Đang tải... (xem toàn văn)
TÓM TẮT Các biến đổi di truyền trên các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm AH5N1 có thể làm thay đổi các đặc tính kháng nguyên, khả năng lây nhiễm, tính kháng thuốc, độc lực và khả năng gây bệnh của virus. Nghiên cứu này trình bày một phương pháp mới để khuếch đại và tách dòng trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm AH5N1. Mẫu RNA của virus cúm AH5N1 được sử dụng để khuếch đại trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M bằng kỹ thuật RTPCR (reverse transcription polymerase chain reaction) hai bước. Kỹ thuật được thực hiện với 3 cặp mồi đặc hiệu được thiết kế trên vùng 3’UTR và 5’UTR không mã hóa (UTR untranslated region) của các phân đoạn tương ứng. Sản phẩm khuếch đại được điện di kiểm tra và tinh sạch từ thạch agarose, sau đó được gắn với vector pJET1.2blunt để tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA của chủng virus AH5N1 nghiên cứu. Mười một mẫu bệnh phẩm virus AH5N1 thu thập từ gia cầm và người được tách RNA làm khuôn thử nghiệm để đánh giá độ tin cậy của phương pháp. Sau khi tối ưu hóa, kỹ thuật RTPCR đã được ứng dụng để khuếch đại các phân đoạn HA, NA và M từ 11 mẫu khuôn RNA của virus cúm AH5N1. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm khuếch đại của mỗi phân đoạn của hệ gen là một băng đơn nhất có thể quan sát rõ ràng trên thạch agarose. Sau khi tinh sạch, sản phẩm RTPCR được gắn vào vector pJET1.2blunt và chọn lọc tái tổ hợp. Kết quả giải trình tự cho thấy tất cả các trình tự nucleotide đã tách dòng có độ tương đồng cao với trình tự của phân đoạn tương ứng của virus AH5N1. Kỹ thuật khuếch đại và tách dòng trọn vẹn các phân đoạn HA, NA và M của virus cúm AH5N1 phân lập từ người và gia cầm đã được xây dựng thành công và có thể ứng dụng trong các nghiên cứu về virus cúm AH5N1 ở mức độ phân tử.
Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011 NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT THU NHẬN VÀ TÁCH DÒNG TRỌN VẸN CÁC PHÂN ðOẠN HA, NA VÀ M CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 Nguyễn Nam Thắng1, Phạm Ngọc Khái1, ðinh Duy Kháng2, Lương Xuân Hiến1 Trường ðại học Y Thái Bình Viện Công nghệ sinh học TÓM TẮT Các biến ñổi di truyền phân ñoạn HA, NA M virus cúm A/H5N1 làm thay ñổi ñặc tính kháng nguyên, khả lây nhiễm, tính kháng thuốc, ñộc lực khả gây bệnh virus Nghiên cứu trình bày phương pháp ñể khuếch ñại tách dòng trọn vẹn phân ñoạn HA, NA M virus cúm A/H5N1 Mẫu RNA virus cúm A/H5N1 ñược sử dụng ñể khuếch ñại trọn vẹn phân ñoạn HA, NA M kỹ thuật RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) hai bước Kỹ thuật ñược thực với cặp mồi ñặc hiệu ñược thiết kế vùng 3’UTR 5’UTR không dịch mã (UTR untranslated region) phân ñoạn tương ứng Sản phẩm khuếch ñại ñược ñiện di kiểm tra tinh từ thạch agarose, sau ñó ñược gắn với vector pJET1.2/blunt ñể tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA chủng virus A/H5N1 nghiên cứu Mười mẫu bệnh phẩm virus A/H5N1 thu thập từ gia cầm người ñược tách RNA làm khuôn thử nghiệm ñể ñánh giá ñộ tin