sắc kí đồ AR1 34 Hình 3.5 Sắc kí đồ AR2 35 Hình 3.6 Sắc kí đồ AR3 36 Hình 3.7 Ảnh tinh thể AR1 KHV vật kính 10 40 37 Hình 3.8 Cấu trúc hóa học hợp chất AR1 (1) 39 Hình 3.9 Sản phẩm AR2 phân lập 39 Hình 3.10 Cấu trúc hóa học hợp chất AR2 (2) 41 Hình 3.11 Sản phẩm AR3 phân lập 42 Hình 3.12 Cấu trúc hóa học hợp chất AR3 (3) 43 AD14−MeOD−C13CPD AR2−MeOD−C13CPD &DEPT DEPT90 210 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 210 C13CPD 210 AD14−MeOD−C13CPD AR2−MeOD−C13CPD &DEPT DEPT90 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 75 C13CPD 75 6.0 5.5 5.0 4.0 3.5 3.0 2.5 AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC 4.5 2.0 1.5 1.0 ppm 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 ppm 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC 2.0 1.2 1.0 ppm 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 190 195 200 205 210 ppm 5.5 5.0 4.0 AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC 4.5 3.5 ppm 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 ppm 2.6 2.4 2.2 1.8 1.6 1.4 AR2−MeOD−HMBC AD14−MeOD−HMBC 2.0 1.2 1.0 ppm 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 ppm 6.0 5.5 5.0 4.5 3.5 3.0 2.5 2.0 AR2−MeOD−HSQC AD14−MeOD−HSQC 4.0 1.5 1.0 ppm 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 ppm AR2−MeOD−HSQC AD14−MeOD−HSQC ppm 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm PHỤ LỤC KẾT QUẢ PHỔ CỦA CHẤT AR3 (MS, 1H-NMR, 13 C-NMR, DEPT) Print of window 80: MS Spectrum 243.0 MS Spectrum 100 Max: 53920 80 60 244.0 40 20 100 150 LCMS SQ 8/4/2014 4:52:53 PM SYSTEM 200 250 300 350 400 m/z Page of 0.968 2.175 3.369 3.336 3.333 3.330 3.326 3.323 7.377 7.361 6.932 6.931 6.919 6.915 6.780 6.776 6.764 6.760 6.747 6.743 6.266 6.262 6.258 4.894 4.854 AR3−MeOD−1H Current Data Parameters NAME 11K_AR3 EXPNO PROCNO F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140526 Time 19.33 INSTRUM spect PROBHD mm Multinucl PULPROG zg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 16 DS SWH 10000.000 Hz FIDRES 0.152588 Hz AQ 3.2769001 sec RG 161.3 DW 50.000 usec DE 6.00 usec TE 300.0 K D1 1.00000000 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 1H P1 8.50 usec PL1 −4.00 dB SFO1 500.1335009 MHz F2 − Processing parameters SI 32768 SF 500.1300011 MHz WDW EM SSB LB 0.30 Hz GB PC 1.00 0.634 10 1.105 2.127 2.087 1.047 1.002 11 ppm 49.625 49.510 49.337 49.283 49.168 48.999 48.826 48.657 48.488 113.262 103.974 103.552 102.196 98.488 123.067 121.983 159.949 157.261 156.842 156.158 AR3−MeOD−C13CPD Current Data Parameters NAME 11K_AR3 EXPNO PROCNO F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140529 Time 14.30 INSTRUM spect PROBHD mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 2048 DS SWH 31446.541 Hz FIDRES 0.479836 Hz AQ 1.0420883 sec RG 32768 DW 15.900 usec DE 6.00 usec TE 304.1 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 7.40 usec PL1 0.00 dB SFO1 125.7715724 MHz ======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 80.00 usec PL2 −4.00 dB PL12 15.47 dB PL13 22.00 dB SFO2 500.1320005 MHz F2 − Processing parameters SI 32768 SF 125.7576129 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.00 220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm 98.488 103.974 103.552 102.196 113.262 123.067 121.983 157.261 156.842 156.158 159.949 AR3−MeOD−C13CPD Current Data Parameters NAME 11K_AR3 EXPNO PROCNO F2 − Acquisition Parameters Date_ 20140529 Time 14.30 INSTRUM spect PROBHD mm Multinucl PULPROG zgpg30 TD 65536 SOLVENT MeOD NS 2048 DS SWH 31446.541 Hz FIDRES 0.479836 Hz AQ 1.0420883 sec RG 32768 DW 15.900 usec DE 6.00 usec TE 304.1 K D1 2.00000000 sec d11 0.03000000 sec DELTA 1.89999998 sec MCREST 0.00000000 sec MCWRK 0.01500000 sec ======== CHANNEL f1 ======== NUC1 13C P1 7.40 usec PL1 0.00 dB SFO1 125.7715724 MHz ======== CHANNEL f2 ======== CPDPRG2 waltz16 NUC2 1H PCPD2 80.00 usec PL2 −4.00 dB PL12 15.47 dB PL13 22.00 dB SFO2 500.1320005 MHz F2 − Processing parameters SI 32768 SF 125.7576129 MHz WDW EM SSB LB 1.00 Hz GB PC 1.00 160 155 150 145 140 135 130 125 120 115 110 105 100 ppm AR3−MeOD−C13CPD &DEPT DEPT90 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 180 170 C13CPD 180 170 AR3−MeOD−C13CPD &DEPT DEPT90 124 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 100 98 ppm 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 100 98 ppm 122 120 118 116 114 112 110 108 106 104 102 100 98 ppm DEPT135 CH&CH3 CH2 124 C13CPD 124