ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Nguyễn Duy Phương PHÂN LẬP VÀ NGHIÊN CỨU GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62420116 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Phạm Xuân Hội GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Hà Nội – 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận án công trình nghiên cứu thực cá nhân, thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Phạm Xuân Hội GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Các số liệu, kết luận án trung thực chưa tác giả công bố công trình khác Tôi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Phương LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội (Viện Di truyền Nông nghiệp), GS.TS Phan Tuấn Nghĩa (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) TS Narendra Tuteja (Trung tâm Kỹ thuật Di truyền Công nghệ sinh học Quốc tế, New Delhi, Ấn Độ) người thầy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập, thực hoàn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, (Trường ĐH KHTN) Ban lãnh Phòng Sau Đại học đạo Viện Di truyền Nông nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tất thủ tục cần thiết trình học tập thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô giáo Bộ môn Sinh lý thực vật - Hóa sinh (Khoa Sinh học, Trường ĐH KHTN) giảng dạy suốt khóa học tập thể cán nghiên cứu Bộ môn Bệnh học Phân tử (Viện DTNN), nhóm nghiên cứu TS Narendra Tuteja bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ, đóng góp ý kiến cho để hoàn thành luận án tốt nghiệp Tôi xin cảm ơn gia đình người thân bên cạnh tôi, quan tâm, cảm thông giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) cấp kinh phí nghiên cứu thông qua Đề tài mã số 106.06-2011.69 Trung tâm Kỹ thuật Di truyền Công nghệ Sinh học Quốc tế (Italy) hỗ trợ mặt tài khoa học thông qua Chương trình học bổng “Sandwich PhD Fellowship” Hà Nội ngày 20 tháng 02 năm 2016 Nguyễn Duy Phương MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 10 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 13 1.1 HẠN HÁN VÀ ĐẶC TÍNH CHỐNG CHỊU HẠN CỦA THỰC VẬT 13 1.1.1 Giới thiệu chung hạn hán 13 1.1.2 Ảnh hƣởng hạn hán đến sản xuất nông nghiệp 13 1.1.3 Ảnh hƣởng hạn hán thực vật 14 1.1.4 Đáp ứng thực vật với điều kiện hạn 16 1.1.5 Cơ sở phân tử đáp ứng chống chịu hạn thực vật 19 1.2 ĐIỀU HÒA HOẠT ĐỘNG GEN TRONG ĐIỀU KIỆN HẠN 25 1.2.1 Promoter cảm ứng với điều kiện hạn 25 1.2.2 Điều hòa hoạt động gen sau phiên mã 27 1.2.3 Điều hòa dịch mã 30 1.2.4 Phân vùng mRNA tế bào chất 30 1.2.5 Điều hòa sau dịch mã 31 1.2.6 Vai trò điều hòa hoạt động gen RNA không mã hóa 32 1.3 VAI TRÒ CỦA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ TRONG ĐÁP ỨNG HẠN 33 1.3.1 Nhân tố phiên mã AP2/ERF 35 1.3.2 Nhân tố phiên mã NAC 36 1.3.3 Nhân tố phiên mã WRKY 37 1.3.4 Một số nhân tố phiên mã khác 38 1.4 NGHIÊN CỨU NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA LÚA BẰNG CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN THỰC VẬT 40 1.4.1 Nghiên cứu chuyển gen vào lúa 40 1.4.2 Tình hình nghiên cứu tạo giống lúa chuyển gen chịu hạn 43 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1 VẬT LIỆU 47 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 47 2.1.2 Chủng vi sinh vật 47 2.1.3 Vector oligonucleotide 47 2.1.4 Hóa chất 49 2.1.5 Thiết bị 49 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49 2.2.1 Xử lý mẫu thực vật 49 2.2.2 Tách chiết, định lƣợng DNA/RNA 50 2.2.3 Nhân dòng gen OsNLI-IF vào vector pGEM-T 53 2.2.4 Thiết kế vector biểu gen OsNLI-IF 55 2.2.5 Sàng lọc gen từ thƣ viện cDNA 58 2.2.6 Tạo kháng thể đa dòng kháng protein OsNLI-IF tái tổ hợp 65 2.2.7 Tạo chuyển gen biểu OsNLI-IF 68 Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN C U & THẢO LUẬN 72 3.1 PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ Ở LÚA 72 3.1.1 Tổng hợp thƣ viện cDNA thứ cấp 72 3.1.2 Phân lập gen mã hoá nhân tố phiên mã kỹ thuật Y1H 73 3.1.3 Nhân dòng gen mã hóa protein OsNLI-IF 77 3.2 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM CHỨC NĂNG CỦA PROTEIN OsNLI-IF 80 3.2.1 Biểu gen OsNLI-IF điều kiện stress phi sinh học 80 3.2.2 Hoạt tính liên kết đặc hiệu với đoạn DNA đích OsNLI-IF 84 3.2.3 Hoạt tính hoạt hóa trình phiên mã OsNLI-IF 88 3.2.4 Nghiên cứu protein tƣơng tác với OsNLI-IF 93 3.3 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN OsNLI-IF 98 3.3.1 Thiết kế hệ vector biểu pCAMBIA1301 98 3.3.2 Thiết kế hệ vector biểu pBI101 103 3.4 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN OsNLI-IF TRONG CÂY CHUYỂN GEN 107 3.4.1 Biến nạp vector biểu vào A tumefaciens LBA4404 107 3.4.2 Nghiên cứu biểu OsNLI-IF thuốc 108 3.4.3 Nghiên cứu biểu OsNLI-IF lúa chuyển gen 121 KẾT LUẬN 132 KIẾN NGHỊ 133 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 134 TÀI LIỆU THAM KHẢO 135 PHỤ LỤC 147 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid 3-AT 3-Amino-1, 2, 4-triazole A thaliana Arabidopsis thaliana A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens ABA Abscisic acid ABRE Yếu tố đáp ứng acid abscisic chứa trình tự ACGT (ACGT-containing abscisic acid response element) AD (acting domain) AMP Adenosine monophosphate ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BAP 6-Benzylaminopurine BD (binding domain) BĐKH Biến đổi khí hậu bp Cặp bazơ (base pair) BSA Albumin huyết bò (Bovine serum albumin) CBB Coomassie Brilliant Blue cDNA DNA Ct Chu kỳ ngƣỡng (threshold cycle) dCTP Deoxycytidine triphosphate DEPC Diethylpyrocarbonate DMSO Dimethyl sulfoxide dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate DRE Yếu tố đáp ứng hạn (dehydration responsive element) DREB Protein liên kết với yếu tố đáp ứng hạn DRE ung (complementary deoxyribonucleic acid) (dehydration responsive element-binding protein) E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide HSP Protein sốc nhiệt (Heat shock protein) IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb Kilobase LB Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Luria-Bertani LEA Protein hình thành giai đoạn phát triển muộn phôi (late embryogenesis abundant) LiAc Lithium acetate đa điểm cắt (multiple cloning site) MCS MOPS Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic mRNA Messenger ribonucleic acid MS Môi trƣờng nuôi cấy thực vật Murashige & Skoog MS-R Môi trƣờng MS nuôi cấy lúa MS-T Môi trƣờng MS nuôi cấy thuốc NAA 1-naphthaleneacetic acid NAC NAM/ATAF1/2/CUC2 NACRS Trình tự nhận biết protein NAC (NAC recognition sequence) NLI-IF Nhân tố tƣơng tác với yếu tố tƣơng tác LIM nhân (nuclear LIM interactor-interacting factor) NST Nhiễm sắc thể OD Mật độ quang học (optical density) ORF Khung đọc mở (open reading frame) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) PEG Polyethylene glycol ROS Các RT-PCR Phản ứng nhân DNA ng (reactive oxygen species) (reverse transcription polymerase chain reaction) S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae SDM Môi trƣờng dinh dƣỡng tối thiểu (synthetic defined medium) SDS Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE Điện di gel polyacrylamide (SDS - Polyacrylamide gel electrophoresis) TAE Đệm Tris-acetate-EDTA TBE Đệm Tris-borate-EDTA TE Đệm Tris-EDTA TF Nhân tố phiên mã (transcription factor) Ti-plasmid Plasmid gây khối u (tumor inducing plasmid) -Trp/-Ura/Leu/-His/-Ade Môi trƣờng khuyết dƣỡng Triptophan/ Uracil/ Leucine/ Histidine/ Adenine X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Y1H Kỹ thuật lai phân tử tế bào nấm men dựa tƣơng tác DNA-protein (yeast one hybrid) Y2H Kỹ thuật lai phân tử tế bào nấm men dựa tƣơng tác protein-protein (yeast two hybrid) YEM Môi trƣờng