cậy phương pháp Sau tối ưu hóa, kỹ thuật RTPCR ñã ñược ứng dụng ñể khuếch ñại phân ñoạn HA, NA M từ 11 mẫu khuôn RNA virus cúm A/H5N1 Kết ñiện di cho thấy sản phẩm khuếch ñại phân ñoạn hệ gen băng ñơn quan sát rõ ràng thạch agarose Sau tinh sạch, sản phẩm RT-PCR ñược gắn vào vector pJET1.2/blunt chọn lọc tái tổ hợp Kết giải trình tự cho thấy tất trình tự nucleotide ñã tách dòng có ñộ tương ñồng cao với trình tự phân ñoạn tương ứng virus A/H5N1 Kỹ thuật khuếch ñại tách dòng trọn vẹn phân ñoạn HA, NA M virus cúm A/H5N1 phân lập từ người gia cầm ñã ñược xây dựng thành công ứng dụng nghiên cứu virus cúm A/H5N1 mức ñộ phân tử Từ khóa: Cúm gia cầm, A/H5N1, HA, NA, M, RT-PCR, tách dòng ðẶT VẤN ðỀ Virus cúm A có hệ gen bao gồm phân ñoạn RNA ñơn âm, mã hóa 11 protein virus Do có hệ gen RNA tính chất phân ñoạn hệ gen, nên virus cúm A nói chung A/H5N1 nói riêng có tần suất ñột biến cao khả biến ñổi kháng nguyên nhanh chóng (Drake, 1993) Hiện tượng biến ñổi kháng nguyên virus cúm A/H5N1 hệ trình biến ñổi ñột biến ñiểm, tái tổ hợp di truyền trao ñổi vật liệu phân typ virus cúm A/H5N1 với (Baigent, McCauley, 2001; Bouvier, Palese, 2008) Sự biến ñổi di truyền nhanh chóng virus cúm A/H5N1 ñã gây khó khăn cho việc chẩn ñoán phát virus, lựa chọn chủng virus ñể sản xuất vaccine công tác phòng chống, kiểm soát bệnh cúm (Chen et al., 2006; Smith et al., 2006) Trong số phân ñoạn virus cúm A nói chung, phân ñoạn HA, NA M chịu trách nhiệm mã hóa cho protein mang tính kháng nguyên virus Các kháng nguyên ñích kháng thể tham gia ñáp ứng miễn dịch ñối với virus cúm A sở ñể nghiên cứu vaccine phòng cúm A cho người ñộng vật (Suarez, Schultz-Cherry, 2000; Wu et al., 2008) Các biến ñổi di truyền phân ñoạn hệ gen (ñặc biệt HA NA) làm thay ñổi ñặc tính kháng nguyên, khả lây nhiễm, tính kháng thuốc, ñộc lực khả gây bệnh virus (Bright et al., 2006; Neumann, Kawaoka, 2006; Yamada et al., 2006) Việc thu nhận phân ñoạn, tách dòng, lưu giữ nguồn gen chủng cúm A/H5N1 gây bệnh ñể làm nguồn nguyên liệu kiến tạo vaccine hệ cần thiết Trong nghiên cứu này, xây dựng phương pháp khuếch ñại tách dòng trọn vẹn phân ñoạn HA, NA M virus cúm A/H5N1 từ số chủng phân lập Việt Nam, nhằm tạo plasmid tái tổ hợp có chứa trình tự gen HA, NA M Các plasmid sử dụng ñể giải trình tự nhằm tìm hiểu biến ñổi di truyền virus cúm A/H5N1 lưu giữ bảo quản lâu dài ñể sử dụng nghiên cứu khác 425 Nguyễn Nam Thắng et al PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Tạo plasmid tái tổ hợp biến nạp vào tế bào khả biến E coli Thiết kế mồi DNA tinh từ thạch agarose ñược sử dụng ñể tạo plasmid tái tổ hợp với sinh phẩm CloneJET PCR Cloning kit (Fermentas) theo hướng dẫn nhà sản xuất, mô tả vắn tắt với bước sau: Sử dụng trình tự nucleotide phân ñoạn HA (H5), NA (N1) M virus cúm A/H5N1 ñã ñược công bố GenBank so sánh trình tự phần mềm Clustal X 2.0 Sau phân tích phần mềm BioEdit (version 7.0.9.0) FastPCR (version 5.4.19), cặp mồi ñược thiết kế vùng 3’ UTR vùng 5’ UTR phân ñoạn HA (H5), NA (N1) M Sử dụng tuýp 0,5 ml chuẩn bị thành phần phản ứng sau: 50 - 