Đang tải... (xem toàn văn)
Trước khi nuôi cấy phải tiến hành nhuộm gram để đánh giá. Sau đó tiến hành nuôi cấy và xác định khuẩn lạc đặc trưng. Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 11,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 25 mm (do khả năng khử potassium tellurite (K2TeO3 )và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase của S.aureus) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và cs, 2002). Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do S.aureus có khả năng lên men mannitol, sinh acid sẽ làm đổi màu chất chỉ thị đỏ phenol trong môi trường Chapman từ đỏ sang vàng ) (Mary K. S. và cs, 2002).
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH VÀ ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS GVHD: TS.Trần Thị Ngọc Yên HVTT: Nhóm Nguyễn Hồng Phương Thảo Nguyễn Thị Bích Liên Nguyễn Thị Nhân Bằng Lưu Hồ Yến Ngọc MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH Hình 1: Khuẩn lạc đặc trưng S.aureus môi trường Bair-Paker Chapman Hình 2: Quy trình thử nghiệm sinh hóa để xác định Staphylococcus aureus Hình 3: S.aureus bắt màu gram dương quan sát kính hiển vi Hình 4: Kết thử nghiệm Oxidase dương tính âm tính9 Hình 5: Kết thử nghiệm Coagulase Hình 6: Vòng vô khuẩn thử nghiệm kháng sinh11 Hình 7: Đĩa giếng plastic sử dụng kĩ thuật ELISA DANH MỤC BẢNG Bảng 1: Các môi trường thường dùng để chọn lọc Staphylococcus aureus Bảng 2: Kháng sinh đồ Staphylococcus aureus ATCC 25923 Chương CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1.1.Đặc tính hình thái sinh hóa Staphylococcus aureus Hình thái: S aureus vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.5-1.5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động, không tạo bào tử Sinh hóa: • Gram ( +) • Catalase ( +) • Oxidase (-) • Enzyme Coagulase (+) • Thermonuclease (+) • DNAse (+) • Phosphatase (+) • Sử dụng: glucose (+), manitol (+), trehalose (+), sucrose (+) • Kháng polymycin B (+) • Nhạy vancomycin (+) • Có khả sinh trưởng môi trường chứa đến 15% muối NaCl 1.2.Các môi trường chọn lọc Staphylococcus aureus Có nhiều môi trường chọn lọc để phát Staphylococci, đặc biệt S.aureus Môi trường chọn lọc S.aureus sử dụng số hoá chất độc hại để tăng khả chọn lọc Thành phần môi trường gồm có NaCl, tellurite, lithium chloride nhiều kháng sinh khác Một số môi trường dùng để phân lập xác định mức nhiễm S.aureus >100 vi khuẩn/g thực phẩm : môi trường Staphylococcal 110, thạch Vogel-Johnson, thạch Egg yolk-sodium azide, thạch tellurite-polymixin-egg yolk Baird-Parker Bảng 1: Các môi trường thường dùng để chọn lọc Staphylococcus aureus STT Môi trường Tác nhân chọn lọc Tác nhân chẩn đoán Manitol Staphylococcus 110 Sodium chloride Gelatin Lithium chloride Manitol Vogel-Johson Potassium tellurite Tellurite Glycin Phenol red Lithium chloride Egg yolk Egg yolk-sodium azide Potassium tellurite Tellurite Polymixin B sulfate Baird-Parker Lithium chloride Potassium tellurite Egg yolk Tellurite Phần lớn môi trường chọn lọc thích hợp cho S.aureus bình thường, chưa bị tác động Tuy nhiên tác động trình chế biến, bảo quản, điều kiện bất lợi, vi khuẩn bị tác động đến ngưỡng gần chết việc tăng sinh S.aureus cần sử dụng môi trường Baird-Parker, môi trường thích hợp cho việc tăng sinh tế bào bị tổn thương 1.3 Các phương pháp truyền thống định danh Staphylococcus aureus 1.3.1 Phương pháp nuôi cấy Trước nuôi cấy phải tiến hành nhuộm gram để đánh giá Sau tiến hành nuôi cấy xác định khuẩn lạc đặc trưng Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng S aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm (do khả khử potassium tellurite (K 2TeO3 )và khả thủy phân lòng đỏ trứng lethinase S.aureus) (Rosamund M B cs, 1995; Mary K S cs, 2002) Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) hay gọi môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do S.aureus có khả lên men mannitol, sinh acid làm đổi màu chất thị đỏ phenol môi trường Chapman từ đỏ sang vàng ) (Mary K S cs, 2002) Hình 1: Khuẩn lạc đặc trưng S.aureus môi trường Bair-Paker Chapman 1.3.2 Phương pháp thử nghiệm sinh hóa Các bước thử nghiệm sinh hóa để xác định S.aureus sơ đồ hình Nhuộm Gram (+) (S) S.saprophyticus S.epidermidis Hình 2: Quy trình thử nghiệm sinh hóa để xác định Staphylococcus aureus • Bước 1: Quan sát hình thái vi khuẩn kính hiển vi, ta xác định vi khuẩn có dạng cầu khuần • Bước 2: Tiến hành nhuộm gram để phân biệt Staphylococci Streptococci Staphylococci bắt màu gram (+) có màu xanh tím quan sát kính hiển vi Hình 3: S.aureus bắt màu gram dương quan sát kính hiển vi • Bước 3: thử nghiệm Oxidase: phân biệt Staphylococcus (âm tính) với Micrococcus (dương tính) Phản ứng Oxidase dương tính có tượng đổi màu thuốc thử sang màu xanh tím, âm tính không đổi màu Hình 4: Kết thử nghiệm Oxidase dương tính âm tính • Bước 4: Thử nghiệm Coagulase: dùng để phân biệt tụ cầu vàng với tụ cầu khác Tụ cầu vàng S.aureus có enzyme coagulase nên gây đông huyết Những tụ khác coagulase không gây đông huyết tương Hình 5: Kết thử nghiệm Coagulase • Bước 5: thử nghiệm tính kháng kháng sinh polymycin B Đặt polymycin môi trường Mueller Hinton Agar (MHA): đo vòng vô khuẩn R