nuôi cấy (yeast extract – manitol) YPD Môi trƣờng nuôi cấy nấm men destrose (yeast extract peptone dextrose) 60 Kim J.Y., Park S.J., Jang B., Jung C.H., Ahn S.J., Goh C.H., Cho K., Han O., Kang H (2007), “Functional characterization of a glycine-rich RNA-binding protein in Arabidopsis thaliana under abiotic stress conditions”, Plant J., 50(3), pp 439-451 61 Kizis D., Pagès M (2002), “Maize DRE-binding proteins DBF1 and DBF2 are involved in rab17 regulation through the drought-responsive element in an ABAdependent pathway”, Plant J., 30(6), pp 679-689 62 Ko J.H., Yan S.H., Han K.H (2006), “Upregulation of an Arabidopsis RING-H2 gene, XERICO, confers drought tolerance through increased abscisic acid biosynthesis”, Plant J., 47(3), pp 343-355 63 Ko M.K., Soh H., Kim K.M., Kim Y.S., Im K (2007), “Stable production of transgenic pepper plants mediated by Agrobacterium tumefaciens”, HortScience, 42(6), pp 1425-1430 64 Kobayashi F., Ishibashi M., Takumi S (2008), “Transcriptional activation of Cor/Lea genes and increase in abiotic stress tolerance through expression of a wheat DREB2 homolog in transgenic tobacco”, Transgen Res., 17(5), pp 755-767 65 Komarnytsky S., Borisjuk N (2003), “Functional analysis of promoter elements in plants”, Genet Eng (N Y), 25, pp 113-141 66 Laemmli V.K (1970), “Cleavage of structure protein during the assembly of the head of bacterophage T4”, Nature, 227(5259), 680-685 67 Lai Z., Li Y.,Wang F., Cheng Y., Fan B., Yu J.Q., Chen Z (2011), “Arabidopsis sigma factor binding proteins are activators of the WRKY33 transcription factor in plant defense”, Plant Cell, 23(10), pp 3824-3841 68 Lee B.H., Kapoor A., Zhu J., Zhu J.K (2006), “STABILIZED1, a stress-upregulated nuclear protein, is required for pre-mRNA splicing, mRNA turnover, and stress tolerance in Arabidopsis”, Plant Cell, 18(7), pp 1736-1749 69 Leister A.M., Lee J.G., Paarlberg P.P (2013), “Dynamic effects of drought on the U.S livestock sector”, Agricultural and Applied Economics Association Annual Meeting 2013, Washington, D.C 70 Li G., Nasar V., Yang Y., Li W., Liu B., Sun L., Li D., Song F (2011), “Arabidopsis poly(ADP-ribose) glycohydrolase is required for drought, osmotic and oxidative stress responses”, Plant Sci., 180(2), pp 283-291 71 Li J., Kinoshita T., Pandey S., Ng C.K., Gygi S.P., Shimazaki K., Assmann S.M (2002), “Modulation of an RNA-binding protein by abscisic-acid-activated protein kinase”, Nature, 418(6899), pp 793-797 140 72 Li X.P., Tian A.G., Luo G.Z., Gong Z.Z., Zhang J.S., Chen S.Y (2005), “Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses”, Theor Appl Genet., 110(8), pp 1355-1362 73 Lin R.C., Park H.J., Wang H.Y (2008), “Role of Arabidopsis RAP2.4 in regulating light- and ethylene-mediated developmental processes and drought stress tolerance”, Mol Plant., 1(1), pp 42-57 74 Lindemose S., O'Shea C., Jensen M.K., Skriver K (2013), “Structure, function and networks of transcription factors involved in abiotic stress responses”, Int J Mol Sci., 14(3), pp 5842-5878 75 Liu G., Li X., Jin S., Liu X., Zhu L., Nie Y., Zhang X (2014), “Overexpression of rice NAC gene SNAC1 improves drought and salt tolerance by enhancing root development and reducing transpiration rate in transgenic cotton”, PLoS ONE, 9(1), pp e86895, DOI: 10.1371/journal.pone.0086895 76 Liu H.H., Tian X., Li Y.J., Wu C.A., Zheng C.C (2008), “Microarray-based analysis of stress-regulated microRNAs in Arabidopsis thaliana”, RNA, 14(5), pp 836-843 77 Liu Q., Kasuga M., Sakuma Y., Abe H., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (1998), “Two transcription factors, DREB1 and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain separate two cellular signal transduction pathways in drought- and low-temperature-responsive gene