100 ng DNA, 10 µl 2X reaction buffer, µl DNA blunting enzyme bổ sung nước siêu cho ñủ 18 µl, vortex ly tâm nhanh từ - giây Khuôn RNA virus cúm A/H5N1 Ủ hỗn hợp phản ứng 70oC phút ðể xây dựng quy trình, sử dụng khuôn RNA virus cúm A/H5N1 ñược lưu giữ Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Sau hoàn thiện, quy trình khuếch ñại trọn vẹn phân ñoạn HA, NA M virus A/H5N1 ñược thử nghiệm với 11 mẫu khuôn RNA tách từ bệnh phẩm có nguồn gốc khác (5 mẫu từ vịt, mẫu từ gà mẫu từ người) Các mẫu RNA virus A/H5N1 gia cầm Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương cung cấp mẫu RNA H5N1 người Trung tâm Cúm Quốc gia - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Bổ sung µl pJET1.2/blunt cloning vector (50 ng/µl) µl T4 DNA ligase Tổng hợp cDNA (complementary DNA) Năm µl RNA tách chiết ñược sử dụng làm khuôn ñể thực phản ứng tổng hợp cDNA với sinh phẩm RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) theo hướng dẫn nhà sản xuất Phản ứng mã ngược ñược thực với mồi ñặc hiệu Uni12: 5’- AGCAAAAGCAGG -3’ (Hoffmann et al., 2001) Phản ứng khuếch ñại phân ñoạn HA, NA M kiểm tra Thực ñồng thời với hai hệ thống: PCR Master mix 2X (Fermentas) TripleMaster PCR System (Eppendorf) Phản ứng ñược thực ống 0,2 ml với tổng thể tích 50 µl sử dụng máy luân nhiệt Mastercycler gradient (Eppendorf) Sau xác ñịnh ñược ñiều kiện tối ưu, phản ứng khuếch ñại phân ñoạn HA, NA M virus A/H5N1 ñược thực với 11 mẫu cDNA chủng virus cúm A/H5N1 thu thập từ nguồn khác Sản phẩm PCR từ khuôn cDNA chủng ñược ñiện di thạch agarose 0,8%, sau ñó ñược phân lập tinh từ thạch với sinh phẩm QIAquick gel extraction kit (Qiagen) 426 Ủ hỗn hợp phản ứng 22oC phút Sử dụng 2,5 µl hỗn hợp phản ứng ñể biến nạp vào tế bào E coli TOP10 theo phương pháp hóa học nuôi cấy thạch LB (Luria-Bertani Broth), qua ñêm Lựa chọn khuẩn lạc, nuôi cấy tách chiết plasmid Tiến hành PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony PCR), với cặp mồi pJET1.2 forward pJET1.2 reverse ñể lựa chọn khuẩn lạc có plasmid tái tổ hợp chứa trình tự phân ñoạn HA, NA M Dùng ñầu côn lấy khuẩn lạc riêng rẽ hòa tan 20 µl hỗn hợp phản ứng gồm: µl 10X HighFidelity buffer, 0,4 µl dNTP (10 mM loại), 0,2 µl TripleMaster polymerase mix, pmol mồi pJET1.2 forward reverse loại Chương trình nhiệt phản ứng colony PCR giống phản ứng khuếch ñại gen Các khuẩn lạc dương tính ñược nuôi cấy ml môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin (100 µg/ml) qua ñêm, sau ñó plasmid ñược tách chiết với sinh phẩm GenJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) Giải trình tự phân tích kết ðể khẳng ñịnh plasmid tái tổ hợp có chứa trình tự gen HA, NA M virus H5N1, DNA tái tổ hợp ñược giải trình tự với sinh phẩm CEQ DTCS Quick Start Kit ñiện di mao quản hệ thống CEQ 8000 (Beckman Coulter) Phòng Thí nghiệm sinh học phân tử, Trường ðại học Y Thái Bình Sau phân tích phần mềm CEQ 8000 Genetic Analysis System, trình tự nucleotide ñược so sánh với trình tự gen có sẵn GenBank chương trình BLAST KẾT QUẢ Thiết kế mồi Sau phân tích trình tự phân ñoạn H5, N1 Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011 M virus cúm A ñã công bố GenBank phần mềm chuyên dụng, cặp mồi ñã ñược thiết kế vùng 3’ UTR vùng 5’ UTR ñể khuếch ñại trọn vẹn phân ñoạn tương ứng nói Trình tự mồi ñược trình bày bảng Phản ứng PCR Phản ứng PCR khuếch ñại phân ñoạn HA, NA M virus H5N1 ñược thử nghiệm ñồng thời với Mastermix 2X TripleMaster PCR System Kết thử nghiệm cho thấy hiệu khuếch ñại TripleMaster PCR System tốt so với PCR Mastermix 2X Do ñó TripleMaster PCR System ñược lựa chọn ñể khuếch ñại phân ñoạn HA, NA M virus H5N1 từ mẫu bệnh phẩm Sau thử nghiệm ñiều kiện khác nhau, thành phần phản ứng chương trình nhiệt tối ưu ñã ñược xác ñịnh Thành phần phản ứng bao gồm: µl 10X HighFidelity buffer, µl 10 mM dNTP (deoxyribonucleotide triphosphates), 0,5 µl TripleMaster Polymerase mix, mồi xuôi mồi ngược loại 30 pmol, µl cDNA bổ sung nước siêu cho ñủ thể tích 50 µl Chương trình nhiệt gồm bước: biến tính ban ñầu 94oC phút; 40 chu kỳ (94oC: 20 giây; 60oC: 20 giây; 72oC: phút 30 giây); giai ñoạn kéo dài chuỗi sau thực 72oC 10 phút Bảng Trình tự mồi ñược dùng ñể khuếch ñại gen HA, NA M virus H5N1 Tên mồi Trình tự 5’ - 3’ Vị trí Tm H5F-1 AGCRAAAGCAGGGGTHYAVTCT - 22 58.0 H5R-1776 AGTAGAAACAAGGGTGTTTTTAACTACAATCTGA 1776 - 1743 57.5 N1F-1 AGCRAAAGCAGGAGWTYAAAATGAATCCA - 29 58.7 N1R-1398 AGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGAAYMAAYTAC 1398 - 1367 55.2 MF-1 AGCRAAAGCAGGTAGATRTTGAAARATGA - 29 57.3 MR-1027 AGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTACTCCA 1027 - 1000 53.9 Ký hiệu: M=A/C; R=A/G; S=G/C; Y=C/T; K=G/T; V=A/G/C; H=A/C/T; D=A/G/T; B=C/G/T; N=A/G/C/T; Tm: Nhiệt ñộ nóng chảy mồi kb M NC PC 10 11 2,00 1776 bp 0,75 0,25 kb M NC PC 10 11 2,00 1398 bp 0,75 0,25 kb M NC PC 10 11 2,00 0,75 1027 bp 0,25 Hình Sản phẩm PCR khuếch ñại gen HA, NA M virus cúm H5N1 M: thang DNA chuẩn NC: mẫu chứng âm; PC: mẫu chứng dương; 1-5: mẫu thu thập vịt; 6-9: mẫu thu thập gà; 10 11: mẫu thu thập người 427 Nguyễn Nam Thắng et al Kết ñiện di sản phẩm thử nghiệm với 11 mẫu cDNA virus H5N1 thu thập từ gia cầm người ñược trình bày hình Kết cho thấy: phản ứng PCR với cặp mồi thiết kế ñã khuếch ñại thành công toàn phân ñoạn HA, NA M 11 mẫu cDNA Tạo plasmid tái tổ hợp chứa phân ñoạn gen HA, NA M Sau ñiện di thạch agarose, sản phẩm DNA ñược tinh từ thạch agarose ño mật ñộ quang (optical density - OD) bước sóng 260 nm ñể xác ñịnh nồng ñộ DNA DNA tinh ñược sử dụng ñể tạo plasmid tái tổ hợp với sinh phẩm ClonJETTM PCR cloning theo hướng dẫn nhà sản xuất Plasmid tái tổ hợp ñược biến nạp vào tế bào E coli TOP10 nuôi cấy thạch LB có ampicillin, 37oC, qua ñêm Plasmid pJET1.2/blunt có chứa gen kháng ampicillin nên tế bào E coli dung nạp plasmid có khả phát triển môi trường có bổ sung ampicillin Ngoài ra, plasmid chứa gen tổng hợp enzyme giới hạn eco47IR gây chết tế bào vi khuẩn Vị trí gắn với sản phẩm PCR nằm gen Vì vậy, chủng vi khuẩn phát triển ñược môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin ñều có plasmid tái tổ hợp Phản ứng colony PCR ñược thực ñể lựa chọn khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen mong muốn ðối với mẫu, tiến hành kiểm tra từ - khuẩn lạc ñể lựa chọn khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA cần tách dòng (Hình 2) Gen NA Gen HA Gen M Hình Sản phẩm colony PCR ñể lựa chọn khuẩn lạc có plasmid chứa trình tự gen HA, NA M virus cúm H5N1 Bảng ðộ tương ñồng cao (max identity) trình tự gen ñã tách dòng so sánh với trình tự gen virus cúm H5N1 GenBank chương trình BLAST ðộ tương ñồng (%) Mẫu Gen HA Gen NA Gen M 99 99 98 99 99 98 98 98 99 98 98 99 97 98 98 98 97 98 98 97 98 97 98 98 97 97 98 10 99 99 99 11 99 99 99 428 Các khuẩn lạc có kết colony PCR dương tính ñược nuôi cấy môi trường LB lỏng có bổ sung ampicillin, qua ñêm tách chiết DNA plasmid DNA tất mẫu plasmid ñều ñược giải trình tự so sánh với trình tự gen GenBank chương trình BLAST Kết so sánh cho thấy tất trình tự gen ñã tách dòng ñều có ñộ tương ñồng cao với trình tự gen tương ứng chủng virus H5N1 ñã công bố (Bảng 2) Hai mươi bảy trình tự nucleotide phân ñoạn gen HA, NA M chủng virus H5N1 thu thập từ gia cầm ñã ñược ñăng ký GenBank (các mã số ñăng ký từ CY095680 ñến CY095706) BÀN LUẬN Giải trình tự toàn hệ gen phương pháp tốt ñể hiểu rõ ñặc ñiểm di truyền virus H5N1, nhiên phương pháp tốn Tạp chí Công nghệ Sinh học 9(4): 425-430, 2011 phức tạp Do ñó hầu hết nghiên cứu thường tập trung vào một vài phân ñoạn RNA virus Virus cúm H5N1 có hệ gen gồm phân ñoạn RNA mã hóa cho 11 protein Ba phân ñoạn gen HA, NA M có vai trò quan trọng, quy ñịnh ñặc tính kháng nguyên, khả lây nhiễm, tính kháng thuốc, ñộc lực khả gây bệnh virus, ñó ñược nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu thấy trình tự gen ñã tách dòng có ñộ tương ñồng cao (trên 97% - bảng 2) với trình tự gen virus H5N1 chứng tỏ kỹ thuật khuếch ñại tách dòng phân ñoạn HA, NA M virus H5N1 ñã thu ñược phân ñoạn tương ứng Trình tự gen HA, NA M chủng virus thu thập gia cầm ñã ñược ñăng ký GenBank với mã số ñăng ký từ CY095680 ñến CY095706 Các trình tự mồi sử dụng nghiên cứu (bảng 1) ñược thiết kế sau phân tích trình tự gen virus cúm H5N1 ñã ñăng ký GenBank từ năm 2003 - 2010 Trình tự nucleotide vùng có tính bảo tồn cao, nhiên số vị trí có tượng ña hình Do ñó, hầu hết trình tự mồi ñược thiết kế dạng “degenerative primer” ñể làm tăng khả bắt cặp với cDNA chủng H5N1 khác Ngoài ra, trình tự mồi ñược thiết kế ñều có số lượng nucleotide lớn (22 - 34 nucleotide), nhiệt ñộ biến tính mồi tương ñối cao (54 - 58oC), ñảm bảo tính ñặc hiệu mồi, hạn chế sản phẩm phụ thực phản ứng PCR ðể phản ứng khuếch ñại gen có hiệu tốt nhất, ñã tiến hành thử nghiệm phản ứng ñiều kiện khác ñã xác ñịnh ñược chương trình nhiệt (nhiệt ñộ, thời gian gắn mồi; thời gian kéo dài chuỗi; số chu kỳ khuếch ñại) thành phần phản ứng (nồng ñộ dNTP; nồng ñộ mồi; nồng ñộ enzyme) tối ưu cho phản ứng Việc khuếch ñại tách dòng trọn vẹn phân ñoạn gen HA, NA M virus cúm H5N1 tiền ñề cung cấp nguyên liệu gen trình tự nucleotide cho nghiên cứu di truyền phân tử liên quan ñến ñặc tính kháng nguyên, tính kháng thuốc, khả lây nhiễm, ñộc