expression, respectively, in Arabidopsis”, Plant Cell, 10(8), pp 1391-1406 78 Liu X., Yang L., Zhou X., Zhou M., Lu Y., Ma L., Ma H., Zhang Z (2013), “Transgenic wheat expressing Thinopyrum intermedium MYB transcription factor TiMYB2R-1 shows enhanced resistance to the take-all disease”, J Exp Bot., 64(8), pp 2243-2253 79 Lopato S., Bazanova N., Morran S., Milligan A.S., Shirley N., Langridge P (2006), “Isolation of plant transcription factors using a modified yeast one-hybrid system”, Plant Methods, 2, pp 3, DOI: 10.1186/1746-4811-2-3 80 Maruyama K., Sakuma Y., Kasuga M., Ito Y., Seki M., Goda H., Shimada Y., Yoshida S., Shinozak K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), “Identification of coldinducible downstream genes of the Arabidopsis DREB1A/CBF3 transcriptional factor using two microarray systems”, Plant J., 38(6), pp 982-993 81 Miao Y., Smykowski A., Zentgraf U (2008), “A novel upstream regulator of WRKY53 transcription during leaf senescence in Arabidopsis thaliana”, Plant Biol (Stuttg.), 10(s1), pp 110-120 141 82 Mizoi J., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2012), “AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses”, Biochim Biophys Acta, 1819(2), pp 86-96 83 Nakaminami K., Matsui A., Shinozaki K., Seki M (2012), “RNA regulation in plant abiotic stress responses”, Biochim Biophys Acta, 1819(2), pp 149-153 84 Nakashima K., Fujita Y., Katsura K., Maruyama K., Narusaka Y., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2006), “Transcriptional regulation of ABI3- and ABAresponsive genes including RD29B and RD29A in seeds, germinating embryos, and seedlings of Arabidopsis”, Plant Mol Biol., 60(1), pp 51-68 85 Nakashima K., Jan A., Todaka D., Maruyama K., Goto S., Shinozaki K., YamaguchiShinozaki K (2014), “Comparative functional analysis of six drought-responsive promoters in transgenic rice”, Planta, 239(1), pp 47-60 86 Nakashima K., Tran L.S., Van N.D., Fujita M., Maruyama K., Todaka D., Ito Y., Hayashi N., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2007), “Functional analysis of a NAC-type transcription factor OsNAC6 involved in abiotic and biotic stressresponsive gene expression in rice”, Plant J., 51(4), pp 617-630 87 Odell J.T., Nagy F., Chua N.H (1985), “Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter”, Nature, 313(6005), pp 810-812 88 Oh S.J., Kim Y.S., Kwon C.W., Park H.K., Jeong J.S., Kim J.K (2009), “Overexpression of the transcription factor AP37 in rice improves grain yield under drought conditions”, Plant Physiol., 150(3), pp 1368-1379 89 Ondřej M., Kocábek T., Rakouský S., Wiesnerová D (1999), “Segregation of TDNA inserts in the offspring of Arabidopsis thaliana after Agrobacterium transformation”, Biol Plant., 42(2), pp 185-195 90 Pandey G.K., Grant J.J., Cheong Y.H., Kim B.G., Li L., Luan S (2001), “ABR1, an APETALA2-domain transcription factor that functions as a repressor of ABA response in Arabidopsis”, Plant Physiol., 139(3), pp 1185-1193 91 Park S.H., Yi N., Kim Y.S., Jeong M.H., Bang S.W., Choi Y.D., Kim J.K (2010) “Analysis of five novel putative constitutive gene promoters in transgenic rice plants”, J Exp Bot., 61(9), pp 2459-2467 92 Phuong N.D., Hoi P.X (2015), “Isolation and characterization of a OsRap2.4A transcription factor and its expression in Arabidopsis for enhancing high salt and drought tolerance”, Curr Sci India, 108(1), pp 51-62 93 Puranik S., Sahu P.P., Srivastava P.S., Prasad M., (2012), “NAC proteins: regulation and role in stress tolerance”, Trends Plant Sci., 17(6), pp 369-381 142 94 Qin F., Sakuma Y., Li J., Liu Q., Li Y.Q., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), “Cloning and functional analysis of a novel DREB1/CBF transcription factor involved in cold-responsive gene expression in Zea mays L.”, Plant