lực, khả gây bệnh, tiến hóa nghiên cứu dịch tễ học phân tử virus ứng dụng lĩnh vực sản xuất vaccine, phát triển sinh phẩm chẩn ñoán dựa kỹ thuật miễn dịch Sau ñiện di tinh từ thạch agarose, DNA ñược gắn vào vector pJET1.2/blunt biến nạp vào tế bào E coli TOP10 Vector pJET1.2/blunt có hiệu biến nạp cao với tế bào E coli TOP10 sau nuôi cấy tế bào E coli tạo 300 700 Việc lựa chọn khuẩn lạc có chứa plasmid tái tổ hợp thực phản ứng colony PCR sử dụng enzyme giới hạn Các phân ñoạn gen virus H5N1 có kích thước lớn (trên 1000 bp) có ñộ biến ñổi cao nên dùng enzyme giới hạn số lượng sản phẩm phản ứng giới hạn thay ñổi tùy thuộc vào chủng virus (không có, có hay có nhiều vị trí giới hạn trình tự DNA), gây khó khăn cho việc phân tích Do ñó ñã áp dụng kỹ thuật colony PCR ñể lựa chọn khuẩn lạc có plasmid tái tổ hợp chứa trình tự gen cần tách dòng Dựa vào kết ñiện di sản phẩm phản ứng colony PCR (Hình 2) lựa chọn ñược khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp mong muốn cách dễ dàng Tất 33 trình tự gen ñã tách dòng ñều ñược xác ñịnh trình tự nucleotide hệ thống CEQ 8000 kiểm tra chương trình BLAST Kết cho KẾT LUẬN Kỹ thuật RT-PCR hai bước khuếch ñại trọn vẹn phân ñoạn HA, NA M virus cúm H5N1 với cặp mồi thiết kế vùng 3’ 5’ UTR ñã ñược xây dựng thành công Thử nghiệm kỹ thuật 11 mẫu RNA virus cúm H5N1 cho thấy tất phân ñoạn HA, NA M virus cúm H5N1 ñều ñược khuếch ñại trọn vẹn Tất phân ñoạn HA, NA M 11 mẫu virus cúm H5N1 thu thập từ gia cầm người ñều ñược gắn với vector pJET1.2/blunt, tạo plasmid tái tổ hợp chứa trình tự gen virus cúm H5N1 Lời cảm ơn: Nghiên cứu ñược thực với hỗ trợ kinh phí ñề tài hợp tác theo Nghị ñịnh thư Việt Nam Thái Lan “Hợp tác nghiên cứu ñặc ñiểm lưu hành biến ñổi gen virus cúm gia cầm H5N1 khu vực phía Bắc Việt Nam” Trường ðại học Y Thái Bình chủ trì Chúng xin ñược bày tỏ lòng biết ơn tới Tiến sĩ Nguyễn Văn Cảm - nguyên Giám ñốc Trung tâm Chẩn ñoán thú y Trung ương TS Lê Thị Quỳnh Mai - Giám ñốc Trung tâm Cúm Quốc gia ñã cung cấp mẫu RNA virus A/H5N1 TÀI LIỆU THAM KHẢO Baigent SJ, McCauley JW (2001) Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissueculture Virus Res 79(1-2): 177-185 Bouvier NM, Palese P (2008) The biology of influenza viruses Vaccine 26 Suppl 4: D49-53 429 Nguyễn Nam Thắng et al Bright RA, Shay DK, Shu B, Cox NJ, Klimov AI (2006) Adamantane resistance among influenza A viruses isolated early during the 2005-2006 influenza season in the United States JAMA 295(8): 891-894 Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, Rayner JM, Vijaykrishna D, Zhang JX, Zhang LJ, Guo CT, Cheung CL, Xu KM, Duan L, Huang K, Qin K, Leung YH, Wu WL, Lu HR, Chen Y, Xia NS, Naipospos TS, Yuen KY, Hassan SS, Bahri S, Nguyen TD, Webster RG, Peiris JS, Guan Y (2006) Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control Proc Natl Acad Sci USA 103: 2845-2850 Drake JW (1993) Rate of spontaneous mutation among RNA viruses Proc Natl Acad Sci USA 90(9): 4171-4175 Hoffmann E, Stech J, Guan Y, Webster RG, Perez DR (2001) Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses, Arch