Cell Physiol., 45(8), pp 1042-1052 95 Qin Q.L., Liu J.G., Zhang Z., Peng R.H., Xiong A.S., Yao Q.H., Chen J.M (2007), “Isolation, optimization, and functional analysis of the cDNA encoding transcription factor RDREB1 in Oryza sativa L.”, Mol Breed., 19(4), pp 329-340 96 Rabbani M.A., Maruyama K., Abe H., Khan M.A., Katsura K., Ito Y., Yoshiwara K., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2003), “Monitoring expression profiles of rice (Oriza sativa L.) genes under cold, drought and high salinity stresses and ABA application using both cDNA microarray and RNA gel blot analyses”, Plant Physiol., 133(4), pp 1755-1767 97 Rachmat A., Nugroho S., Sukma D., Aswidinnoor H., Sudarsono S (2014), “Overexpression of OsNAC6 transcription factor from Indonesia rice cultivar enhances drought and salt tolerance”, Emir J Food Agric., 26(6), pp 519-527 98 Raczynska K.D., Simpson C.G., Ciesiolka A., Szewc L., Lewandowska D., McNicol J., Szweykowska-Kulinska Z., Brown J.W., Jarmolowski A (2010), “Involvement of the nuclear cap-binding protein complex in alternative splicing in Arabidopsis thaliana”, Nucleic Acids Res., 38(1), pp 265-278 99 Raghavendra A.S., Gonugunta V.K., Christmann A., Grill E (2010), “ABA perception and signalling”, Trends Plant Sci., 15(7), pp 395-401 100 Sahoo K.K., Tripathi A.K., Pareek A., Sopory S.K., Singla-Pareek S.L (2011), “An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars”, Plant Methods, 7(1), pp 49, DOI: 10.1186/1746-4811-7-49 101 Sakuma Y., Liu Q., Dubouzet J.G., Abe H., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2002), “DNA-binding specificity of the ERF/AP2 domain of Arabidopsis DREBs, transcription factors involved in dehydration- and cold-inducible gene expression”, Biochem Biophys Res Commun., 290(3), pp 998-1009 102 Sambrook J., Russel D.W (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York 103 Satow R., Chan T.C., Asashima M (2002), “Molecular cloning and characterization of dullard: a novel gene required for neural development”, Biochem Biophys Res Commun., 295(1), pp 85-91 143 104 Shen Y.G., Zhang W K., Yan D.Q., Du B.X., Zhang J.S., Liu Q., Chen S.Y (2003), Characterization of a DRE-binding transcription factor from a halophyte Atriplex hortensis”, Theor Appl Genet., 107(1), pp 155-161 105 Shinha K., Khanna-Chopra R., Aggarwal K., Chanturvedi G.S., Koundal K.R (1982), “Effects of drought on shoot growth Significance of metabolism to growth and yeild”, Drought Resistance in Crops, IRRI, Los Banos, Laguna, Philippines 106 Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (1996), “Molecular responses to drought and cold stress”, Curr Opin Biotechnol., 7(2), pp 161-167 107 Smith L.M., Sanders J.Z., Kaiser R.J., Hughes P., Dodd C., Connell C.R., Heiner C., Kent S.B., Hood L.E (1986) "Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis", Nature, 321(6071), pp 674-679 108 Sreenivasulu N., Harshavardhan V.T., Govind G., Seiler C., Kohli A (2012), “Contrapuntal role of ABA: does it mediate stress tolerance or plant growth retardation under long-term drought stress?”, Gene, 506(2), pp 265-273 109 Takasaki H., Maruyama K., Kidokoro S., Ito Y., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K., Nakashima K (2010), “The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice”, Mol Genet Genomics, 284(3), pp 173-183 110 Tie W., Zhou F., Wang L., Xie W., Chen H., Li X., Lin Y (2012), “Reasons for lower transformation efficiency in indica rice using Agrobacterium tumefaciensmediated transformation: lessons from transformation assays and genome-wide expression profiling”, Plant Mol Biol., 78(1-2), pp 1-18 111 Topfer R., Matzeit V., Gronenborn B., Schell J., Steinbiss H.H (1987), “A set of plant expression vectors for transcriptional and translational fusions”, Nucleic Acids Res., 15(14), pp 5890 112 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Osakabe Y., Qin F., Simpson S.D., Maruyama K., Fujita Y., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2006), “Co-expression of the stress-inducible zinc finger homeodomain ZFHD1 and NAC transcription factors enhances expression of the ERD1 gene in Arabidopsis”, Plant J., 49(1), pp 46-63 113 Tran L.S., Nakashima K., Sakuma Y., Simpson S.D., Fujita Y., Maruyama K., Fujita M., Seki M., Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K (2004), “Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive promoter”, Plant Cell, 16(9), pp 2481-2498 144 to dehydration stress 114 Vanjildorj E., Song H.J., Kim J.H., Lim Y.P (2010), “An establishment of Agrobacterium-mediated transformation to rapeseed (Brassica napus L cvs WH3 and WH10) and functional analysis of Arabidopsis transcription factor AtGRFs in growth and developmental alternations of transgenic rapeseed”, Plant & Animal Genome (PAG) XVIII Conference, January 9-13, 2010, Town & Country Convention Center in San Diego, California, USA 115 Verweire D., Verleyen K., De Buck S., Claeys M., Angenon G (2007), “Marker-free transgenic plants through genetically programmed auto-excision”, Plant Physiol., 145(4), pp.1220-1231 116 Vierstra R.D (1996), “Proteolysis in plant: mechanisms and functions”, Plant Mol Biol., 32(1-2), pp 275-302 117 Walley J.W., Kelley D.R., Nestorova G., Hirschberg D.L., Dehesh K (2010), “Arabidopsis deadenylases AtCAF1a and AtCAF1b play overlapping and distinct roles in mediating environmental stress responses”, Plant Physiol., 152(2), pp 866-875 118 Wang C., Deng P., Chen L., Wang X., Ma H., Hu W., Yao N., Feng Y., Chai R., Yang G., He G (2013), “A wheat WRKY transcription factor TaWRKY10 confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic Tobacco”, PLoS ONE, 8(6), pp e65120, DOI: 10.1371/journal.pone.0065120 119 Wang K (2006), Agrobacterium Protocols, 2nd ed., in Methods Mol Biol 343, Humana Press, Totowa, New Jersey, pp 409 120 Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L (2007), “Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions”, Theor Appl Genet., 115(1), pp 35-46 121 Xie Z., Zhang Z.L., Zou X., Huang J., Ruas P., Thompson D., Shen Q.J (2005), “Annotations and functional analyses of the rice WRKY gene superfamily reveal positive and negative regulators of abscisic acid signaling in aleurone cells”, Plant Physiol., 137(1), pp 176-189 122 Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K (1994), “A novel cis-acting element in an Arabidopsis gene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or highsalt stress”, Plant Cell, 6(2), pp 251-264 123 Yao Y., Ni Z., Peng H., Sun F., Xin M., Sunkar R., Zhu J.K., Sun Q (2010), “Noncoding small RNAs responsive to abiotic stress in wheat (Triticum aestivum L.)”, Funct Integr Genomics, 10(2), pp 187-190 124 Ye R., Huang H., Yang Z., Chen T., Liu L., Li X., Chen H., Lin Y (2009), “Development of insect-resistant transgenic rice with Cry1C*-free endosperm”, Pest Manag Sci., 65(9), pp 1015-1020 145 125 Ye X., Al-Babili S., Klöti A., Zhang J., Lucca P., Beyer P., Potrykus I (2000), “Engineering the pro-Vitamin A (beta-carotene) biosynthetic pathway into (carotenoid-free) rice endosperm”, Science, 287(5451), pp 303-305 126 Yi N., Kim Y.S., Jeong M.H., Oh S.J., Jeong J.S., Park S.H., Jung H., Choi Y.D., Kim J.K (2010), “Functional analysis of six drought-inducible promoters in transgenic rice plants throughout all stages of plant growth”, Planta, 232(3), pp 743-754 127 Yin H., Chen C.J., Yang J., Weston D.J., Chen J.G., Muchero W., Ye N., Tschaplinski T.J., Wullschleger S.D., Cheng M., Tuskan G.A., Yang X (2014), “Functional genomics of drought tolerance in bioenergy