Virol 146: 2275-2289 Neumann G, Kawaoka Y (2006) Host range restriction and pathogenicity in the context of influenza pandemic Emerg Infect Dis 12: 881-886 Smith GJ, Fan XH, Wang J, Li KS, Qin K, Zhang JX, Vijaykrishna D, Cheung CL, Huang K, Rayner JM, Peiris JS, Chen H, Webster RG, Guan Y (2006) Emergence and predominance of an H5N1 influenza variant in China Proc Natl Acad Sci USA 103: 16936-16941 Suarez DL, Schultz-Cherry S (2000) Immunology of avian influenza virus: a review Dev Comp Immunol 24(2-3): 269-283 Wu WL, Chen Y, Wang P, Song W, Lau SY, Rayner JM, Smith GJ, Webster RG, Peiris JS, Lin T, Xia N, Guan Y and Chen H (2008) Antigenic profile of avian H5N1 viruses in Asia from 2002 to 2007 J Virol 82(4): 17981807 Yamada S, Suzuki Y, Suzuki T, Le MQ, Nidom CA, Sakai-Tagawa Y, Muramoto Y, Ito M, Kiso M, Horimoto T, Shinya K, Sawada T, Kiso M, Usui T, Murata T, Lin Y, Hay A, Haire LF, Stevens DJ, Russell RJ, Gamblin SJ, Skehel JJ, Kawaoka Y (2006) Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors Nature 444(7117): 378-382 DEVELOPMENT OF AMPLIFYING AND CLONING METHOD FOR FULL-LENGTH HA, NA AND M SEGMENTS OF INFLUENZA A/H5N1VIRUS Nguyen Nam Thang1, Pham Ngoc Khai1, Dinh Duy Khang2, Luong Xuan Hien1, ∗ Thaibinh Medical University Institute of Biotechnology SUMMARY Genetic variation in HA, NA and M segments of influenza A virus may alter antigenic characteristics, transmissibility, drug resistibility, virulence, and pathogenicity In this study, a novel method for amplifying and cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus is described RNA templates of influenza A/H5N1 virus were used for amplification of full-length HA, NA and M segments by two step RT-PCR method The method was carried out with specific primerpairs designed based on consensus sequences of the 3’ UTR and 5’ UTR by multiple aligment of each segment The DNA amplifications were examined by electrophoresis and eluted from agarose gel, then ligated with pJET1.2/blunt vector to generate recombinant plasmids RNA templates extracted from 11 isolates of H5N1 virus collected from poultry and humans were tested to evaluate the accuracy of the method After optimization, the RT-PCR method was used to amplify all HA, NA and M segments from RNA templates of 11 influenza H5N1 isolates Electrophoresis result showed that all amplifications of HA, NA and M segments were clearly visualized on agarose gel After gel-elution, the amplifications were inserted into pJET1.2/blunt vector Sequencing results indicated that all of the sequences from the clones have high nucleotide identity with the corresponding H5N1 sequences The method for amplifying and cloning full-length HA, NA and M segments of influenza A/H5N1 virus isolated from poultry and humans was successfully developed and could be applied for study of influenza H5N1 virus at the molecular level Keywords: A/H5N1, avian influenza, cloning, HA, NA, M segment, RT-PCR ∗ Author for correspondence: Tel: 84-913291360 ; E-mail: hienlx@tbmc.edu.vn 430