crops”, Crit Rev Plant Sci., 33(2-3), pp 205-224 128 Yokotani N., Ichikawa T., Kondou Y., Matsui M., Hirochika H., Iwabuchi M., Oda K (2009), “Tolerance to various environmental stresses conferred by the salt-responsive rice gene ONAC063 in transgenic Arabidopsis”, Planta, 229(5), pp 1065-1075 129 Zhang J., Addepalli B., Yun K.Y., Hunt A.G., Xu R., Rao S., Li Q.Q., Falcone D.L (2008), “A polyadenylation factor subunit implicated in regulating oxidative signaling in Arabidopsis thaliana”, PLoS ONE, 3(6), pp e2410, DOI: 10.1371/ journal pone.0002410 130 Zheng X., Chen B., Lu G., Han B (2009), “Overexpression of a NAC transcription factor enhances rice drought and salt tolerance”, Biochem Biophys Res Commun., 379(4), pp 985-989 131 Zhou L., Liu Y., Liu Z., Kong D., Duan M., Luo L (2010), “Genome-wide identification and analysis of drought-responsive microRNAs in Oryza sativa”, J Exp Bot., 61(15), pp 4157-4168 132 Zhou Q.Y., Tian A.G., Zou H.F., Xie Z.M., Lei G., Huang, J., Wang C.M., Wang H.W., Zhang J.S., Chen S.Y (2008), “Soybean WRKY-type transcription factor genes, GmWRKY13, GmWRKY21, and GmWRKY54, confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants”, Plant Biotechnol J., 6(5), pp 486-503 133 Zhu J., Shi H., Lee B.H., Damsz B., Cheng S., Stirm V., Zhu J.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A (2004), “An Arabidopsis homeodomain transcription factor gene, HOS9, mediates cold tolerance through a CBF-independent pathway”, Proc Natl Acad Sci USA, 101(26), pp 9873-9878 134 http://www.ers.usda.gov 135 http://www.fao.org 146 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sơ đồ vector sử dụng nghiên cứu 147 (A) (B) Phụ lục 2: Trình tự promoter JRC0332 JRC0528 Ghi chú: (A) Trình tự promoter JRC0332 (mã số AC090713.6) (B) Trình tự promoter JRC0528 (mã số AF254558.1) 148 Phụ lục 3: Kiểm tra vector pLacZi pHISi mang đoạn DNA đích PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR kiểm tra vector pLacZi pHISi mang đoạn DNA đích JRC0332 JRC0528 điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng 2: PCR với cặp mồi LAC-Fw/LAC-Rv; giếng 4: PCR với cặp mồi HIS-Fw/HIS-Rv; giếng 1: khuôn pLacZi/JRC0332; giếng 2: khuôn pLacZi/JRC0528; giếng 3: khuôn pHISi/JRC0528; giếng 4: khuôn pHISi/JRC0332 Phụ lục 4: Khảo sát mức độ biểu gen thị lacZ Ghi chú: (A) Tế bào nấm men cấy ria môi trường YPD (B) Đánh giá hoạt tính phân giải chất X-Gal β-galactosidase 60 phút Phụ lục 5: Khảo sát mức độ biểu gen thị HIS3 Ghi chú: (A) Môi trường YPD (B) Môi trường chọn lọc SD/-His có bổ sung 3-AT nồng độ 10 mM (C) Môi trường chọn lọc SD/-His có bổ sung 3-AT nồng độ 20 mM 149 Phụ lục 6: Sàng lọc khuẩn lạc dựa biểu gen HIS3 lacZ Ghi chú: (A) Môi trường SD/-Leu/-Ura/-His 3-AT; (B) môi trường SD/-Leu/Ura/-His có 3-AT 10 mM; (C) môi trường SD/-Leu/-Ura/-His có 3-AT 30 mM; (D) βgalactosidase phân giải chất X-Gal tạo màu xanh Phụ lục 7: Sàng lọc kích thƣớc dòng cDNA PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc điện di gel agarose 1% Giếng M: thang chuẩn DNA kb; giếng – 14 16 – 28: khuôn khuẩn lạc mang dòng cDNA; giếng 15: đối chứng âm (khuẩn lạc nấm men S cerevisiae nguyên bản) Phụ lục 8: Trình tự nucleotide gen OsNLI-IF (mã số NM_001050330.1) 150 Phụ lục 9: Trình tự acid amin protein OsNLI-IF (mã số NP_001043795.2) Phụ lục 10: Sàng lọc thƣ viện cDNA kỹ thuật Y2H Ghi chú: Thể biến nạp chọn lọc môi trường nuôi cấy khuyết dưỡng hoạt tính β-galactosidase (A) Môi trường SD/-Trp/-Ura/-His; (B) môi trường SD/-Trp/-Ura/-His/Ade; (C) β-galactosidase phân giải chất X-Gal tạo màu xanh Phụ lục 11: Sàng lọc thƣ viện cDNA PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc nấm men cặp mồi BD-Fw/BD-Rv điện di gel agarose 1% Giếng M: Thang chuẩn DNA kb; giếng – 19: khuôn khuẩn lạc nấm men S cerevisiae AH109 tái tổ hợp mang dòng cDNA 151 Phụ lục 12: PCR trực tiếp khuẩn lạc mang pBI-Lip9, pBI-Ubi pCAMBIA1301 Ghi chú: Sản phẩm PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens điện di gel agarose 1% Giếng – 6: PCR với cặp mồi Lip9-Fw/Nos-Rv; giếng 1: đối chứng dương (khuôn pBI-Lip9); giếng – 5: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pBI-Lip9; giếng 6: đối chứng âm (không có DNA khuôn) Giếng – 12: PCR với cặp mồi Ubi-Fw/Nos-Rv; giếng 7: đối chứng dương (khuôn pBI-Ubi); giếng – 11: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pBI-Ubi; giếng 12: đối chứng âm (không có DNA khuôn) Giếng 13 – 17: PCR với cặp mồi 35S-Fw/Nos-Rv; giếng 13: đối chứng dương (khuôn pCAMBIA1301); giếng 14 – 16: khuôn khuẩn lạc số – biến nạp pCAMBIA1301; giếng 17: đối chứng âm (không có DNA khuôn) Giếng M: thang chuẩn DNA kb Phụ lục 13: Cây thuốc chuyển gen nảy mầm môi trƣờng có Hygromycin Ghi chú: Hạt T1 dòng thuốc chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos (TL9) nảy mầm môi trường MS (A) MS có bổ sung Hygromycin 50 mg/l (B) Phụ lục 14: Kết sàng lọc dòng thuốc T1 PCR Ghi chú: Sản phẩm PCR thuốc chuyển gen T1 với cặp mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv điện di gel agarose 1%; giếng - 20: khuôn mẫu DNA tách chiết từ 20 thuốc T1 chuyển cấu trúc 35S:OsNLI-IF:Nos, giếng 21: khuôn mẫu DNA tách chiết từ dòng thuốc T1 chuyển cấu trúc pCAMBIA1301; giếng 22: khuôn mẫu DNA tách chiết từ thuốc không chuyển gen; giếng M: thang chuẩn DNA kb 152 Phụ lục 15: Biểu protein tái tổ hợp OsNLI-IF tế bào E coli Rosetta Ghi chú: (A) Kết điện di dịch chiết tế bào gel SDS-PAGE 12% (B) Kết lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể anti – His-tag pha loãng 1:50.000 Giếng M: thang chuẩn protein; giếng – 3: pha lỏng dịch chiết tế bào; giếng – 6: pha cặn dịch chiết tế bào; giếng 4: đối chứng âm (không cảm ứng IPTG); giếng 5: cảm ứng IPTG 0,1 mM giờ; giếng 6: cảm ứng IPTG 0,1 mM Phụ lục 16: Kiểm tra protein tái tổ hợp OsNLI-IF qua xử lý Thrombin Ghi chú: (A) Kết điện di protein tinh gel SDS-PAGE 12% (B) Kết lai thẩm tách miễn dịch sử dụng kháng thể anti – His-tag pha loãng 1:50.000 Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: OsNLI-IF dung hợp tinh sạch; giếng 2: OsNLI-IF tinh xử lý Thrombin tinh lại hệ thống cột Ni-NTA mắc nối tiếp Heparin-Sepharose Phụ lục 17: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch kháng huyết kỹ thuật lai thẩm tách miễn dịch Ghi chú: (A) Kháng huyết trước gây miễn dịch (pha loãng 1:10000) (B) Kháng huyết sau gây miễn dịch (pha loãng 1:10.000) Giếng M: thang chuẩn protein; giếng 1: dịch chiết tế bào E coli; giếng 2: OsNLI-IF tái tổ hợp tinh 153 Phụ lục 18: PCR kiểm tra số dòng lúa tái sinh T0 Ghi chú: Sản phẩm PCR chuyển gen với cặp mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv điện di gel agarose 1% (A) Giếng 1: đối chứng âm (khuôn DNA tách chiết từ lúa dại); giếng – 10: khuôn mẫu DNA tách chiết từ dòng lúa chuyển cấu trúc Lip9:OsNLIIF:Nos; giếng 11: đối chứng dương (khuôn pBI-Lip9/OsNLI-IF) (B) Giếng 1: đối chứng dương (khuôn pBI-Ubi/OsNLI-IF); giếng – 10: khuôn DNA dòng lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF:Nos; giếng 11: đối chứng âm (khuôn DNA tách chiết từ lúa dại) Giếng M: thang chuẩn DNA kb Phụ lục 19: PCR kiểm tra số dòng lúa tái sinh T1 Ghi chú: Sản phẩm PCR chuyển gen T1 điện di gel agarose 1% (A) PCR với cặp mồi Actin-Fw/Actin-Rv; giếng 1: đối chứng âm (khuôn H2O); giếng 2: khuôn DNA tách chiết từ lúa dại; giếng – 14: khuôn mẫu DNA tách chiết từ lúa T1 chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF:Nos (B) PCR với cặp mồi NLI-t-Fw/Nos-Rv; giếng 1: đối chứng âm (khuôn DNA tách chiết từ lúa dại); giếng – 15: khuôn mẫu DNA tách chiết từ lúa chuyển cấu trúc Ubi:OsNLI-IF:Nos; giếng 16: đối chứng dương (khuôn pBI-Ubi/OsNLI 154